Summary
Primeras funciones de endosome dependen de polimerización de la actina F. Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de Bioquímica y genética manipulaciones.
Abstract
Muchas funciones endosome temprano, especialmente carga proteínas clasificación y membrana deformación, dependen de los parches de cortos filamentos F-actina nucleadas en la membrana endosomal. Hemos establecido un ensayo basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de genética y bioquímica manipulaciones. Endosomal fracciones se preparan por flotación en gradientes de sacarosa de las células que expresan la proteína endosomal temprana RAB5 GFP. Fracciones citosólicas se preparan en cantidades separadas de las células. Endosomal y fracciones citosólicas pueden almacenarse congeladas en nitrógeno líquido, si es necesario. En el ensayo, las fracciones citosólicas y endosomal se mezclan, y la mezcla se incuba a 37 ° C en condiciones adecuadas (p. ej., fuerza iónica, reducir el medio ambiente). En el momento deseado, la mezcla de reacción se fija, y la F-actina se revela con phalloidin. Polimerización y la nucleación de la actinia se analizan por microscopía de fluorescencia. Aquí, Divulgamos que este ensayo puede utilizarse para investigar el papel de los factores que intervienen en la nucleación de la actina en la membrana, o en la posterior elongación, ramificación o entrecruzamiento de filamentos de actina F.
Introduction
En células eucariotas superiores, las proteínas y los lípidos se internalizan en endosomas tempranos donde se produce la separación. Algunas proteínas y lípidos, que están destinados a ser reutilizados, se incorporado en las regiones tubulares de los endosomas tempranos y entonces transportados a la membrana plasmática o a la trans-Golgi network (TGN)1,2. Por el contrario, otras proteínas y lípidos se empaquetan selectivamente en regiones de los endosomas tempranos que presentan un aspecto multivesicular. Amplían estas regiones y, sobre la separación de membranas endosomal temprana, finalmente madura en endosomal libre portador vesículas o cuerpos multivesicular (VCE/MVBs), que son responsables de transporte de carga hacia finales de endosomas1, 2.
Actinia desempeña un papel crucial en el proceso de remodelación de la membrana asociado a capacidad clasificación endosomal y biogénesis del endosome. Clasificación a lo largo de las vías de reciclado a la membrana plasmática o al TGN de la proteína depende el retrómero complejo y las proteínas asociadas. Esta maquinaria de clasificación parece estar acoplado a la formación de las reciclaje túbulos a través de interacciones del retrómero complejo, con la avispa y cicatriz homólogo (colada) actina complejo y ramificado3,4,5 . Por el contrario, destinado para la degradación de moléculas, particularmente activación receptores de señalización, se clasifican en vesículas intraluminales (ILVs) por endosomal clasificación complejos necesarios para transporte (TRASVESTIS)2,6, 7. Aunque no se conoce el posible papel de la actina en el proceso de clasificación de TRASVESTIS-dependiente, F-actina desempeña un papel importante en la biogénesis de la versión cefálica externa/MVBs y en el transporte más allá de endosomas tempranos. En particular, hemos encontrado que anexina A2 une regiones enriquecidas con colesterol de principios endosome y junto con spire1, nuclea la polimerización de la actina F. La formación de la red de actina ramificada en endosomas requiere la actividad de ramificación de la proteína relacionada con la actina (ARP) 2/3 complejo, así como el ERM proteína moesina y la Unión de la actina proteína cortactina8,9.
Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo. Este análisis se ha utilizado previamente para investigar el papel de la anexina A2 en nucleación de F-actina y moesina y cortactina en la formación de endosomal actina redes8,9. Con este protocolo en vitro , la compleja serie de reacciones que se producen en endosomas durante la polimerización de la actina se convierten en susceptible al análisis bioquímico y molecular de los pasos secuenciales del proceso, incluyendo la nucleación de la actinia, lineal polimerización, ramificación y reticulación.
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Protocol
1. soluciones y preparaciones
Nota: todas las soluciones y buffers deben ser preparadas en agua destilada doble (dd) H 2 O. Porque varía el estado de hidratación de la sucrosa, la concentración final de todas las soluciones de sacarosa se determinará mediante un refractómetro.
Solución salina tamponada con fosfato- Prepare sin cationes divalentes (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 y 6,5 mM de Na 2 HPO 4. Ajustar el pH a 7.4. Esterilizar en autoclave (1 ciclo a 121 ° C durante 15 min) y almacenar a temperatura ambiente.
- Prepare solución de imidazol de 300 mM: 0,204 g de imidazol en 10 mL de ddH 2 O.Adjust el pH a 7,4 a 4 ° C con HCl. filtro esterilizar utilizando un 0.22 μm filtro de tamaño de poro y almacenar a 4 ° C.
- Prepare homogeneización buffer (HB; preparar aproximadamente 100 mL): sacarosa 250 mM de imidazol de 3 mM. Ajustar el pH a 7,4 a 4 ° C utilizando un medidor de pH. Filtro-esterilizar utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C. complemento la HB antes de usar con un cóctel de inhibidores de la proteasa en concentraciones finales correspondiente a leupeptin 10 mM, 1 mM pepstatin A y 10 ng/mL aprotinina.
- Para los gradientes de flotación de paso, preparar el 62%, 39% y 35% sacarosa soluciones de imidazol de 3 mM, pH 7,4, como se describe a continuación. Precisamente determinar la concentración final de todas las soluciones de sacarosa utilizando un refractómetro de.
- Preparar 100 mL de la solución de sacarosa % 62 imidazol de 3 mM, pH 7,4. Disolver agitando 80,4 g de sacarosa en ddH 2 O pre-calentado a 35 ° C. Agregue 1 mL de solución stock de 300 mM imidazol y llenar hasta 100 mL con ddH 2 O. Ajuste el pH a 7,4 a 4 ° C. filtro esterilizar utilizando un 0,22 μm filtro de tamaño de poro y tienda a 4 ° C.
- Preparar 100 mL de solución 35% sacarosa imidazol de 3 mM, pH 7,4. Disolver agitando 40,6 g de sacarosa en ddH 2 O. Añadir 1 mL de solución stock de 300 mM imidazol y completar a 100 mL con ddH 2 O. ajustar el pH a 7,4 a 4 ° C. filtro esterilizar utilizando un 0.22 μm filtro de tamaño de poro y almacenar a 4 ° C.
- Preparar 50 mL de sacarosa al 39% de imidazol de 3 mM, pH 7,4. Diluir la solución de sacarosa de 62% con la solución de sacarosa de 35%. Almacenar a 4 ° C.
- 3 g del paraformaldehido (PFA) se disuelven por agitación en 100 mL de PBS-pre warmed a 60 ° C mientras que la adición de 1 M NaOH gota a gota, ajustar el pH final de 7.4 con NaOH. Filtro-esterilizar utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a -20 ° C.
PRECAUCIÓN: 3% PFA es un reactivo tóxico. - Solución madre de preparar 1 M KCl. 3,73 g de KCl se disuelven por agitación en 50 mL de ddH 2 O. filtro esterilizar utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar 50 X concentrado solución madre que contiene 0,625 M Hepes pH 7.0 y 75 mm MgOAc 2 Dec 2 O. alícuota y tienda a -20 ° C.
- Preparar medio de montaje. Mezclar revolviendo 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) con 6 g de glicerol. Añadir 6 mL de ddH 2 O y dejar durante al menos 2 h a temperatura ambiente. Agregar 12 mL de 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5) y calor aproximadamente de 53 ° C con agitación ocasional hasta que se disuelva el PVA.
- Clarificar la solución por centrifugación a 5.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante y añadir 2,5% (w/v) 1, 4 - Diazabiciclo-[2.2.2] octano (DABCO) para prevenir el fotoblanqueo durante la detección de fluorescencia. Vortex para cerca de 30 s para disolver. Alícuotas en tubos de plástico de 1,5 mL y conservar a -20 ° C.
2. Cultura de la célula
- cultura HeLa células Dulbecco ' s Modified Eagle suplementado con suero fetal de 10%, 10% no esenciales aminoácidos, 10% L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina. Mantener a 37 ° C en un incubador de 5% CO 2.
- Transfectar las células 24 h antes del experimento con GFP RAB5 10, utilizando el reactivo de transfección comerciales según el fabricante ' instrucciones s.
- Cuando sea necesario, preparar fracciones endosomal y citosol de las células agotadas de una proteína de interés (es decir, utilizando RNAi o CRISPR/Cas9) o overexpressing forma wildtype o mutante de la proteína de interés.
3. Endosomal fracción preparación
Nota: este protocolo describe la sencilla preparación de fracciones subcelulares que contienen endosomas y otras membranas de luz. Si es necesario, fracciones endosome purificada también pueden ser usado 11. Preparar 2 platos de Petri (10 cm de diámetro exterior; 57 cm 2) de las células confluentes que expresan GFP RAB5 como material de partida. El número total de células de HeLa confluentes en placas 2 Petri corresponde aproximadamente a 2.5 x 10 7 células. Cuando sea necesario, los endosomas también pueden prepararse de las células agotadas de una proteína de interés (es decir, utilizando RNAi o CRISPR/Cas9) o overexpressing forma wildtype o mutante de la proteína de interés, siempre expresando GFP RAB5.
PRECAUCIÓN: todos los pasos del Protocolo de fraccionamiento deben realizarse en hielo.
- Colocar las cajas Petri sobre una placa de metal mojada en un cubo de hielo plano y lavar inmediatamente las células dos veces con 5 mL de PBS helada-.
- Quitar todos los PBS - desde el último lavado y añadir 3 mL de PBS-helada por plato. Células no deben secarse durante la manipulación: si es necesario, coloque el cubo de hielo en una plataforma oscilante para cubrir adecuadamente las células con líquido de.
- Eliminar mecánicamente las células en PBS de los platos de Petri con un policía de goma flexible (es decir, raspador de celular caseros). Raspar las células de los platos primero en un rápido movimiento circular alrededor del exterior del plato, seguido de un movimiento hacia abajo en el centro del plato. Raspe suavemente para obtener " hojas de " de las células adjuntas. Transferir suavemente las células usando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura amplia para un tubo de polipropileno de 15 mL cónico en hielo.
- Centrifugar durante 5 min a 175 x g a 4 ° C.
- Suavemente Quite el sobrenadante (SN) y añadir 1-3 mL de HB a la pelotilla. Utilizando una pipeta Pasteur de plástico con una abertura amplia, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo una vez para resuspender las células.
- Centrífuga para 7-10 min a 1.355 x g y 4 ° C. suavemente Quite el SN.
- Realizar homogeneización celular.
Nota: Las condiciones deben ser suaves para que las membranas del plasma de las células se rompen, pero los endosomas permanecen intactos.- Agregar un volumen conocido de HB con inhibidores de la proteasa en cada pellet celular (aproximadamente 100 μL por pellets celulares). Usando una micropipeta de 1.000 μl, suavemente pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que las células son suspendidas. No introducir burbujas de aire.
- Preparar una jeringa de tuberculina de 1 mL con una aguja de 22G, previamente enjuagada con HB y libre de aire o burbujas.
- Llene la jeringa con la suspensión de células relativamente lentamente (para evitar la creación de burbujas de aire), coloque la punta biselada de la aguja contra la pared del tubo y expulsar de la suspensión de células rápidamente al corte de las membranas del plasma de las células adjuntas.
- Tomar una pequeña alícuota de homogeneizado (aproximadamente 3 μL) y diluir en 50 μl de HB en un portaobjetos de vidrio. Mezclar y cubrir con un cubreobjetos de vidrio. Inspeccione el homogeneizado bajo un microscopio de contraste de fase, equipado con un 20 X o 40 X objetivo.
Nota: En condiciones óptimas, la mayoría de las células se rompen, pero no son núcleos, que aparecen como gris oscuro y alrededor de estructuras, ( figura 1). - Repita el paso 3.7.3 y 3.7.4 hasta la mayoría de las células se rompen, generalmente, son necesarias 3-6 golpes arriba y abajo a través de la aguja. Mantener una pequeña alícuota (10-30 μL) de homogeneizado para determinación de proteínas.
- Homogeneizado de centrifugadora durante 7 min a 1.355 x g y 4 ° C.
Nota: después de la centrifugación, el sedimento (definido como el pellet nuclear; NP) contiene los núcleos y el sobrenadante (definido como el sobrenadante postnuclear; PNS) contiene el citosol y los organelos lanzados sobre homogeneización y en suspensión libre. - Recoger cuidadosamente el PNS. Mantenga pequeñas alícuotas (10-30 μL) de la PNS y NP para determinación de proteínas y deseche el NP.
- Ajustar el PNS a 40.6% sacarosa diluyendo la solución de sacarosa de 62% con PNS usando una relación de 1:1.1 de PNS:62% de sacarosa. Mezclar suavemente pero a fondo, sin crear burbujas de aire. Compruebe la concentración de sacarosa utilizando el refractómetro.
- Colocar el PNS en 40,6% de sacarosa en la parte inferior de un tubo de ultracentrifugación. Recubierto con 2,5 mL de la solución de sacarosa de 35% y la llena el tubo de centrífuga con HB.
Nota: Las soluciones de sacarosa deben ser en capas para que las interfaces son claramente visibles. - Ultracentrífuga los gradientes por 1 h a ̴165, 000 x g y 4 ° C.
- Retire cuidadosamente la capa blanca de lípidos en la parte superior del gradiente. A continuación, recoger la interfaz que contiene endosomas, entre la HB y el 35% de sacarosa, utilizando una micropipeta de 200 μL con una punta cortada.
Nota: Las fracciones endosomal puede ser utilizadas directamente en el ensayo de polimerización en vitro la actinia o puede ser alícuotas en hielo, flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a -80 ° C. - Determinar la concentración de proteína de las fracciones PNS y endosomal.
Nota: Esta concentración debe ser al menos 100 μg/mL. Aproximadamente 2.5 x 10 células 7 en 2 placas de Petri son necesarios para obtener un PNS con al menos 100 μg/mL (véase la nota anterior).
4. Preparación del citosol
Nota: preparar 2 placas de Petri (10 cm de diámetro; 57 cm 2) de confluentes células HeLa como material de partida. Cuando sea necesario, también pueden prepararse el citosol de las células agotadas de una proteína de interés (es decir, utilizando RNAi o CRISPR/Cas9) o overexpressing un tipo salvaje o una forma mutante de la proteína de interés. En cuanto al Protocolo de fraccionamiento del endosome, todas las medidas deben realizarse en hielo.
- Repita los pasos 3.1-3.8.
- Colocar el PNS en un tubo de centrífuga y ultracentrífuga durante 45 minutos a ̴250, 000 x g y 4 ° C.
- Con cuidado quitar la capa blanca en la parte superior y recoger el SN (fracción citosol) sin perturbar el pellet del microsoma. Mantener una alícuota de la fracción para determinación de proteínas de citosol.
Nota: El citosol puede ser utilizado directamente en el ensayo de polimerización en vitro la actinia o puede ser alícuotas en hielo, flash-congeladas en nitrógeno líquido y almacenados a -80 ° C. - Determinar la concentración de proteína de cytosol.
Nota: Debe ser por lo menos 3 mg/mL.
5. Análisis medición Endosome-dependiente de la polimerización de la actina In Vitro
Nota: polimerización de la actina Endosome-dependiente se puede realizar mediante dos enfoques alternativos. En primera aproximación, los materiales son mezclados en un tubo de ensayo, fijo y transferidos a un cubreobjetos y analizados. En el segundo enfoque, descrito aquí, el ensayo puede llevarse a cabo directamente en la cámara de proyección de imagen puede fijo y analizado sin perturbación mecánica ( figura 2). En este segundo enfoque, la mezcla de ensayo no se transfiere de un tubo de ensayo a un cubreobjetos y así permanece imperturbable, disminuyendo el peligro de las redes de la F-actina físicamente ser perturbado durante la transferencia. Además, este segundo enfoque es compatible con un time-lapse análisis de la polimerización de la actina F. Cabe señalar que no hay diferencia en el análisis de la polimerización de la actina F se observó con cualquiera de los dos enfoque.
Nota: Uso corte de puntas en el protocolo de.
- En un tubo de ensayo
- suavemente mezcla helada purificada GFP RAB5 endosomas (paso 3) con el citosol (paso 4) en una proporción de 1:10 (la concentración de proteína) en un tubo de ensayo cónico helado de 1,5 mL.
Nota: Un experimento típico se lleva a cabo con aproximadamente 40-50 μl. - Ajustar la mezcla de reacción fría a concentraciones finales de 125 mM KCl (con la solución madre de KCl de 1 M), 12,5 mM Hepes y 1,5 mM de MgOAc 2 (con el 50 x solución madre). Luego, ajustar la mezcla con inhibidores de la proteasa a concentraciones finales de leupeptin 10 mM y 1 mM pepstatin A 10 ng/mL aprotinina. Mezclar suavemente todos los componentes de.
- Colocar el tubo de ensayo que contiene la mezcla de reacción a 37 ° C, sin agitación e incubar durante el tiempo deseado.
Nota: Por lo general, tardará aproximadamente 3 minutos para detectar la polimerización de la actina en endosomas y 30 min para la formación de una extensa red. - En el tiempo deseado (es decir, 3 minutos o 30 minutos), detener la reacción colocando el tubo en hielo y añadir 1/10 (vol:vol) de la solución PFA 3% preenfriada.
- Añadir 0.3:10 (vol:vol) de 200 phalloidin unidades/mL (~6.6 μM) conjugado con el tinte rojo-naranja que mancha la actina polimerizada.
- Lugar 12 μL de la mezcla en 12 μL de medio de montaje de PVA en un portaobjetos de vidrio. Poner una tapa de coverslipon de vidrio 18 x 18 mm 2.
- Analizar la muestra con microscopía confocal.
- suavemente mezcla helada purificada GFP RAB5 endosomas (paso 3) con el citosol (paso 4) en una proporción de 1:10 (la concentración de proteína) en un tubo de ensayo cónico helado de 1,5 mL.
- En la sala de proyección de imagen
- para hacer cámaras de proyección de imagen microscópicas, use plasma durante 1 min para limpiar un cubreobjetos redondo de 18 mm de diámetro y un diámetro de 35 mm redonda de Petri equipado con fondo de vidrio 20 mm (0.16-0.19 mm).
- Incubar las superficies limpiadas con 1% de β-caseína por 20 min minimizar la Unión a proteínas del cristal. Lave dos veces con imidazol de 3 mM.
- Agregar endosome citosol, en el mismo ensayo mezcla como en los pasos 5.1.1 y 5.1.2, al tubo de ensayo preenfriada 1,5 mL y complementar la mezcla de ensayo con 0,1 μg/μL rodamina-actinia.
- Ajustar el índice de refracción final de la mezcla a 1.375 (26,5% de sacarosa) con 39% sacarosa solución.
Nota: Por lo general, se agrega el mismo volumen; sin embargo, esto tiene que ser ajustado empíricamente vuelva a depender de la concentración de sacarosa de la fracción recogida, determinada con un refractómetro ya que la concentración de sacarosa puede cambiar ligeramente de un experimento a experimento. - Coloque la mezcla en el plato pretratado de 35 mm (paso 5.2.1) y cubrir con el cubreobjetos de 18 mm pretratado (paso 5.2.1).
- Coloque la cámara a 37 ° C, sin agitar.
- Analizar la muestra mediante microscopía confocal de fluorescencia.
6. CA de la imagenquisition y análisis de la red de actina
- adquisición de la imagen
- adquirir las imágenes en un microscopio confocal invertido.
Nota: Ajustes de adquisición de imagen fueron optimizados para un invertido microscopio confocal con un objetivo de aceite de 63 X 1.25 NA. Ajustar la potencia del láser para lograr una buena relación señal a ruido (generalmente alrededor del 50%).
- adquirir las imágenes en un microscopio confocal invertido.
- Cuantificación de la red de actina
- analizar las imágenes fluorescentes. Utilice el software de código abierto CellProfiler (v2.1.1) 12 para medir la cantidad de actina por endosome (se puede utilizar software alternativo).
- En primer lugar, identificar los endosomas como objeto primario utilizando la señal GFP RAB5. Luego, cuantificar la F-actina asociada a endosomas individuales mediante la propagación de la señal de la actina (rojo-naranja tinte conjugado Phalloidin) como un objeto secundario.
- Promedio y normalizar la cantidad de material asociado para cada objeto a la condición control.
- analizar las imágenes fluorescentes. Utilice el software de código abierto CellProfiler (v2.1.1) 12 para medir la cantidad de actina por endosome (se puede utilizar software alternativo).
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Representative Results
Para ganar penetraciones en la formación de parches de la F-actina en membranas endosome temprano, seguimos el protocolo que se indica en la figura 2. Brevemente, las células fueron transfectadas con GFP RAB5 y luego endosomas tempranos fueron elaboradas por fraccionamiento subcelular. Estos endosomas tempranos purificadas se incubaron con cytosol para actina así como otros factores posiblemente involucrados en la reacción. Al final de la incubación, la reacción se detuvo por la fijación de la mezcla. Una muestra fue recogida y depositada en un portaobjetos de microscopio. Por último, F-actina se reveló con phalloidin (Figura 3A). La nucleación de la F-actina en membranas endosomal temprana así como el proceso de polimerización posterior ocurrió rápidamente. De hecho, F-actina ya podría ser visualizada en endosomas en 1min después del inicio de la reacción (Figura 3A). Estas estructuras de actina, que eran inicialmente cortas, rápidamente llegó a ser más largas, ramificadas y vinculados entre sí, conduciendo a la formación de una red entretejida de filamentos de actina (Figura 3A), probablemente reflejando dinámica desequilibrada actina in vitro. Se observaron tasas similares de nucleación y polimerización cuando el ensayo se llevó a cabo con actina marcados con rodamina purificada además de cytosol de la célula. Esto se hizo en platos con fondo de cristal para que las estructuras podrían ser reflejadas directamente, en ausencia de cualquier perturbación (figura 3B). En el análisis aquí descrito, endosomas tempranos nuclear de polimerización de la actina de novo selectivamente. De hecho, polimerización de la actina no ocurrió cuando se llevó a cabo la reacción en vitro en ausencia de endosomas o citosol. Por lo tanto puede concluirse que los endosomas tempranos poseen la capacidad fundamental para apoyar la nucleación y posterior polimerización de actina filamentos9,11.
Para analizar la cantidad de actina polimerizada de endosomas, imágenes obtenidas en diferentes épocas se analizaron CellProfiler (Figura 4A). Como la zona de la actina que rodean un endosome temprano solo se mide la cantidad de actina polimerizada por endosome. La tasa de polimerización de actina fue mayor al principio del proceso y disminuyó con el tiempo (Figura 4B). La red de actina podría analizarse con más detalle en momentos tempranos después del inicio de la reacción. En estos primeros momentos, estructuras individuales que contienen actina podría todavía ser diferenciarse unos de otros. Para evaluar la compleja organización de redes de actina, se contó el número de filamentos de actina que emana de cada endosome (es decir, filamentos primarios). Asimismo, se contó el número de filamentos de actina originan filamentos primarios (es decir, filamentos secundarios), así como el número de los otros filamentos de actina que podrían ser identificados en las redes y que no se origina desde los endosomas ( es decir, otros filamentos) (figura 4-E. Una vez que se trazaron los filamentos de actina, otros parámetros, tales como longitud de los filamentos de actina individual y el número de endosomas conectado a los filamentos de actina mismo, podría ser fácilmente calculados (figura 4F).
Figura 1: micrografía de contraste de un homogeneizado de células HeLa de la fase. Después de la homogeneización, el extracto fue montado entre un microscopio portaobjetos y un cubreobjetos. Para publicación, imágenes fueron capturados con el objetivo 100 X después de la inmersión de aceite. Para inspección de rutina, sin embargo, el extracto celular se visualizó un 20 X o un objetivo de X 40 sin inmersión aceite. Se muestran dos ejemplos de alta magnificación vistas el homogeneizado (A-B). Núcleos (estrellas) aparecen como estructuras redondas oscuras color gris, sin restos de adjunto de la celular. Las flechas señalan los característicos gránulos de diferente tamaño, forma y transparencia, que se lanzan sobre la homogeneización de la célula y corresponden a materiales intracelulares (por ejemplo, los organelos). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: representación esquemática del protocolo. Descripción esquemática de los protocolos utilizados para preparar los extractos endosomal (A) y el citosol extractos (B) y para controlar la polimerización de la actina de endosomas en vitro (C). Sobrenadante (SN), buffer de homogeneización (HB), sobrenadante postnuclear (PNS), pellet nuclear (NP) y paraformaldehido (PFA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Nucleación y polimerización de la F-actina en endosomas tempranos In Vitro. (A) endosomas purificados de Hela células expresando GFP-Rab5 (verde) y HeLa citosol se prepararon por separado. En el ensayo, endosomas tempranos (EEs) se mezclaron con el citosol, y se incubó la mezcla para el indicado veces. La mezcla fue fijo, marcada con phalloidin (rojo) etiqueta de F-actina y analizada por microscopía confocal de fluorescencia. Bares: 10 μm (panel superior) y 5 (panel inferior). (B) EEs purificados de Hela células expresando GFP-Rab5 (verde) y HeLa citosol se prepararon por separado. Estos extractos de células se incubaron con rodamina-actina purificada (rojo) para el indicado momento en cámaras de microscopio y se analizaron por microscopia confocal. Barra de escala = 10 μm. (C) el experimento se realizó como en A. Citosol de HeLa (sin EEE) y HeLa endosomas (verde) etiquetado con GFP Rab5 (sin citosol) se incubaron por separado (paneles izquierdos y mediados) o juntos (panel derecho) por 30 min, fijo, marcado con phalloidin (rojo) etiqueta de F-actina y analizadas por microscopía confocal de fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de la red de actina. (A) flujo de trabajo de análisis de CellProfiler. (B) número de actina polimerizada se cuantificaron con respecto al número de endosomas mediante el software CellProfiler. Los datos son la media ± SEM (n = 3). Datos son medios ± s.d. (n = 3). 5 min y 15 min (ns P= 0.0736), a 5 minutos y 30 minutos (* P = 0.0195) y 15 min y 30 min (ns P = 0.3129). (C)Endosomas tempranos (EEs) purificados de células Hela expresando GFP Rab5 y HeLa citosol se prepararon por separado, y el ensayo se llevó a cabo como en la figura 2A. Las muestras se fijaban después de 7 minutos. El panel central muestra la micrografía de la misma, con el traslapo de las huellas de las estructuras de la F-actina dibujadas usando el plugin de NeuronJ13 del software ImageJ. El panel derecho muestra los rastros solamente. Barra de escala = 10 μm. (D) representación de la F-actina estructura secuencia de numeración utilizado en la cuantificación con el software ImageJ. (E) la cuantificación del número de filamentos de actina, como se define en C-D. Datos son medios ± s.d. (n = 3). Ramas primarias frente a ramas secundarias (ns P = 0.5262), ramas secundarias frente a otras ramas (ns P = 0.6815) y ramas primarios versus otras ramas (ns P = 0.2254). Las estructuras (F) la longitud de la F-actina y el número de EEs por estructura de la actina se muestran como ejemplos de otros parámetros que pueden analizarse con la cuantificación definida en C-D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Actinia desempeña un papel crucial en el endosome membrana dinámica4,14. Hemos divulgado previamente que la polimerización y la nucleación de actina ocurren en endosomas tempranos, formando pequeños parches de F-actina o redes. Estas redes de F-actina son absolutamente necesarias para el transporte de membrana más allá de endosomas tempranos a lo largo de la vía de degradación. Interferir en cualquier paso de este proceso de nucleación y polimerización previene endosome maduración y transporte de aguas abajo hacia fines endosomas andlysosomes9,11,15. En particular, se utilizó el ensayo descrito anteriormente para analizar los pasos secuenciales de la polimerización de la actina F en endosomas tempranos y caracterizar el proceso a nivel molecular.
En estos experimentos, endosomas tempranos son etiquetados con GFP RAB5 en vivo, purificadas por fraccionamiento subcelular e incubados en un tubo de ensayo en presencia de cytosol para permitir la polimerización de actina F en vitro. En el momento deseado, la reacción se detiene y la mezcla de reacción se transfiere a un portaobjetos microscópicos para el análisis por microscopia de fluorescencia, usando phalloidin etiquetar la F-actina. Usando esta estrategia experimental, mostramos que es necesaria para la nucleación de la F-actina en endosomas tempranos, junto con SPIRE1, anexina A2, mientras que ARP2/3 media F-actina ramificación, como era de esperar. También nos demostró que se requiere para la formación de las redes de F-actina que median la biogénesis VCE/MVB y maduración a lo largo de la vía de degradación de las células mamíferas9,11moesina y cortactina.
Es importante tener en cuenta que, aunque bajos niveles de RAB5 ectopically expresado no alteren endosomas a cualquier grado significativo10, esta pequeña GTPasa es un regulador clave de temprano endosome membrana dinámica16,17 . En algunos experimentos, por lo tanto puede ser apropiado etiqueta endosomas en el ensayo utilizando protocolos alternativos. Por ejemplo, endosomas tempranos pueden ser convenientemente etiquetados con trazadores fluorescentes endocytosed, como epidérmico del factor de crecimiento o transferrina4,14.
Cabe señalar que es técnicamente difícil de filamentos de actina individual de imagen con microscopía confocal convencional. Por lo tanto, nos referimos a las estructuras de la F-actina en todo el texto para describir redes de actina en endosomas. En consecuencia, consideramos que la formación de una red de F-actina se puede cuantificar con mayor precisión mediante la medición de la superficie de la fluorescencia de las redes en lugar de su intensidad.
No es fácil de descartar totalmente la posibilidad de que la actividad de nucleación de actina observado en vitro es mediada por algún otro tipo de estructura u orgánulo que queda obligado a RAB5 endosomas durante la purificación. Sin embargo, la contaminación es muy poco probable. Mientras que algunos organelos Co purifican en gradientes debido a propiedades físicas similares, no suelen permanecer cuantitativamente enlazados entre sí después de la purificación. Por otra parte, la actividad de nucleación de actina estrictamente depende de anexina A24,14, que está presente en endosomas tempranos que contiene RAB514. Por último, encontramos que las estructuras de la F-actina se asocian selectivamente RAB5 endosomas en vivo y no se encuentran en otros endosomas o en otras membranas celulares4,14. En conclusión, actividad de nucleación de actina es más probable asociados con endosomas RAB5, ya que esta actividad co purifica y co se localiza con endosomas RAB5.
En este ensayo, tanto como en otros ensayos que reconstituir las reacciones bioquímicas complejas que controlan que la dinámica de endosomas16 u otras membranas18 y que se llevan a cabo en un tubo de ensayo, es importante garantizar que la preparación de los extractos celulares son óptimos. Las células deben homogeneizadas en condiciones suaves para limitar los daños a endosomas y otros organelos, especialmente los núcleos y lisosomas. También, endosome fracciones deben conservarse en hielo bajo condiciones que minimicen el estrés osmótico e iónico, así como la polimerización de la actina espontánea. En adicionales, relativamente altas concentraciones de fracción endosome (≥0. 1 mg/mL) y el citosol (≥ 3 mg/mL) son necesarios para la adecuada polimerización de la actina F en endosomas y detección, como se indica en los pasos 3.13 y 4.4, respectivamente. Asimismo, es importante llevar a cabo el ensayo con un 1:10 relación de endosome a citosol (proteína: proteína), como se indica en el paso 5.1.1. Por último, efectuado después de la polimerización de la actina (es decir, PFA y phalloidin) debe hacer muy suavemente para evitar el colapso o rotura de la red de actina.
Si es necesario, el ensayo en vitro actinia polimerización puede también realizarse directamente en un microscopio de cámara, después de agregar la mezcla de ensayo, para limitar las perturbaciones mecánicas de las redes de actina polimerizadas rodamina-actina purificada en endosomas (ver paso 5.2.3 y figura 2). En este caso, es mejor ajustar el extracto a limitante difusión de 26.5% (0,85 M) sacarosa (índice de refracción de 1.375) como browniano movimiento (paso 5.2.3), y eliminar los posibles agregados de purificada rodamina-actina por ultracentrifugación antes de su uso. Nuestras observaciones que moesina controla la formación de redes de F-actina en endosomas se recapitulan completamente usando esta versión alternativa de nuestro ensayo4,14.
Cualquier versión de nuestro protocolo, en el tubo de ensayo o en la sala de proyección de imagen, es óptimo para un estudio mundial de F-actina nucleación y polimerización de endosomas. Sin embargo, no es fácil de seguir el proceso de polimerización de actina a través del tiempo utilizando este enfoque, en parte porque endosomas no son inmóviles. Por lo tanto, no es fácil de controlar el crecimiento de filamentos individuales y así determinar la historia de la red de actina. Por ejemplo, puede ser difícil discriminar la F-actina ramificación de reticulación. Sin embargo, estamos seguros que se pueden mejorar condiciones para controlar la polimerización de la F-actina en tiempo real en la cámara de imágenes mediante la optimización de las condiciones para inmovilizar endosomas. Asimismo, será interesante controlar la polimerización de actina F de membranas artificiales usando componentes purificados. De hecho, previamente demostramos que la polimerización y la nucleación de la F-actina pueden ocurrir en liposomas después Unión tnucleación de factor de anexina A2 en la bicapa liposomal del11. Esta estrategia será útil disecar más el papel de determinados lípidos y proteínas en el proceso de nucleación y polimerización de F-actina y caracterizar los componentes mínimos necesarios para formar una red de F-actina en la membrana endosomal. Por último, creemos que esta estrategia será muy útil para estudiar otros procesos dependientes de la F-actina que se producen en las membranas del endosome, especialmente el reclutamiento y la movilización de la maquinaria de lavado de retrómero.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Se recibió apoyo de la Fundación Nacional Suiza de ciencia; el programa Sinergia suizo; el polaco-suizo de investigación programa (PSPB-094-2010); el NCCR en Biología química; y LipidX de la iniciativa de SystemsX.ch suizo, evaluados por la Swiss National Science Foundation (a J. G.). O. M. fue apoyado por una beca a largo plazo de la EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
