Summary
Erken endosome fonksiyonları F-aktin polimerizasyon üzerinde bağlıdır. Burada, böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi biyokimyasal ve genetik mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklamak manipülasyonlar.
Abstract
Birçok erken endosome işlev, özellikle kargo protein sıralama ve membran deformasyon, endosomal membran parçalanmayabilir kısa F-aktin filamentleri yamalari bağlıdır. Biz böylece reaksiyonlar karmaşık bu dizi genetik ve biyokimyasal mükellef işleme çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri, erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil kurduk manipülasyonlar. Endosomal kesirler flotasyon erken endosomal protein GFP-RAB5 ifade hücrelerden Sükroz Degradelerde tarafından hazırlanır. Sitozolik kesirler hücreler ayrı gruplar halinde hazırlanır. Hem endosomal hem sitozolik kesirler sıvı azot içinde donmuş gerekirse depolanabilir. Tahlil, endosomal ve sitozolik kesirler karıştırılır ve karışım uygun koşullarda (çevre azaltılmasıÖrneğin, iyonik gücü,) 37 ° C'de inkübe. İstenen zamanda tepki karışımı sabit ve F-aktin phalloidin ile ortaya çıkar. Aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon Floresans mikroskobu tarafından incelenir. Burada, bu tahlil ya aktin çekirdekleşme membran veya sonraki uzama, dallanma veya F-aktin filamentleri polietilenin söz konusu faktörler rol araştırmak için kullanılabilir raporu.
Introduction
Daha yüksek ökaryotik hücrelerde, proteinler ve yağlar sıralama oluştuğu erken endosomes içselleştirilmiş. Bazı proteinler ve yağlar, reutilized kaderinde vardır, erken endosomes borulu bölgelere dahil ve plazma zarı veya trans-Golgi ağ (TGN)1,2nakletti. Buna karşılık, diğer proteinler ve yağlar multivesicular bir görünüm sergileyen erken endosomes bölgelere seçmeli olarak paketlenir. Bu bölgeleri genişler ve erken endosomal membran üzerinden dekolmanı sonunda kart ücretsiz endosomal taşıyıcı veziküller veya multivesicular organları (ECV/MVBs), hangi kargo taşımacılığı geç endosomes1, karşı sorumlu değil 2.
Aktin endosomal sıralama kapasite ve endosome Biyogenez ile ilişkili membran tadilat sürecinde önemli bir rol oynar. Plazma zarı veya TGN geri dönüşüm yolları sıralama protein retromer karmaşık ve ilişkili proteinler bağlıdır. Bu sıralama makine oluşumu geri dönüşüm tübüllerin yolu ile etkileşimleri karmaşık, retromer, eşek ARISI ve yara izi homologue (yıkama) karmaşık ve dallı aktin3,4,5 ile birleştiğinde olabilir gibi görünüyor . Buna ek olarak, moleküller bozulması için mukadder, özellikle sinyal reseptörleri aktive, intraluminal veziküller (ILVs) taşıma (ESCRT)2,6içingerekli kompleksleri sıralama endosomal göre sıralanır, 7. Aktin ESCRT bağlı sıralama sürecinde olası rolü bilinen değil iken, F-aktin ECV/MVBs Biyogenez ve taşıma erken endosomes ötesinde önemli bir rol oynar. Özellikle, A2 annexin kolesterol zenginleştirilmiş bölgeler erken endosome ve spire1 ile birlikte bağlar, F-aktin polimerizasyon nucleates bulduk. Endosomes üzerinde gözlenen dallı aktin ağ oluşumu aktin ile ilgili protein (ARP) 2/3 dallanma etkinliğin gerektirdiği kompleksi, hem de ERM protein moesin ve aktin bağlayıcı protein cortactin8,9.
Burada, biz çekirdekleşme ve F-aktin polimerizasyon test tüpleri erken endosomal membranlar üzerinde reconstitutes mikroskobu tabanlı vitro tahlil açıklayın. Bu tahlil A2 F-aktin çekirdekleşme içinde annexin ve moesin ve cortactin endosomal aktin ağları8,9oluşumunda rol araştırmak için daha önce kullanılmış. Bu vitro protokolü ile endosomes aktin polimerizasyon sırasında ortaya çıkan tepkiler karmaşık dizi aktin çekirdekleşme, doğrusal bir işlemi, sıralı adımları biyokimyasal ve moleküler analiz mükellef haline polimerizasyon, dallanma ve çapraz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. çözümleri ve ürünleri
Not: tüm arabellekleri ve çözümleri (dd) H çift distile 2 ' O. hazırlanmalıdır Sükroz hidrasyon durumu değiştiğinden, tüm Sükroz çözümler son konsantrasyonu bir Refraktometre kullanarak belirlenmelidir.
- Hazırla fosfat tamponlu tuz olmadan divalent katyonlar (PBS-): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4 ve 6.5 mM Na 2 HPO 4. PH 7.4 için ayarlayın. Isıyla (15dk için 121 ° C'de 1 dönüşü) tarafından sterilize ve mağaza oda sıcaklığında.
- 300 mM imidazole stok çözeltisi hazırlamak: 0,204 g imidazole GKD 2 pH 7.4 HCl. filtre sterilize-0.22 mikron kullanarak kullanarak 4 ° C'de için boyut filtresi gözenek ve depolamak saat 4'te O.Adjust 10 ml ° C.
- Hazırlama homojenizasyon arabellek (HB; yaklaşık 100 mL hazırlamak): 250 mM Sükroz 3 mM imidazole içinde. PH 7.4 pH-metre kullanarak 4 ° C'de için ayarlayın. 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize ve depolamak saat 4'te ° C. tamamlayıcı HB kullanmadan önce proteaz inhibitörleri 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A ve 10 ng/mL aprotinin karşılık gelen son konsantrasyonlarda bir kokteylle.
- Adım flotasyon degradeler için %62, % 39 ve 3 mM imidazole, pH 7.4, % 35 Sükroz çözümleri aşağıda açıklandığı gibi hazırlamak. Tam bir Refraktometre kullanarak tüm Sükroz çözümler son konsantrasyonu belirlemek.
- 3 mM imidazole, pH %7,4 62 Sükroz çözümde hazırlamak 100 mL. Erime 80,4 g Sükroz GKD 2 içinde O karıştırma tarafından önceden ısındı 35 ° C. Ekle 1 ml 300 mM imidazole hisse senedi çözüm ve dolgu GKD 2 O. ayarlama ile 100 ml pH 7.4 için saat 4'te ° C. filtre sterilize etmek-bir 0,22 mikron gözenek boyutu filtre ve mağaza kullanarak 4 ° C'de
- 100 mL % 35 Sükroz çözeltisi içinde 3 mM imidazole, pH 7.4 hazırlayın. 300 mM imidazole hisse senedi çözüm GKD 2 O. eklemek 1 ml sukroz 40,6 g karıştırma tarafından dağıtılması ve GKD 2 O. ayarlama ile 100 ml pH 4 ° C. filtre sterilize kullanarak 0,22 mikron gözenek boyutu filtre ve depolamak saat 4'te 7.4 için doldurmak ° C.
- 50 mL 3 mM imidazole, pH %7,4 39 Sükroz hazırlayın. % 35 Sükroz çözüm % 62 Sükroz Çözümle sulandırmak. Mağaza 4 ° C'de
- Dropwise 1 M NaOH ekleme süre karıştırma 100 ml PBS-ön warmed 60 ° c tarafından 3 g-in paraformaldehyde (PFA) dağıtılması; son pH 7.4 NaOH kullanarak için ayarlayın. 0,22-mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre sterilize ve depolamak -20 ° c
Dikkat: %3 PFA olan toksik bir reaktif. - 1 M KCl hazırlamak hisse senedi çözüm. 50 ml GKD 2 O. filtre sterilize-0,22-mikron gözenek boyutu filtre karıştırma tarafından KCl 3.73 g dağıtılması ve mağaza oda sıcaklığında.
- -20, pH 7,0 ve 75 mm MgOAc 2 GKD 2 O. Aliquot ve store 0.625 M Hepes içeren konsantre hazırla 50 X hisse senedi çözüm ° C.
- Hazırlık montaj orta. Poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) 2.4 g 6 g gliserol ile karıştırma karıştırın. GKD 2 O 6 mL ekleyin ve oda sıcaklığında en az 2 h için bırakın. 12 0.2 mL ekleyin M Tris-Cl (pH 8,5) ve ısı yaklaşık 53 ° PVA eriyene kadar ara sıra karıştırarak ile c.
- Tarafından Santrifüjü 5000 x g oda sıcaklığında 20 dakika için de çözüm açıklamak. Süpernatant toplamak ve % 2.5 (w/v) 1,4 eklemek - diazabicyclo-[2.2.2] oktan photobleaching floresan algılama sırasında önlemek için (DABCO). Yaklaşık 30 için girdap çözülmeye s. Aliquot 1.5 mL plastik tüpler ve mağaza -20 ° c
2. Hücre kültür
- Dulbecco kültür HeLa hücreleri ' s % 10 fetal buzağı serum ile % 10 esansiyel olmayan amino asitler, takıma modifiye kartal orta %10 L-glutamin ve % 1 penisilin-streptomisin. %5 CO 2 kuluçka 37 ° C'de proje.
- Hücreleri ile ticari transfection reaktif üreticiye göre kullanarak GFP-RAB5 10 deneme önce 24 h transfect ' s yönergeleri.
- Gerektiğinde, endosomal kesirler ve faiz (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) ve/veya wildtype ya da mutant formu protein ilgi overexpressing bir protein tükenmiş hücrelerden sitozol hazırlayın.
3. Endosomal kesir hazırlık
Not: endosomes ve diğer hafif membranlar içeren hücre altı fraksiyonları basit hazırlanması bu protokolünü açıklar. Gerekirse, saf endosome kesirler de kullanılan 11 olabilir. Konfluent hücre GFP-RAB5 malzeme başlangıç olarak ifade 2 Petri yemekler (10 cm dış çap; 57 cm 2) hazırlayın. 2 Petri yemeklerinde Konfluent HeLa hücreleri toplam sayısı yaklaşık 2.5 x 10 7 hücreleri karşılık gelir. Ne zaman endosomes de hazırlıklı bir protein (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) faiz ve/veya wildtype ya da mutant formu faiz protein overexpressing, her zaman GFP-RAB5 ifade tükenmiş hücrelerden.
dikkat: Ayırma Protokolü'nün tüm merdiven-meli var olmak kılınmak buz üzerinde
- İçinde düz bir buz kovası Petri yemekler ıslak bir metal plaka üzerine yerleştirin ve hemen buz gibi PBS - 5 mL iki kez hücrelerle yıkayın.
- Tüm PBS - son yıkama servisinden kaldırın ve buz gibi PBS-çanak başına 3 mL ekleyin. Hücreleri değil işleme sırasında kuru: gerekirse, yeterli sıvı içeren hücreleri kapsayacak şekilde sallanan bir platform üzerinde buz kovası yerleştirin.
- Mekanik PBS Petri yemekler bir esnek kauçuk polis (Yani, ev yapımı hücre kazıyıcı) kullanarak hücreleri kaldırın. Hücreleri bulaşıkları dışına ilk yemeğin ortasında aşağı doğru bir hareket ardından yemeğin dışında etrafında hızlı, dairesel bir hareketle kazı. Yavaşça elde etmek için yara " çarşaf " bağlı hücre. Yavaşça buz üzerinde 15 mL konik polipropilen boru için geniş bir açılış ile bir plastik Pasteur pipet kullanarak hücreleri transferi
- 175 x g de 5 dk santrifüj ve 4 ° c
- Yavaşça süpernatant (SN) kaldırın ve HB 1-3 mL Pelet için ekleyin. Bir plastik Pasteur pipet geniş bir açılış ile kullanarak yavaşça pipet yukarı ve aşağı bir kez hücreleri resuspend için.
- 1,355 x g ve 4 ° C. yavaşça kaldır SN, 7-10 dk santrifüj.
- Hücre homojenizasyon gerçekleştirmek.
Not: Koşullar böylece hücrelerin plazma zarı koptu ama endosomes korunacak nazik olmalıdır.- Ekle HB birimi her hücre Pelet (hücre Pelet başına yaklaşık 100 μL) üzerine proteaz inhibitörleri ile bilinen bir. Hücreleri resuspended kadar 1.000-µL micropipette kullanarak, yavaşça yukarı ve aşağı pipet. Yapma Hava kabarcıkları tanıtmak.
- 1 mL tüberkülin şırınga 22 G iğne ile önceden HB ile durulanır ve hava veya bubbles ücretsiz hazırlayın.
- Hücre süspansiyon ile nispeten yavaş yavaş (Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmak için) şırıngaya doldur, eğimli tüp duvara iğne ucu yerleştirin ve hızla ekli hücreler plazma zarı yamultmak için hücre süspansiyon sınırdışı.
- Homogenate (yaklaşık 3 µL) küçük bir aliquot al ve HB 50 µL bir cam slayt üzerinde içine oranında seyreltin. Mix ve bir cam coverslip ile kaplayın. Homogenate X 20 veya 40 X amacı ile donatılmış bir faz kontrast mikroskop altında incelemek.
Not: optimum koşullar altında en hücreleri kırık, ama koyu gri görünür ve yapıları turu, çekirdek değildir ( şekil 1). - Tekrarlama adım 3.7.3 ve 3.7.4 en hücreleri kadar kırık; genellikle, iğne ile 3-6 alçalarak vuruş gereklidir. Homogenate protein tayini için küçük bir aliquot (10-30 µL) devam.
- 1,355 g x ve 4 7 dk santrifüj homogenate ° C.
Not: Santrifüjü sonra Pelet (tanımlı nükleer Pelet; Çekirdekleri ve (postnuclear süpernatant; tanımlanan süpernatant NP) içerir PNS) içeren sitozol ve üzerine homojenizasyon ve ücretsiz süspansiyon piyasaya organelleri. - Dikkatle PNS toplamak. Protein tayini için PNS ve NP küçük aliquots (10-30 µL) tutmak ve NP atın.
- PNS:62% Sükroz 1:1.1 oranını kullanarak PNS ile % 62 Sükroz çözüm sulandrarak PNS %40.6 Sükroz için ayarlayın. Yavaşça ama iyice, hava kabarcıkları oluşturmadan karıştırın. Refraktometre kullanarak Sükroz konsantrasyonu kontrol.
- PNS %40.6 Sükroz ultrasantrifüj tüp alt yerleştirin. Yerleşimi dikkatle 2.5 mL % 35 Sükroz çözeltisi ve santrifüj tüpü ile HB doldurun.
Not: arabirimleri açıkça görünecek şekilde Sükroz çözümleri katmanlı. - Ultracentrifuge ̴165, 000 x g ve 4 1 h için degradeleri ° C.
- Lipidler geçişin üstüne beyaz tabakası dikkatli bir şekilde çıkarın. Ardından, endosomes, sert kapak Ciltli ve % 35 sukroz, 200 μL micropipette ile kesilmiş bir ucu kullanarak arasında içeren arabirim toplamak.
Not: Endosomal kesirleri doğrudan vitro aktin polimerizasyon assay olarak kullanılabilir veya buz, flash-sıvı azot içinde donmuş bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C. - PNS ve endosomal kesirler protein konsantrasyonu belirlemek.
Not: Bu konsantrasyon en az 100 µg/mL olması gerekir. Yaklaşık 2.5 x 10 7 hücreleri 2 Petri yemeklerinde yetiştirilen bir PNS en az 100 µg/mL ile elde etmek için ihtiyaç vardır (yukarıdaki nota bakın).
4. Sitozol hazırlık
Not: malzeme başlangıç olarak Konfluent HeLa hücrelerin hazırlamak 2 Petri yemekler (10 cm çapında; 57 cm 2). Gerektiğinde, sitozol faiz (RNAi veya CRISPR/Cas9 kullanarak Yani) ve/veya wildtype veya ilgi proteinin mutant formu overexpressing bir protein tükenmiş hücrelerden de hazırlanabilir. Endosome Ayırma Protokolü gelince, tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirilmesi gereken
- 3.1-3,8 adımlarını yineleyin.
- Bir santrifüj tüpü ve ultracentrifuge için ̴250, 000 x g ve 4, 45 dk PNS yeri ° C.
- Dikkatle üstüne beyaz katmanı kaldırın ve microsome Pelet bozmadan SN (sitozol kesir) toplamak. Bir aliquot protein tayini için sitozol fraksiyonunun devam.
Not: Sitozol doğrudan vitro aktin polimerizasyon assay olarak kullanılabilir veya buz, flash-sıvı azot içinde donmuş bölünmemeli ve-80 adlı saklı olabilir ° C. - Sitozol protein konsantrasyonu belirlemek.
Not: En az 3 mg/mL olmalıdır.
5. Tahlil ölçüm Endosome bağımlı aktin polimerizasyon In Vitro
Not: Endosome bağımlı aktin polimerizasyon gerçekleştirilen iki alternatif yaklaşımlar kullanarak. İlk yaklaşımda malzemeler bir test tüpü içinde karışık, sabit ve bir coverslip transfer ve analiz. Burada, açıklanan ikinci yaklaşımda tahlil doğrudan görüntüleme odasında gerçekleştirilebilmesi ve sabit ve mekanik pertürbasyon ( şekil 2C) analiz. Bu ikinci yaklaşımda tahlil karışımı bir test tüpünden bir coverslip için aktarılmaz ve böylece soğukkanlı, F-aktin ağlara fiziksel aktarım sırasında tedirgin tehlikesi azalan kalır. Buna ek olarak, bu ikinci yaklaşım F-aktin polimerizasyon hızlandırılmış bir analizi ile uyumludur. F-aktin polimerizasyon analizi hiçbir fark her iki yaklaşım ile gözlenmiştir unutulmamalıdır.
Not: Kullanım ipuçları protokol boyunca kesti.
- Bir test tüpü içinde
- yavaşça karışımı buz gibi saf GFP-RAB5 endosomes (Adım 3) sitozol (Adım 4) 1:10 (protein konsantrasyonu) olan bir buz gibi 1.5 mL konik test tüpünde oranında ile.
Not: Tipik bir deney ile yaklaşık 40-50 µL gerçekleştirilir. - 125 mM (1 M KCl hisse senedi çözüm kullanarak) KCl, 12,5 mM Hepes ve 1.5 mM MgOAc 2 (50 x hisse senedi çözüm kullanarak) son konsantrasyonları buz gibi tepki karışıma ayarlayın. Sonra karışımı proteaz inhibitörleri 10 mM leupeptin, 1 mM pepstatin A ve 10 ng/mL aprotinin son konsantrasyonları ile ayarlayın. Tüm bileşenleri karışımı yavaşça.
- Sallayarak olmadan, 37 ° C'de tepki karışımı içeren deney tüpü yerleştirin ve istenen süre kuluçkaya.
Not: Genellikle, aktin polimerizasyon endosomes ve geniş bir ağ oluşumu için 30 dk algılamak için yaklaşık 3 dakika sürer. - İstediğiniz zaman (Yani, 3 dk ya da 30 dk), buz üzerinde test tüpü yerleştirerek reaksiyonu durdurmak ve 1/10 (vol:vol) precooled % 3 PFA çözüm eklemek.
- , Kırmızı-turuncu boya polimerli aktin leke Birleşik 200 adet/mL (~6.6 mikron) phalloidin 0.3:10 (vol:vol) ekleyin.
- Yer 12 μL 12 üzerine karışımı μL PVA montaj orta bir mikro cam slayt üzerinde. 18 x 18 mm 2 cam coverslipon top koyun.
- Confocal mikroskobu ile örneğini analiz.
- yavaşça karışımı buz gibi saf GFP-RAB5 endosomes (Adım 3) sitozol (Adım 4) 1:10 (protein konsantrasyonu) olan bir buz gibi 1.5 mL konik test tüpünde oranında ile.
- Görüntüleme odasında
- mikroskobik görüntüleme chambers, plazma temizleyici 1 dakika yuvarlak 18 mm çaplı coverslip ve bir yuvarlak 35 mm çapı 20 mm cam alt ile donatılmış Petri kabına temizlemek için yapmak, (0.16-0,19 mm).
- % 1 β-kazein protein bağlayıcı cama en aza indirmek 20 dakika ile temizlenmiş yüzeyler kuluçkaya. 3 mM imidazole ile iki kez yıkayın.
- Ekle endosome ve aynı sitozol tahlil karışımı olduğu gibi 5.1.1 ve 5.1.2, precooled 1,5 mL tüp bebek adımları ve tahlil karışımı 0,1 μg/μL rodamine-aktin ile tamamlayıcı.
- Son kırılma % 39 Sükroz çözüm kullanarak dizin 1.375 (%26,5 Sükroz) için karışımı ayarlayın.
Not: Genellikle, aynı birimin eklenir; Ancak, bu ampirik olarak yeniden Sükroz konsantrasyon biraz deneme deneme değişebilir bu yana bir refractomer kullanarak toplanan kesir Sükroz konsantrasyonu bağlı olarak ayarlanmış olmalı. - Ön işleme 35-mm çanak (Adım 5.2.1) karışımı yerleştirin ve ön işleme 18 mm coverslip (Adım 5.2.1) ile yeter.
- Odası, sallayarak olmadan 37 ° C'de yer.
- Confocal floresan mikroskopisi kullanılarak örneğini analiz.
6. Görüntü Acquisition ve aktin ağ analizi
- resim alma
- elde etmek belgili tanımlık imge üstünde ters bir tarama confocal mikroskobu.
Not: 63 X 1,25 NA petrol amaç ters bir tarama confocal mikroskopla için görüntü alma ayarlarını optimize. İyi bir sinyal / gürültü oranı elde etmek için lazer güç (genellikle % 50) ayarlamak.
- elde etmek belgili tanımlık imge üstünde ters bir tarama confocal mikroskobu.
- Miktar aktin ağının
- Floresan Filmler analiz. Açık kaynak kodlu yazılım CellProfiler (v2.1.1) 12 aktin endosome ücret miktarını ölçmek için kullanın (alternatif yazılım kullanılabilir).
- İlk, GFP-RAB5 sinyal kullanarak birincil nesne olarak endosomes belirlemek. O zaman, F-aktin aktin sinyal yayma kullanarak bireysel endosomes ile ilişkili ölçmek (kırmızı-turuncu boya Birleşik Phalloidin) ikincil bir nesne olarak.
- Ortalama ve her nesne için denetim durumu için ilişkili malzeme sayısı normale.
- Floresan Filmler analiz. Açık kaynak kodlu yazılım CellProfiler (v2.1.1) 12 aktin endosome ücret miktarını ölçmek için kullanın (alternatif yazılım kullanılabilir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F-aktin yamalar üzerinde erken endosome membran oluşumu anlayışlar kazanmak için Şekil 2' de belirtilen iletişim kuralı takip ettik. Kısaca, hücreleri GFP-RAB5 ile transfected ve o zaman erken endosomes hücre altı ayırma tarafından hazırlanmıştır. Bu saf erken endosomes kendisi gibi diğer faktörler tepki muhtemelen katılan aktin sağlamak sitozol ile inkübe. Kuluçka dönemi sonunda, reaksiyon karışımı fiksasyonu tarafından durduruldu. Bir örnek daha sonra toplanan ve mikroskobik bir slaytta yatırılır. Son olarak, F-aktin (şekil 3A) phalloidin ile ortaya çıktı. F-aktin çekirdekleşme erken endosomal membranlar hem de sonraki polimerizasyon süreci üzerine hızla oluştu. Gerçekten de, F-aktin zaten üzerinde endosomes 1 dk içinde tepki (şekil 3A) başlangıç sonra görüntülenmeyecektir. Başlangıçta kısa, bu aktin yapıları hızla uzun, dallı ve bağlantılı aktin filamentleri (şekil 3A), muhtemelen dengesiz aktin dynamics tüp bebek yansıtan bir iç içe ağ oluşumu için önde gelen bir başka oldu. Benzer çekirdekleşme ve polimerizasyon oranları ne zaman tahlil hücre sitozol ek olarak saf rodamine etiketli aktin ile gerçekleştirildiği tespit edildi. Böylece yapıları doğrudan, herhangi bir pertürbasyon (şekil 3B) yokluğunda görüntüsü bu cam popolu yemekleri yapıldı. Burada açıklanan assay olarak, erken endosomes de novo aktin polimerizasyon seçmeli olarak nucleate. Nitekim, vitro tepki ya endosomes ya da sitozol yokluğunda yürütülen aktin polimerizasyon meydana gelmedi. Böylece erken endosomes çekirdekleşme ve aktin filamentleri9,11sonraki polimerizasyon desteklemek için temel yeteneğine sahip söylenebilir.
Endosomes polimerli aktin miktarını analiz etmek için farklı zamanlarda alınan görüntüleri CellProfiler (şekil 4A) kullanarak analiz edildi. Endosome polimerli aktin miktarı aktin tek bir erken endosome çevreleyen alanı olarak ölçüldü. Aktin polimerizasyon hızı işleminin başında daha yüksek ve zaman (şekil 4B) ile azaldı. Aktin ağ daha ayrıntılı olarak erken zaman noktalarda tepki başlangıç sonra analiz. Bu erken zaman-noktalarda, bireysel aktin içeren yapıları olmak hala olmak farklı--dan her diğer. Aktin ağlar karmaşık organizasyonu değerlendirmek için her endosome yayılan aktin filamentleri sayısı sayımının gerçekleştirildiği (yani, birincil filamentler). Benzer şekilde, birincil filamentler (Yani, ikincil filamentler) kaynaklanan aktin filamentleri sayısı, yanı sıra tüm diğer aktin filamentleri bu ağlarda tespit edilmesi ve bu kaynaklı değil endosomes () sayısı sayıldı Yani, diğer filamentler) (şekil 4 c-E. Bir kez aktin filamentleri takip edildi, diğer parametreleri gibi bireysel aktin filamentleri ve aynı aktin filamentleri için bağlı endosomes sayısı uzunluğu-ebil var olmak kolayca hesaplanan (4F rakam).
Şekil 1: faz kontrast test, HeLa hücre Homogenate. Homojenizasyon sonra özü mikroskobik bir slayt ve bir coverslip arasında takıldı. Yayın için filmler yağı daldırma sonra 100 X amacı ile ele geçirildi. Rutin muayene için ancak, X 20 veya 40 X amaç yağı daldırma olmadan altında hücre özü görselleştirildiği. İki örnek homogenate görüşlerini yüksek büyütme (A-B) gösterilir. Çekirdek (yıldız) yuvarlak yapıları koyu gri renkli, ekli hücre kalıntıları olmadan görünür. Okları değişen boyutu, şekli ve translucence, hücre homojenizasyon piyasaya sürülen hücre içi malzemeleri (Yani, organelleri) karşılık gelen karakteristik granülleri üzerine gelin. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: şematik gösterim Protokolü'nün. Endosomal özleri(a)ve sitozol özleri (B) hazırlamak için ve aktin polimerizasyon endosomes vitro (C) üzerinden izlemek için kullanılan iletişim kurallarını şematik açıklaması. (SN) süpernatant, homojenizasyon arabellek (HB), postnuclear süpernatant (PNS), nükleer Pelet (NP) ve paraformaldehyde (PFA). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Çekirdekleşme ve F-aktin üzerinde erken Endosomes Vitropolimerizasyon. (A)Endosomes Hela saf hücreleri ifade GFP-Rab5 (yeşil) ve HeLa sitozol ayrı ayrı hazırlanan. Assay olarak, erken endosomes (EEs) sitozol ile karıştırıldı ve karışım inkübe için belirtilen kez. Karışım sonra sabit, phalloidin ile etiket F-aktin (kırmızı) etiketli ve floresan confocal mikroskobu tarafından analiz. Bar: 10 µm (üst panel) ve 5 mikron (alt paneli). (B) EEs GFP-Rab5 (yeşil) ve HeLa sitozol ifade hücreleri ayrı olarak hazırlanmıştır Hela saf. Bu hücre özleri saf rodamine-aktin (kırmızı) için belirtilen ile inkübe kez mikroskop odasında ve confocal mikroskobu tarafından analiz edildi. Ölçek çubuğu 10 µm deneme Aolduğu gibi gerçekleştirilen. (C) =. HeLa sitozol (EEs) olmadan ve GFP-Rab5 ile (sitozol) etiketli HeLa endosomes (yeşil) ayrı ayrı inkübe (soldaki ve ortadaki panelleri) veya birlikte (doğru kapı aynası) için 30 dk, sabit, phalloidin (kırmızı) etiketine F-aktin etiketlenir ve analiz Floresan confocal mikroskobu. Ölçek çubuğu 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: aktin ağ analizi. (A)iş akışı CellProfiler analizi. Polimerli aktin (B) sayısı CellProfiler yazılımını kullanarak endosomes sayısına göre sayısal. Veri çoğu ortalama ± s.e.m. (n = 3). Veri vardır anlamına gelir ± SD (n = 3). 15 dk karşı 5 dk (ns P0.0736 =), 5 min 30 dk karşı (* P 0.0195 =) ve 30 dk karşı 15 dk (ns P 0.3129 =). (C)Erken endosomes (EEs) GFP-Rab5 ve HeLa sitozol ifade Hela hücreleri saf ayrı olarak hazırlanmıştır ve tahlil şekil 2Aolarak gerçekleştirilmiştir. Örnekleri 7 dakika sonra tespit edildi. Orta paneli ImageJ yazılımının NeuronJ plugin13 kullanılarak çizilen F-aktin yapıları izleri çakışma ile aynı test gösterir. Doğru kapı aynası sadece izlerini gösterir. Ölçek çubuğu = 10 µm. F-aktin gösterimi (D) yapısı numaralandırma sırasını ImageJ yazılımı ile quantification kullanılır. C-Diçinde tanımlandığı gibi aktin filamentleri, sayının (E) miktar. Veri vardır anlamına gelir ± SD (n = 3). İkincil dalları karşı birincil dalları (ns P 0.5262 =), diğer dallar karşı ikincil dalları (ns P 0.6815 =) ve diğer dallar karşı birincil dalları (ns P 0.2254 =). (F) F-aktin uzunluğu yapıları ve aktin yapısı başına EEs sayısı diğer parametreleri örnekleri C-Diçinde tanımlanan miktar ile analiz daha gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aktin, endosome membran dynamics4,14' te önemli bir rol oynar. Biz daha önce aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon erken endosomes üzerinde oluşan küçük F-aktin yamalar veya ağları kurma bildirdi. Bu F-aktin ağlar membran taşıma düşmesine yol boyunca erken endosomes ötesinde için kesinlikle gereklidir. Bu çekirdekleşme ve polimerizasyon sürecinin herhangi bir aşamasında müdahale endosome olgunlaşması ve böylece geç endosomes andlysosomes9,11,15doğru aşağı akım taşıma engeller. Özellikle, yukarıda açıklanan F-aktin polimerizasyon sıralı adımları erken endosomes üzerinde analiz etmek ve moleküler seviyede süreci tanımlamak için tahlil ederdik.
Bu deneylerde, erken endosomes GFP-RAB5 vivoile etiketli hücre altı ayırma tarafından saf ve F-aktin polimerizasyon vitroiçin izin vermek için sitozol varlığında test tüp içinde inkübe. İstenen zamanda tepki durdurulur ve reaksiyon karışımı F-aktin etiketlemek için phalloidin kullanarak Floresans mikroskobu tarafından analiz için bir mikroskobik bir slayda aktarılır. Bu deneysel strateji kullanarak, A2 annexin ARP2/3 F-aktin dallanma, beklendiği gibi aracılık eder iken F-aktin çekirdekleşme tarih ile birlikte SPIRE1, erken endosomes için gerekli olduğunu gösterdi. Biz de moesin ve cortactin ECV/MVB Biyogenez ve memeli hücreleri9,11bozulma yol boyunca olgunlaşma aracılık F-aktin ağlar oluşumu için gerekli olduğunu gösterdi.
Her ne kadar düşük seviyelerde ectopically ifade RAB5 endosomes herhangi bir önemli ölçüde10değiştirmeyin, bu küçük GTPazlar ilk endosome membran dynamics16,17 anahtar bir regülatör olduğunu akılda tutmak önemlidir . Bazı deneylerde, bu nedenle etiket endosomes alternatif iletişim kurallarını kullanarak tahlil için uygun olabilir. Örneğin, erken endosomes uygun endocytosed floresan izleyiciler, epidermal büyüme faktörü veya transferrin4,14gibi kullanarak etiketli.
Ayrıca teknik olarak görüntü bireysel aktin filamentleri geleneksel confocal mikroskobu ile zor olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, biz F-aktin yapıları aktin ağlar üzerinde endosomes açıklamak için metin boyunca bakın. Sonuç olarak, biz bir F-aktin ağ oluşumu daha doğru bir şekilde Floresans yüzey alanı ağları tercihan--dan onların yoğunluğu ölçerek sayısal olduğunu hissediyorum.
Tamamen aktin çekirdekleşme etkinlik vitro başka yapısı veya arıtma sırasında RAB5 endosomes bağlı kalır organel tarafından aracılık ettiği gözlenen olasılığını ekarte etmek kolay değil. Ancak, bu tür kirlenme pek olası değil. Bazı organelleri degradeler üzerinde benzer fiziksel özellikleri nedeniyle ortak arındırmak iken, onlar arıtma sonra birbirlerine kantitatif bağlı kalmak için uğraşmıyorlar. Ayrıca, aktin çekirdekleşme faaliyet kesinlikle erken endosomes RAB514içeren mevcut olan A24,14, annexin üzerinde bağlıdır. Son olarak, biz F-aktin yapıları seçmeli olarak RAB5 endosomes vivo ile ilişkili olan ve diğer endosomes veya diğer hücresel zarları4,14bulunamadı bulmak. Sonuç olarak, aktin çekirdekleşme etkinlik bu etkinliği ortak arındırır ve RAB5 endosomes ile birlikte yerelleştirir beri RAB5 endosomes ile ilişkili olabilir.
Bu tahlil, çok gibi karmaşık biyokimyasal reaksiyonlar denetleyen endosomes16 veya diğer membran18 ve bu dinamikleri bir test tüpü içinde gerçekleştirilen sulandırmak diğer deneyleri içinde bu hazırlık sağlamak önemlidir hücresel özleri, en uygunudur. Hücreleri endosomes ve diğer organelleri, özellikle çekirdeği ve organellerin zarar sınırlamak için nazik koşullar altında homojenize. Ayrıca, endosome kesirler buz ozmotik ve iyonik stres gibi kendiliğinden aktin polimerizasyon en aza indirmek koşullar altında tutulmalıdır. Endosome kesir (≥0.1 mg/mL) ve sitozol (≥3 mg/mL) ek, nispeten yüksek konsantrasyonlarda sırasıyla endosomes ve algılama, adım 3.13 ve 4.4, belirtildiği gibi yeterli F-aktin polimerizasyon için gereklidir. Benzer şekilde, bir 1:10 ile tahlil gerçekleştirmek önemlidir sitozol (protein: 5.1.1. adımda gösterildiği gibi protein), endosome oranı. Son olarak, aktin polimerizasyon (PFA ve phalloidin eklemek içinYani ) sonra pipetting çok yavaşça daraltma veya aktin ağ kırma önlemek için yapılmalıdır.
Gerekirse, vitro aktin polimerizasyon tahlil de doğrudan bir mikroskop odası, saf rodamine-aktin polimerli aktin ağların mekanik tedirginlikler sınırlamak için tahlil karışıma ekledikten sonra Imaging içinde yürütülen olabilir (bkz: adım 5.2.3 ve Şekil 2) endosomes. Bu durumda, özü %26,5 (0,85 M) sukroz (1.375 kırılma indisini), sınırlayıcı Difüzyon için ayarlamak en iyi ve Albert gibi hareket (Adım 5.2.3) ve olası agrega kaldırmak için rodamine-aktin ultrasantrifüj kullanmadan önce tarafından arıtılmış. Gözlemlerimiz bu moesin endosomes F-aktin ağlarda oluşumunu denetler tamamen bizim tahlil4,14alternatif bu sürümünü kullanarak recapitulated.
Bizim iletişim kuralı, deney tüpü veya görüntüleme odasında her iki sürümünde F-aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon endosomes üzerinde genel bir analizi için en iyi yöntemdir. Ancak, zaman içinde endosomes hareketsiz olmadığı için bu yaklaşım, kısmen kullanarak aktin polimerizasyon süreci takip etmek kolay değil. Sonuç olarak, bireysel filamentler ve bu nedenle büyüme izlemek kolay değil aktin ağ tarihi belirlemek. Örneğin, F-aktin crosslinking dallanma ayırt etmek zor olabilir. Ancak, biz endosomes hareketsiz koşulları optimize ederek F-aktin polimerizasyon gerçek zamanlı olarak izlemek için koşullar görüntüleme odasında geliştirilebilir eminiz. Benzer şekilde, F-aktin polimerizasyon saf bileşenleri kullanarak yapay membran üzerinden izlemek ilginç olacak. Aslında, biz daha önce F-aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon lipozomlar üzerinde bağlama t sonra ortaya çıkabileceğini gösterdio çekirdekleşme faktör lipozom bilayer11üzerine annexin A2. Bu strateji daha fazla rolü belirli lipidler ve proteinler F-aktin çekirdekleşme ve polimerizasyon süreci içinde incelemek için ve endosomal membran üzerinde bir F-aktin ağ oluşturmak gereken en az bileşenleri tanımlamak için yararlı olacaktır. Son olarak, bu strateji endosome membranlar, özellikle işe alım ve seferberlik retromer/Yıkama makinaları meydana diğer F-aktin-bağımlı işlemler çalışma çok yararlı olacağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Destek İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan aldığı; İsviçre Sinergia programı; Lehçe-İsviçre araştırma programı (2010/PSPB-094); NCCR Kimya Biyoloji; ve LipidX İsviçre SystemsX.ch girişimi üzerinden değerlendirilir (J. G. için) İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından. O. M. bir EMBO uzun vadeli Bursu (ALTF-516-2012) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A.
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D.
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
