Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Summary

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze "levende steigers", het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Abstract

Neurotrauma en neurodegeneratieve ziekte vaak leiden tot een blijvende neurologische tekorten als gevolg van de beperkte capaciteit van het centrale zenuwstelsel (CNS) ter vervanging van verloren neuronen en regenereren van axonale trajecten. Echter tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel optreden neuronale migratie en axonale uitbreiding vaak langs trajecten gevormd door andere cellen, hierna aangeduid als "levende steigers". Op zoek naar te emuleren deze mechanismen en voor het ontwerpen van een strategie die de remmende omgeving van het centraal zenuwstelsel omzeilt, dit manuscript presenteert een protocol om weefsel ontworpen Astrocyt gebaseerde "levende steigers". We gebruikt wilt maken van deze constructies, een roman biomaterial omhulsel regeling voor het opwekken van astrocyten zelf monteren in dichte driedimensionale bundels van bipolaire lengterichting uitgelijnde waarin en processen. Eerste, holle hydrogel micro-kolommen werden geassembleerd, en de binnenste lumen was bedekt met collageen extracellulaire-matrix. Gedissocieerde cerebrale corticale astrocyten vervolgens werden geleverd in het lumen van de cilindrische micro-kolom en een kritische binnendiameter van < 350 µm, spontaan zelf uitgelijnd en uitbesteed aan het produceren van lange vezel-achtige kabels bestaande uit dichte bundels Astrocyt processen en collageen fibrillen meten < 150 µm in diameter maar uitbreiding van enkele cm in lengte. Deze levende steigers tentoongesteld ontworpen > 97% levensvatbaarheid van cellen en waren vrijwel uitsluitend samengesteld van astrocyten uiting geven aan een combinatie van de tussenliggende gloeidraad eiwitten gliale-fibrillary zuur eiwit (GFAP), vimentin, en nestin. Deze uitgelijnd Astrocyt netwerken werden gevonden om een tolerante substraat voor neuronale bevestiging en uitgelijnd neurite extensie. Bovendien houden deze constructies integriteit en uitlijning wanneer geëxtraheerd uit het omhulsel van de hydrogel, waardoor ze geschikt voor implantatie van de CNS. Deze voorgevormde constructies emuleren structureel belangrijkste cytoarchitectural elementen van natuurlijk voorkomende gliale gebaseerde "living steigers" in vivo. Als zodanig kunnen deze gemanipuleerde levende steigers dienen als proefnetwerken studeren neurologische mechanismen in vitro of vergemakkelijken van neuroregeneration door het regisseren van neuronale migratie en/of axonale vastloper na CNS degeneratie in vivo .

Introduction

Het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft een beperkte capaciteit voor het tegengaan van het verlies en/of disfunctie van neuronen en axonale trajecten die gepaard gaan met aandoeningen zoals traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte, ruggenmerg letsel (SCI) en neurodegeneratieve ziekte^{1 ,2,},^3,,^4,5. Neurogenese in het VNV is beperkt tot een beperkt aantal gebieden in de hersenen, belemmering voor het herstel van verloren neuronen^6,7. Bovendien, is regeneratie van verloren axonale trajecten in het VNV onvoldoende als gevolg van het ontbreken van gerichte begeleiding, de aanwezigheid van uitgroei remmers en reactieve astrogliosis na beschadiging zenuwweefsel^{2,8, 9,10}. Astrocyten hebben gewoonlijk diverse functies in het bijstaan van neuronen met ion homeostase, neurotransmitter klaring, synaps formatie en neurovasculaire koppeling¹¹. Niettemin, na zelfs milde beschadiging van zenuwweefsel, astrocyten kunnen moleculaire, structurele en functionele wijzigingen ondergaan als ze de overgang naar een hypertrofische staat¹¹. In reactie op de ernstige neurotrauma, deze veranderingen leiden tot de vorming van een litteken met een bijschaduw met migreren reactieve astrocyten en een laesie kern waarin leukocyten gelekt uit de gescheurde bloed - hersenbarrière (BBB), microglia, oligodendrocyten en fibroblasten^11,12,13. Deze reactieve astrocyten bereiken een morfologie van draadvormige, ongeorganiseerd processen en vertonen verhoogde expressie van tussenliggende gloeidraad eiwitten en chondroitin sulfaat-proteoglycans (CSPGs), die een belemmering vormen voor neurale regeneratie¹². Hoewel het gliale litteken aanvankelijk helpt BBB integriteit herstellen en voorkomen van transmissie van de ontstekingsreactie naar het omliggende gezonde weefsel, dient het als een fysische en biochemische barrière tegen axon regeneratie^{12,14 ,15,16}. Bijvoorbeeld, axonen die het gliale litteken optreden weergeven bolvormige Dystrofe groei kegels en onvolgroeide groei¹². Bovendien belemmert de desorganisatie van astrocytic processen na blessure de uitbreiding van het regenereren van axonen¹⁷. Het resultaat van deze remmende eigenschappen komt ook tot uiting in de vaak-permanente lichamelijke en neurologische waardeverminderingen op die patiënten na ernstige neurotrauma lijden, met inbegrip van TBI en SCI.

Ongeacht de extrinsieke uitdagingen functionele regeneratie in het VNV, zijn axonen aangetoond te beschikken over een intrinsieke vermogen om te regenereren. Bijvoorbeeld, suggereert de dynamische aard van de kegels Dystrofe groei in contact met het gliale litteken dat deze uitgangen behouden hun capaciteit uit te breiden van¹². Dus, het is van mening dat een belangrijke belemmering voor axonale uitgroei de remmende omgeving van de CNS na letsel en dat een meer tolerante omgeving is via vermindering van gliale littekens en/of verstrekken van regeneratieve bruggen over het litteken zou voordelige. Inderdaad, de vorige studies hebben aangetoond dat CNS neuronen aankonden axonen door middel van een laesie met behulp van perifere zenuwen transplantaten als bruggen, die een gunstiger omgeving voor axon regeneratie^{12,18, uit te breiden 19}. Verschillende andere strategieën zijn uitgeoefend om te exploiteren deze rudimentair regeneratief vermogen. Bijvoorbeeld, heeft manipulatie van cel groei signaalroutes in verschillende modellen van de schade geleid tot axonale regeneratie en gliale scar vermindering^10,20,21. Bovendien, hebben studies aangetoond dat behandeling met chondroitinase ABC, die de meerderheid van de suiker-ketens cleaves in CSPGs, de remmende werking van CSPGs uitgescheiden door reactieve astrocyten^{22 vermindert}. Ondanks de bemoedigende resultaten, deze benaderingen bieden geen regie begeleiding van groei kegels, die kan leiden tot afwijkende regeneratie¹², en ook geen rekening met het verlies aan neuronen. Cel-gebaseerde benaderingen hebben gebruikt in pogingen om te overwinnen van de gevolgen van de gliale litteken en om aan te vullen verloren cellen, met name neuronen. Sommige groepen hebben dedifferentiated reactieve astrocyten in neuronen, terwijl anderen hebben neurale voorlopercellen getransplanteerd in CNS laesies repopulate de schade-gebied en het bevorderen van axon regeneratie^{23,24, 25}. stamceltransplantatie alleen wordt echter beperkt door lage overlevingskansen, slechte integratie en het bescheiden vasthouden in de beschadigde weefsel⁵. Bovendien, deze cel-gebaseerde strategieën niet herstellen van interlokale axonale traktaten, vooral op een gecontroleerde manier. Daarom, biomaterialen in combinatie met andere benaderingen worden onderzocht als leverende voertuigen voor diverse neurale en voorlopercellen en groei factoren²⁶. Biomaterial-gebaseerde benaderingen zijn voorzien van een hoge mate van Ontwerpcontrole voor de productie van constructies die na te de specifieke fysieke, haptotaxic bootsen, en chemotaxic signalen aanwezig is in de driedimensionale (3D)-communicatie van de doel host weefsel^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproductie van deze Milieusignalen is primordiaal voor getransplanteerde cellen te presenteren native-achtige morfologie, proliferatie, migratie en signalering, onder andere neurobiologische kenmerken²⁹. Ondanks deze gunstige eigenschappen is vooruitgang dan traditionele cel geplaatste biomaterial steigers moeten tegelijkertijd bevorderen van gestuurde interlokale axonale regeneratie en vervanging van verloren neuronen.

"Levende steigers", die te onderscheiden van andere cel-gebaseerde benaderingen als gevolg van de aanwezigheid van levende neurale cellen met een voorgevormde cytoarchitecture die native neuroanatomie emuleert een veelbelovende alternatieve aanpak is gebaseerd op zenuwweefsel ontworpen en/of Developmental mechanismen om gerichte vervanging, wederopbouw en herstel van de neurale circuits^4,35. Overwegingen bij het ontwerp van levende steigers zijn de fenotypes en de bronnen van neurale cellen, evenals de mechanische/fysische eigenschappen en de biochemische signalen gedicteerd door de samenstelling van de begeleidende biomaterialen³⁵. Na fabricage in vitro, deze levende steigers kunnen worden geïmplanteerd in vivo aan de huidige cel-celadhesie-moleculen en Chemotactische en neurotrophic signalen neurale cel migratie en axon uitgroei afhankelijk van de status actief worden gereguleerd en progressie van regeneratieve processen³⁵. Gliale cellen kunnen dienen als basis voor de gemanipuleerde cytoarchitecture van levende steigers, aangezien deze cellen verschillende ontwikkelings mechanismen in vivo bemiddelen. Tijdens de ontwikkeling van de hersenen rekenen nieuwe neuronen op basale processen met radiale glia verlengd van de ventriculaire zone naar de ontwikkelingslanden corticale plaat als levende steigers voor gestuurde migratie^36,37. Anderzijds uitbreiding van groei kegels zijn getoond om te oriënteren zich door het aftasten van de aantrekkelijke en afstotend signalen ontlokte door markering gliale cellen, en zogenaamde "baanbrekende" axonen worden voorgesteld om de juiste doelstellingen bereiken door uitbreiding langs vooraf gedessineerde gliale steigers^35,38,39. Gliale cellen zijn dus nodig voor de begeleiding van baanbrekende axonen, die later als axon gebaseerde dienen "levende steigers" om de projectie van "volger" axonen. Bovendien groei glia-gemedieerde mechanismen te volharden postnatale stadium manifesteren, zoals neuroblasten de rostraal migratoire stroom (RMS volgen) om te navigeren van de subventriculaire zone (SVZ), een van de weinige resterende gebieden van neurogenese in de volwassen hersenen, is aangetoond dat de bulbus olfactorius (OB)⁴⁰. Deze neuroblasten in de RMS migreren binnen de gliale buis (figuur 1A-1), die bestaat uit de lengterichting uitgelijnde astrocytic processen, via directe cel verklevingen en een gelokaliseerde oplosbare factoren^{37, 41}. ten slotte terwijl CNS schade in zoogdieren oorzaken verstoord astrocytic proces regeling vormen een gliale litteken dat fysiek axonale regeneratie^{17 belemmert}, veel bij niet-zoogdieren systemen ontbreken de vorming van een schadelijk gliale litteken. Daarentegen handhaven gliacellen bij niet-zoogdieren soorten meer georganiseerd, patronen die worden gebruikt als gidsen door de benadeelde regio^17,42,43uitgelijnd. Bijvoorbeeld, worden bij niet-zoogdieren SCI modellen, axonen getoond om te groeien in nauwe samenwerking met gliale bruggen oversteken van de laesie, suggereren een belangrijke rol voor georganiseerde gliale steigers als substraten axonale regeneratie en functionele herstel (te vergemakkelijken Figuur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulatie van de neuroanatomische functies en de ontwikkelings/regeneratieve mechanismen zoals hierboven beschreven kan het opleveren van een nieuwe klasse van gemanipuleerde gliale gebaseerde levende steigers die gelijktijdig onvolwassen neuronale migratie kan rijden en axonale vastloper door anders niet-tolerante omgevingen, waardoor potentieel afzwakking van de gevolgen van neuronale en axon tract degeneratie geassocieerd met CNS letsel en ziekte.

Onze onderzoeksgroep heeft eerder ontworpen meerdere soorten levende steigers voor wederopbouw en herstel van axonale traktaten in het centraal zenuwstelsel en het perifere zenuwstelsel (PNS) via micro-weefsel ontworpen neurale netwerken (micro-TENNs) en weefsel gemanipuleerde zenuw transplantaties (TENGs), respectievelijk^27,46,47,48. Beide strategieën zijn inherent gebaseerd op het biomimicry. Micro-TENNs zijn anatomisch-geïnspireerde structuren ontworpen ter vervanging van structureel en functioneel axonale traktaten verbinden verschillende neuronale populaties van de hersenen. TENGs exploiteren de ontwikkelingstoxiciteit mechanisme van axon-vergemakkelijkt axonale regeneratie, wordt geïllustreerd door "volger" axon groei langs "pionier" axonen, om gerichte host axonale regeneratie^35,46,48. We onlangs gekapitaliseerd op de veelzijdigheid van de levende steiger techniek met behulp van een soortgelijke regeling omhulsel als micro-TENNs en op zoek naar inspiratie uit de glia gebaseerde mechanismen aanwezig in de gehele ontwikkeling. Hier, ontwikkelde we constructies bestaande uit uitgelijnde astrocytic bundels verspreid over de collagene lumen van een hydrogel micro-kolom⁴⁹. Deze astrocytic levende steigers zijn ontwikkeld door het eerste vullen een vergadering van de capillaire buis-acupunctuur-naald met vloeibare agarose als u wilt maken van een holle cilindrische hydrogel met een buitendiameter (OD) en de binnendiameter (ID) overeenkomt met de diameter van de buis en needle, respectievelijk. Na agarose gelering en extractie van de hydrogel micro-kolom van de capillaire buis, de holle interieur is bekleed met type I collageen leveren een omgeving tolerant voor Astrocyt hechting en uitgelijnd bundel vorming (figuur 1B -1). Daarna is de lumen bezaaid met cerebrale corticale astrocyten geïsoleerd van postnatale rat pups (figuur 1B-2). In tegenstelling tot tweedimensionale (2D) uitlijning technieken die afhankelijk zijn van de toepassing van elektrische velden, micropatterned groeven en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten patronen, Astrocyt uitlijning in het levende schavot techniek is gebaseerd op zelf-assemblage volgens controleerbare variabelen zoals substraat kromming (kolom-ID), celdichtheid en collageen concentratie^50,51,52. De astrocyten contract remodelleren van de collageen en verwerven een bipolaire, overlangs uitgelijnde morfologie analoog aan de natuurlijke steigers waargenomen in vivo (figuur 1B-3). Inderdaad, we actief het gebruik van deze kabel-achtige structuren nastreven als fysieke substraten voor gerichte begeleiding van onrijpe neuronen migreren, alsmede het vergemakkelijken van axonale regeneratie via het ongunstige milieu van het beschadigde centraal zenuwstelsel, met name de zoogdieren gliale litteken (Figuur 1 c). Dit artikel zal presenteren de gedetailleerde fabricage methode voor de astrocytic micro-kolommen, fase contrast en immunofluorescentie beelden van de verwachte cytoarchitecture en een uitgebreide discussie over de huidige beperkingen en toekomstige richtingen van de techniek.

Figuur 1: inspiratie, Fabrication Protocol en voorgestelde toepassingen voor de uitgelijnde Astrocytic netwerken. (A) neurobiologische inspiratie: (1) neuroblasten die afkomstig zijn uit de neurogene subventriculaire zone (SVZ) gebruiken de lengterichting uitgelijnde gliale buis in de rostraal migratoire stroom (RMS) voor de geleide overgang naar de bulbus olfactorius (OB); (2) niet-zoogdieren zoals amfibieën en vis aankunnen regeneratie na zenuwweefsel beschadigen gedeeltelijk als gevolg van de vorming van een gliale brug verbindt de uiteinden van een laesie (bijvoorbeeld verbeelde ruggenmerg) en fungeert als een steiger voor de begeleiding van regenereren axonen. (B) fabricage overzicht: (1) de bouw van een micron-sized, holle hydrogel micro-kolom met de lumen bekleed met ECM, (2) zaaien van primaire corticale astrocyten geïsoleerd van postnatale rat pups, (3) zelf-assemblage van de lengterichting georiënteerde bundels in cultuur, en (4) extractie van de bundel van het omhulsel van de biomaterial voor toekomstige implantatie studies. (C) In vivo toepassingen: (1) deze levende steigers kunnen dienen als gemanipuleerde gliale buizen voor gestuurde neuron migratie van neurogene centra aan repopulate neuron-deficiënte regio's; (2) de recapitulatie van de ontwikkelingstoxiciteit mechanisme van baanbrekende axon begeleiding en de regeneratieve mechanisme van gliale bruggen bij niet-zoogdieren kan deze astrocytic steigers met het vermogen om directe axon regeneratie over de niet-tolerante begiftigen omgeving van de zoogdieren gliale litteken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies bij de Universiteit van Pennsylvania en het Michael J. Crescenz veteranen zaken Medical Center en vastgehouden aan de richtlijnen zoals uiteengezet in de NIH Service volksgezondheidsbeleid op humaan Zorg en het gebruik van proefdieren (2015).

1. ontwikkeling van de Agarose Hydrogel Micro-kolommen

1. Maak een agarose 3% gewicht/volume (w/v) oplossing door weging van 3 g van agarose en over te dragen aan een steriele bekerglas van 100 mL Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Een steriele magnetische bar toevoegen aan het bekerglas, en plaats deze op het oppervlak van een hete plaat/roerder. Blijf het bekerglas, bedekt zodat verdamping van de inhoud in de volgende stap.
2. Verwarm de agarose en DPBS bij een temperatuur van 100 ° C en roer van 60-120 toeren per minuut. Deze instellingen desgewenst aanpassen en voortdurend toezicht op de voortgang van het proces van ontbinding de oplossing verandert in eerste instantie van dekkend naar een duidelijke weergave die betekent dat de agarose volledig is ontbonden.
   Let op: De hete bekerglas en de oplossing zijn hot!
3. Als de agarose de oplossing wordt verwarmd en geroerd, ophalen vier lege 10 cm petrischalen en Voeg 20 mL DPBS aan twee van hen. Plaats van acupunctuurnaalden (diameter: 300 µm, lengte: 40 mm), glas microliter capillaire buisjes (diameter: 701.04 µm, lengte: 65 mm, capaciteit: 25.0 µL), en een lamp dispenser binnen het biosafety kabinet. Wanneer de oplossing van vloeibare agarose ruimt, handhaven constante verwarming bij ongeveer 50 ° C en voorkom gelering van het agarose roeren.
4. Een acupunctuur-naald in de opening van de onderkant van een lamp dispenser introduceren. Plaats een capillaire buis over de naald blootgesteld aan de buitenkant. Beveilig het capillair door het deel van het aangaan van de sectie van de rubber van de lamp dispenser cilinder.
5. Breng 1 mL van vloeibare agarose met een micropipet op het oppervlak van een lege petrischaal en plaats één uiteinde van de capillaire buis verticaal (met de naald ingevoegd) contact agarose, terwijl de rubberen dop van de lamp dispenser is naar binnen wordt geknepen. Langzaam laat de druk op de lamp dispenser GLB te trekken agarose in het capillair.
   Opmerking: De overdracht van vloeibare agarose de capillaire buisjes moet snel worden uitgevoerd. Als de vloeibare agarose wordt gelaten te koelen op het oppervlak van de petrischaal voldoende tijd (ongeveer 60 s), het begint gel, voorkomen geschikt suctioning van het agarose langs de capillaire buis.
6. Plaats elke lamp-buis-naald-vergadering in een petrischaal gratis, en laat de agarose gel binnen de capillaire buisjes stollen voor 5 min. Trek voorzichtig het capillair met je handen uit de rubberstop in de lamp dispenser cilinder, verlaten van de naald en de agarose gel in plaats in de buis.
7. Handmatig uitpakken de acupunctuur-naald door langzaam te trekken uit het capillair; de nieuwe gestolde agarose cilinder ook dia's uit de buis in deze procedure, nog steeds rond de naald. Zachtjes verschuiven de micro-kolom langs de acupunctuur-naald met het topje van steriel pincet te verplaatsen naar het einde. Plaats de naald op een open, DPBS-bevattende petrischaal en de micro-kolom in de DPBS duwen met een tang.
   Opmerking: Als de agarose micro-kolom binnen de glazen capillaire buis na verwijdering van de acupunctuur-naald blijft, langzaam de agarose micro-kolom uit het capillair met een 25-mm spoorbreedte naald en duwen in de schotel met DPBS.
8. Steriliseren microscalpels of pincet met behulp van een sterilisator hete kraal. Maak 4% w/v agarose door weging van 4 g van agarose en over te dragen aan 100 mL DPBS. Warmte en roer zoals beschreven in stap 1.2 te verkrijgen van een duidelijke 4% vloeibare agarose oplossing. Handhaven van verwarming en roeren van de oplossing gedurende de volgende stappen uit.
9. Breng de petrischaaltjes met de micro-kolommen aan een dissectie kap, en een micro-kolom met een fijne Tang naar een lege petrischaal verplaatsen. Gebruik maken van de stereoscoop voor visuele begeleiding en een microscalpel om te snijden van de micro-kolommen op de gewenste lengte. Trim beide uiteinden aan formulier schuine uiteinden op 45^o hoeken van horizontaal ter vergemakkelijking van de behandeling van de micro-kolommen bij ECM en cel toevoeging.
10. Herhaal de vorige stap voor drie meer micro-kolommen in de dezelfde petrischaal en line-up van de vier constructies in parallel met een scheiding van < 3 mm tussen elk van de cilinders. Laden 50 µL van 4% agarose-oplossing met een micropipet en een streep/lijn van vloeistof giet de micro-kolom array aansluiten en de constructies in groepen van vier bundel (hierna ""micro-kolom boten"genoemd). Vermijd beweging van 4% agarose aan de uiteinden van de micro-kolommen bevatten, die de interieur, verstoppen kunnen door het minimaliseren van de afstand tussen de constructies en de agarose snel toe te voegen in een dunne lijn.
    Opmerking: Groepen van vier micro-kolommen rangschikken in "boten" is niet vereist om de astrocytic steigers fabriceren. Niettemin dienen de boten het fabricageproces te bespoedigen en te bieden een veiligere manier verplaatsen en verwerken van micro-kolommen in latere stappen.
11. Laat het afkoelen van de micro-kolom boot voor 1-2 min zodat gelering van de toegevoegde 4% agarose. Oprapen van de micro-kolom boot met fijne pincet door de aansluitende 4% agarose en de micro-kolommen verplaatsen naar de andere DPBS-bevattende petrischaal bereid in stap 1.1.3. Fabriceren van meer boten met de resterende micro-kolommen zoals gewenst.
12. Verplaats de petrischaaltjes met de micro-kolommen en/of boten een kabinet bioveiligheid en steriliseren met blootstelling aan ultraviolet (UV) licht voor 30 min.
    Let op: Draag passende bescherming om te voorkomen dat blootstelling aan UV.
13. De gerechten met de micro-kolom boten in DPBS bij 4 ° C, worden opgeslagen als ECM toevoeging en cel beplating zal niet onmiddellijk optreedt tot 1 week daarna. Herhaal de stappen van de micro-kolom fabricage als de constructies niet tijdens deze periode gebruikt worden.

2. primaire celculturen en isolatie

1. Corticale Astrocyt isolatie van rat pups
   1. Ter voorbereiding van de volgende stappen uit, Voeg 20 mL Henks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) aan vier 10 cm petrischalen die als reservoirs voor de ontleed weefsels dienen zal. Houd alle gerechten op het ijs. Steriliseren schone chirurgische schaar, pincet, micro-spatel en micro-scalpels in een sterilisator hete kraal.
   2. 0,25% trypsine met 1 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en 0,15 mg/mL deoxyribonuclease (DNase) prewarm ik in HBSS bij 37 ° C. Daarnaast prewarm het kweekmedium Astrocyt bij 37 ° C, die van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met de Ham F-12 nutriënt mengsel en 10% foetale runderserum (FBS) bestaat.
   3. Anesthetize van postnatale dag 0 of 1 dag Sprague-Dawley ratten pups door hen bloot te stellen aan hypothermic voorwaarden en euthanaseren door onthoofding. PIN het hoofd in een podium met een 19 mm gauge naald in de snuit anterior to de ogen geplaatst.
   4. Maak een incisie met een scalpel in het midden posterieure aan anterior, vanaf de basis van de nek tot net achter de ogen. Een andere snede lateraal gaande van direct achter de ogen naar beneden, vorming van een T-vorm uitvoeren. Gebruik fijne Tang te trekken van de craniale huid/schedel uit naar de kant.
   5. Houd het hoofd door de snuit (naar boven) door het plaatsen van één van de pinnen van de verlostang in de mond van het dier en anderzijds op het buitenoppervlak. Verwijderen van de hersenen met een steriele micro-spatel en plaats deze in een van de petrischaaltjes gevuld met gekoeld HBSS. Plaats deze petrischaal op ijs keer onmiddellijk daarna en helemaal behalve wanneer in gebruik.
   6. Een granieten blok eerder opgeslagen bij-20 ° C onder een stereoscoop binnen een dissectie kap te situeren. Plaats de petrischaal met de hersenweefsel op het oppervlak van het graniet blok aan de lage temperatuur behouden tijdens de dissectie-procedure. Gebruik de stereoscoop als visuele begeleiding volgt.
   7. Als de bulbus bollen intact blijven, pakt u hen door te snijden met pincet of microscalpels. Daarnaast gebruiken een microscalpel te verwijderen van het cerebellum en een middellijn insnijding scheiding van de twee hersenhelften. De hemisferen met een tang aan een petrischaal met verse, gekoelde HBSS overdragen.
   8. Ontleden de veroorzaakt structuren uit de binnenkant van de hemisferen met een microscalpel te verkrijgen alleen de gescheiden cortices. Gebruik fijne pincet schil van de hersenvliezen, een blad-achtige structuur, af van de corticale weefsel en de geïsoleerde cortices overbrengen naar een nieuwe petrischaal met koude HBSS. Gebruik de microscalpel om het weefsel mince teneinde de oppervlakte voor trypsine actie in de volgende stap.
   9. Gebruik een pipet van Pasteur naar de cortices overbrengen in een tube van 15 mL centrifuge met 4 mL voorverwarmde trypsine-EDTA (8 cortices in elke buis). Blootstellen van de corticale weefsel trypsine-EDTA gedurende 5-7 minuten bij 37 ° C.
   10. Met een pipet van Pasteur, zorgvuldig verwijderen van de trypsine-EDTA en Voeg 400 µl van 0,15 mg/mL DNAse ik oplossing voor de centrifugebuis. De buis of vortex doorroeren totdat al het weefsel is losgekoppeld en er geen resterende weefsel stukken in de vloeistof zijn. Als het is niet mogelijk om volledig los op het weefsel, verwijdert u de resterende fragmenten met het puntje van een pipet van Pasteur.
   11. Centrifuge de buis met de gedissocieerde cell oplossing bij 200 x g gedurende 3 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet van Pasteur zonder verstoring van de cellen. Voeg 1 mL Astrocyt kweekmedium (gedefinieerd in stap 2.1.2) aan de buis met een micropipet en agitate resuspendeer en maken een homogene oplossing.
   12. Astrocyt kweekmedium met een serologische pipet 10 mL overbrengen in een maatkolf van T-75. Voeg 250 µl van de 1 mL cel oplossing (bereid in stap 2.1.11) met een micropipet aan de maatkolf aan één pup hersenen waard van cellen per kolf plaat. De ontslagen cell oplossing gelijkmatig verdelen over het kweekmedium en zachtjes doorroeren de kolf om een gelijkmatige verdeling verder te bevorderen.
   13. Cultuur van de vergulde kolven in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO₂. Na het bereiken van de 24 en 72 h in cultuur, mechanisch doorroeren de kolf als u wilt loskoppelen van de niet-aanhanger celtypen, zoals neuronen en oligodendrocyten.
   14. Daarna, op elk van deze timepoints, uitvoeren van een verandering van de media. Houd de kolf verticaal zodat de voedingsbodems op de bodem van de kolf ligt, niet over de zelfklevend cellen. Gecombineerd het kweekmedium met een pipet van Pasteur, op het uiteinde van de pipet tegen de benedenhoek van de kolf om te voorkomen dat het uitpakken van de cellen te drukken. Plaats de kolf in de oorspronkelijke, horizontale positie en voorzichtig 10 mL Astrocyt voedingsbodem toe te voegen over de gewenste cellen met een serologische pipet.
   15. De kolven terugkomen met de incubator na elke wijziging van de media. Na 90% confluentie wordt bereikt, mechanisch doorroeren de erlenmeyer nogmaals als u wilt verwijderen van alle resterende niet-naleven van cellen.
   16. De astrocyten passage door het nemen uit het kweekmedium met een stofzuiger en een pipet van Pasteur. Voeg 5 mL van 0,25% trypsine-EDTA met een serologische pipet over de zelfklevend cellen. Zachtjes doorroeren de kolf om ervoor te zorgen dat de trypsine dekt alle cellen en Incubeer de kolf gedurende 5-7 minuten bij 37 ° C en 5% CO₂.
   17. Doven trypsine door toevoeging van 1 mL van Astrocyt medium aan de cellen met een serologische pipet. Pak de cell oplossing uit de kolf met een serologische pipet en overbrengen naar een centrifugebuis steriele 15 mL. Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 3 minuten.
   18. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een serologische pipet en resuspendeer het in 1 mL Astrocyt kweekmedium. De buis om ervoor te zorgen dat de cel oplossing is homogeen doorroeren. Het aantal cellen in de oplossing met een hemocytometer of een automatische cel teller.
       Opmerking: Een kolf thats 90% heuvels meestal levert ongeveer 3 miljoen astrocyten.
   19. Voeg 10 mL van de Astrocyt kweekmedium over in een maatkolf van T-75. Voer een verdunning 1:4 door de overdracht van 250 µl van de cel-oplossing (stap 2.1.18) met een micropipet aan de T-75 kolf al met kweekmedium. Zachtjes doorroeren zodat een homogene cel distributie in het oppervlak van de kolf.
   20. Herhaal stappen 2.1.16-2.1.19 telkens 90% confluentie is bereikt om de passage van de cellen.
2. Corticale Neuron isolatie van Rat foetussen
   1. Volgen van dergelijke preparaten als stap 2.1.1 en 2.1.2, met de uitzondering dat de prewarmed media mede cultuurmedia is, bestaande uit Neurobasal middellange + 2% B-27 supplement (neuronen) + 1% G-5 serumvrij supplement (astrocyten) + 0,25% L-glutamine.
   2. Euthanaseren getimede-zwangere embryonale dag 18 Sprague-Dawley ratten met kooldioxide verstikking en bevestigen van dood door onthoofding.
   3. Pak de rat foetussen en ontleden van de cortices van de rest van de cerebrale weefsel in petrischalen met HBSS op het oppervlak van het gekoeld graniet blok, met behulp van een stereoscoop voor visuele begeleiding en gesteriliseerde schaar, microscalpel en pincet⁵³ . Na de opeenvolgende dissectie van de hoofden, de hersenen, de hersenhelften, en de cortices, door elk weefsel te overbrengen in een nieuwe HBSS gevulde petrischaal.
   4. Mince de corticale weefsel in kleinere fragmenten te verhogen van de oppervlakte voor trypsine. Overdracht 4-6 cortices met een Pasteur Pipetteer tot een koker met 5 mL trypsine-EDTA voorverwarmde en bij 37 ° C te distantiëren van het weefsel te handhaven. Op 5-7 minuten doorroeren handmatig de buis om te mengen en te voorkomen dat het samendoen van het weefsel.
   5. Verwijder de buis uit 37 ° C na 10 min. Zoals eerder beschreven in stap 2.1, pak de trypsine-EDTA en vervangen door 1.8 mL 0,15 mg/mL DNAse oplossing. Daarna, vortex het weefsel tot de oplossing verschijnt homogene, met geen weefsel fragmenten in de vloeistof zweven.
   6. Centrifugeer de gedissocieerde weefsel oplossing bij 200 x g gedurende 3 minuten. Na het verwijderen van de bovendrijvende substantie, resuspendeer in 2 mL zuiver co kweekmedium. Het aantal cellen in deze oplossing met een hemocytometer of een automatische cel teller.
      Opmerking: De gebruikelijke opbrengst is 3.0-5.0 x 10⁶ cellen/corticale halfrond.
   7. Bereid een nieuwe cel-oplossing met een dichtheid van 2.0-4.0 x 10⁵ cellen/mL in de co voedingsbodems hierboven omschreven.

3. ontwikkeling van de Astrocytic kabels in de Micro-kolommen

1. ECM kern fabricage
   Opmerking: De ECM dient te worden toegevoegd aan de binnenzijde van de hydrogel micro-kolommen op dezelfde dag in die cel zaaien zal worden uitgevoerd.
   1. Binnen een bioveiligheid kabinet, bereiden een 1 mg/mL oplossing van de staart van de rat controletype I collageen in co kweekmedium in een steriele microcentrifuge buis. Het handhaven van de buis van de microcentrifuge met de ECM-oplossing op ijs te allen tijde behalve wanneer in gebruik.
   2. Breng 1-2 µL van het ECM-oplossing met een micropipet op een strook van lakmoespapier schatting van de pH. Voeg 1 µL van 1 N natriumhydroxide (NaOH) of zoutzuur (HCl) met een micropipet verhogen of verlagen de pH van de ECM-oplossing, respectievelijk, en Pipetteer omhoog en omlaag om te homogeniseren. Controleer of de nieuwe pH met een strook van lakmoespapier en voeg meer zuur of base, desgewenst, totdat de pH stabiel in de 7.2-7.4 scala is.
   3. De petrischaaltjes uit stap 1.2 naar een dissectie kap en 4-5 micro-kolommen of een boot met een steriele fijne Tang overdragen aan een leeg, steriel 35 of 60 mm petrischaal. Met behulp van de stereoscoop voor begeleiding, situeren de tip 10 µL van een micropipet aan het ene uiteinde van elk micro-kolom en de zuiging legen van de lumen van DPBS en lucht bubbels. Het ontbreken van luchtbellen bevestigen met de stereoscoop om ervoor te zorgen dat de ECM toegevoegd in de volgende stap in het lumen vrij kan stromen.
   4. Laad een P10-micropipet met ECM-oplossing, plaats de 10 µL tip tegen één uiteinde van de hydrogel micro-kolommen en leveren genoeg oplossing om te vullen de lumen (ongeveer 3-5 µL), de vermelding van ECM met de stereoscoop observeren. Pipetteer een klein reservoir (2-4 µL) van ECM-oplossing aan beide kanten van de micro-kolom.
      Opmerking: Slaagt er altijd in 4-5 micro-kolommen of een boot op een moment om te voorkomen dat verlengd drogen van de constructies, aangezien dit resulteren kan in het verfrommelen van de micro-kolom structuur. Volledig gedroogde micro-kolommen steek stevig op het oppervlak van de petrischalen, waardoor hun gebruik voor het zaaien van de cel. Buitensporige hoeveelheid CO voedingsbodems (als een maatregel van de hydratatie) niet worden toegevoegd aan de micro-kolommen, omdat dit leiden de ECM tot kan te stromen uit tijdens de incubatieperiode hieronder beschreven.
   5. Pipetteer co voedingsbodems in een ring rond de petrischaal te voorzien van een gootsteen van de vochtigheid om te voorkomen dat de kolommen uitdroogt tijdens de incubatie. Incubeer de petrischaal met de ECM-bevattende micro-kolommen bij 37 ° C en 5% CO₂ voor 1 h ter bevordering van de polymerisatie van collageen alvorens toe te voegen de neuronen en/of de astrocyten.
      Opmerking: De ECM moet vormen een laag coating van de binnenzijde van de holle lumen, in plaats van een solide ECM kern omvat het interieur, die beide kunnen worden waargenomen met behulp van de stereoscoop. Als de ECM een kern vormt, blijven de incubatietijd totdat alleen de laag wordt overgelaten. Met deze laag gevormd, de Astrocyt cell oplossing kan het vullen van het interieur van de micro-kolom in de beplating stappen.
   6. Tijdens de incubatietijd, de Astrocyt cell oplossing te bereiden (zoals hieronder beschreven).
2. Astrocyt en Neuron zaaien in de Micro-kolommen
   1. Passage de vergulde astrocyten (tussen de vierde en twaalfde passage) zoals beschreven in stappen 2.1.16-2.1.19. Na het tellen van het aantal cellen in de kolf, bereiden cell oplossing bij een dichtheid van 9.0-12,0 x 10⁵ cellen/mL oplossing geschorst in celkweek media.
   2. Met behulp van een stereoscoop, plaats het uiteinde van een P10-micropipet aan het ene uiteinde van de micro-kolommen, en breng voldoende cell oplossing (~ 5 µL) in het lumen volledig om het te vullen. Hierboven gedaan met de ECM, kleine reservoirs van cell oplossing toevoegen aan beide einden van elke micro-kolom.
   3. Incubeer de vergulde micro-kolommen op de petrischaaltjes bij 37 ° C en 5% CO₂ voor 1 h ter bevordering van de gehechtheid van astrocyten aan de ECM. Als neuronen zal niet aan micro-kolommen worden toegevoegd, gaat u verder met stap 3.2.5.
   4. Na de eerste incubatietijd, voeg 1-2 µL van de verkregen in stap 2.2.7 in beide uiteinden van de micro-kolommen met een micropipet, met inachtneming van onder de stereoscoop corticale neuron-oplossing. Zorg ervoor dat voldoende media aanwezig zijn in de gerechten te voorkomen drogen, en opnieuw Incubeer gedurende 40 minuten bij 37 ° C en 5% CO₂ te maken voor de hechting van neuronen.
      Opmerking: Corticale neuron oplossing kan ook worden toegevoegd 1-2 dagen na de vorming van de bundel, het uitvoeren van stap 3.2.4 na het zorgvuldig verwijderen van de voedingsbodems van de petrischaal met een micropipet.
   5. Na de incubatie periode, zorgvuldig vullen de petrischaaltjes met de vergulde micro-kolommen met 3 of 6 mL co voedingsbodems voor 35 of 60 mm petrischalen, respectievelijk. Handhaven van de vergulde micro-kolommen in cultuur bij 37 ° C en 5% CO₂ ter bevordering van de zelf-assemblage van de uitgelijnde astrocytic bundels, die een gebundelde, kabel-achtige structuur na 6-10 h moeten vormen.
3. Stabilisatie van de Astrocyt kabel het platform
   Opmerking: Voer de volgende stappen uit om te voorkomen dat de ineenstorting van de uitgelijnde structuur van de astrocytic steigers na vorming van bundels, ongeveer 6-12 h van de constructies, kweken.
   1. In een steriele microcentrifuge buis, bereiden een 3 mg/mL collageen voor de staart van de rat ik oplossing in co cultuurmedia. Breng de pH van de oplossing voor 7.2-7.4 na de procedure die wordt beschreven in stap 3.1.2. Handhaven van de collageen voorraad en co cultuur media op het ijs wanneer niet in gebruik, en plaats de oplossing bereid collageen op ijs te allen tijde.
   2. Verwijder het medium van de petrischalen met het astrocytic steigers met een micropipet, waardoor sommige media aan de zijkanten van de schotel te maken een vochtigheid-sink die zorgt voor de hydratatie van de micro-kolommen. Zet de schotel onder een stereoscoop voor hulp in visualisatie.
   3. Nemen met een micropipet, 2-3 µL van collageen oplossing en geen kwijting aan elk uiteinde van de micro-kolommen, met behulp van de stereoscoop voor visuele begeleiding. Zorg ervoor dat de schotel heeft voldoende media rond de zijkanten om op te treden als een gootsteen van de luchtvochtigheid rond de randen van de schotel. Incubeer de petrischaaltjes met de micro-kolommen gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO₂ in een bevochtigde incubator ter bevordering van de gelering van de nieuw toegevoegde collageen.
   4. Langzaam voeg 3 of 6 mL co voedingsbodems (voor 35 of 60 mm Petri gerechten, respectievelijk) op de Petri gerechten met een pipet en cultuur van de gerechten in een bevochtigde incubator op 37 ^oC en 5% CO₂.

4. extractie van de Astrocytic bundels van de Hydrogel-interieur

1. Glazen coverslips in een autoclaaf steriliseren. Bereid een 20 µg Mo/mL oplossing van poly-L-lysine (PLL) in steriele cel cultuur rang water.
2. Binnen een bioveiligheid kabinet, handmatig de gesteriliseerde glas coverslips overbrengen in een steriele 10 cm petrischaal, en voeg voldoende PLL oplossing ter dekking van de coverslips.
3. Incubeer de coverslips, bedekt met de PLL-oplossing, gedurende 30 minuten bij 37 ° C jas van het oppervlak. De PLL-oplossing met een pipet van Pasteur verwijderen na 30 min. spoelen, wordt driemaal door cel cultuur rang water aan het dekglaasje aan toe te voegen en te verwijderen met een pipet van Pasteur.
4. Na de vorming van de uitgelijnde gliale bundel, overbrengen in de micro-kolom fijn een steriele petrischaal met een steriele fijne Tang, en voeg een klein zwembad voor 10 µL van co voedingsbodems met een micropipet ter voorkoming van uitdroging en zorgen van de gezondheid van de bundel. Pak de astrocytic bundel uit de hydrogel micro-kolom door zachtjes te trekken van de ene kant met een steriele chirurgische Tang, met behulp van een stereoscoop voor visuele begeleiding.
5. Houd de astrocytic bundel met een tang en monteren op een PLL beklede dekglaasje aan. Vast en vlekken met het protocol hieronder.

5. immunocytochemie voor In Vitro Studies

Opmerking: Voor deze studie, de primaire antilichamen zijn konijn anti-gliale zure fibrillary eiwit (GFAP) (1:500), anti-β-tubuline III (1:500) muis, konijn anti-collageen I (1:500), muis, anti-nestin (1:200) en konijn anti-vimentin (1:100). De secundaire antilichamen waren ezel anti-muis 568, ezel anti-konijn 568, ezel anti-konijn 488 en ezel-antimuis 568 (1:500 voor iedereen). In alle gevallen, genoeg volume van elke oplossing volledig voor de micro-kolommen toevoegen.

1. Bereid een 4% volume/volume (v/v) formaldehyde oplossing in 1 x DPBS binnen een chemische zuurkast.
   Let op: formaldehyde is een giftige stof bekend is dat zij kankerverwekkend zijn, en moet worden verwijderd in een afzonderlijke container. Altijd deze verbinding binnen een chemische zuurkast manipuleren en gebruiken van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) zoals laboratorium jas, veiligheidsbril en handschoenen.
2. In het geval van de micro-kolommen, gooi de media van de cultuur van de petrischaaltjes met de constructies met een pipet van Pasteur zonder per ongeluk het suctioning van de hydrogel cilinders. Voeg voldoende formaldehyde oplossing ter dekking van de micro-kolommen of de gekoppelde coverslips (die beide blijven op de petrischaaltjes) en incubeer gedurende 35 min bij 18-24 ° C.
3. Haal de 4,0% formaldehyde oplossing uit de vaste micro-kolommen of de coverslips met een serologische pipet. Spoel driemaal met PBS de vaste micro-kolommen door snel toevoegen en verwijderen van PBS tweemaal en dan laten ze weken voor 10 min een derde keer.
4. Ontbinden normale paard serum (NHS) in PBS voor een concentratie van 4% v / v. voorbereiden een oplossing met niet-ionogene wasmiddel in een concentratie tussen de 0,3% v/v met behulp van de NHS oplossing als het oplosmiddel.
5. Verwijder de PBS uit de petrischaaltjes met de micro-kolommen of de coverslips met een pipet. Voeg voldoende 0,3% reinigingsmiddel ter dekking van de micro-kolommen/coverslips voor 60 min bij 18-24 ° C tot permeabilize van de cellen.
6. Nemen de schoonmaakmiddel en spoel snel twee keer met PBS en driemaal door inweken voor 5 min. berekenen het vereiste volume van 4% NHS en elk van de primaire antilichamen te bereiden van een oplossing met de gewenste antilichaam concentraties.
7. Verwijder de PBS uit de petrischaaltjes en voeg voldoende primair antilichaam (verdund in 4% NHS-DPBS) oplossing ter dekking van de micro-kolommen of de uitgepakte astrocytic bundels. Incubeer overnachting (12-16 h) bij 4 ° C.
8. Neem de primair antilichaam-oplossing en snel spoel tweemaal met PBS en driemaal door inweken gedurende 5 minuten elk. Bereid de oplossing van secundair antilichaam, in het donker, met elke antilichaam aanwezig bij een verdunning 1:500 4,0% NHS oplossing.
9. Incubeer de cellen met de oplossing van secundair antilichaam voor 2 h bij 18-24 ° C. Gedurende de gehele tijd van de incubatie, betrekking hebben op de petrischaaltjes met de micro-kolommen met aluminiumfolie om te voorkomen dat blootstelling aan licht.
10. Verwijder de secundair antilichaam-oplossing en voeg van Hoechst oplossing (1:10, 000) gedurende 10 minuten bij 18-24 ° C tot vlek de kernen.
    Let op: Hoechst is een bekende mutagene stof die als kankerverwekkend te worden ingedeeld moet worden behandeld. Dus het moet worden verwijderd in een afzonderlijke container en PPE dient te allen tijde bij het bewerken van deze agent.
11. Spoel met PBS vijf keer, telkens gedurende 5-10 minuten daarna, de gekleurde micro-kolommen bij 4 ° C op te slaan in PBS en bedek met de aluminiumfolie. In het geval van de gemonteerde astrocytic bundels, voeg een druppel van waterige montage medium aan de bundel, plaatst u een ander glas dekglaasje aan boven de vaste bundel en verzegelen van beide coverslips met nagellak voor langdurige opslag en daaropvolgende beeldbewerking.

6. levensvatbaarheid Assay met Live-dode (calceïne-AM/ethidium Homodimer) Staining

1. Bereid de reagens oplossing door toevoeging van 5 µl calceïne AM (4 mM in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO)) en 20 μl ethidium homodimer-1 (EthD-1) (2 mM in DMSO/H₂O 1:4 v/v) tot 10 mL van de 1 x DPBS. Dekking van de oplossing met aluminiumfolie of op te slaan in het donker te beschermen tegen het licht.
2. Media uit de petrischaal met de vergulde micro-kolommen met een pipet van Pasteur gecombineerd en voeg voldoende oplossing (bereid boven) ter dekking van de constructies. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO₂, de petrischaal bedekt ter bescherming van de oplossing van het licht te houden.
3. Verwijder de oplossing met een micropipet of de Pipet van Pasteur. Spoel 2 - 3 keer met DPBS zoals beschreven in stap 5.3. Overgiet de petrischaaltjes met DPBS volgens de grootte van de schotel. Afbeelding cellen onmiddellijk daarna met behulp van epifluorescence of confocal imaging.
   Opmerking: Omzetting van de membraan-permeabele calceïne AM aan calceïne door metabolisch actieve cellen levert de groene fluorescentie calceïne. Dode cellen zijn gemarkeerd als membraan-gecompromitteerd cellen, die het mogelijk maken van de binnenkomst van EthD-1 in de cel en zijn binding aan nucleïnezuren, rode fluorescentie veroorzaken.

Representative Results

Aanvankelijk, fase contrast microscopie werd gebruikt om de progressie van Astrocyt hechting en bundel vorming en de algehele stabiliteit van de cytoarchitecture als functie van de tijd te controleren. 1 uur na de beplating bleken de astrocyten in het lumen van de micro-kolommen met een sferische morfologie (figuur 2A). 5 h, astrocyten begon uitbreiding van processen en contracten, terwijl door 8 h cellen tentoongesteld van een volledig proces-bevattende morfologie en kabel-achtige structuren georiënteerde langs de longitudinale as van de micro-kolom (figuur 2A) gevormd. Met name ten opzichte van de aanvankelijk verspreide aanwezigheid van cellen in de micro-kolommen, astrocyten leek te hebben uitbesteed aan het vormen van een netwerk van dichte bundels langs het interieur (figuur 2B). Na de eerste Celuitlijning, de netwerken van de Astrocyt vaak trok samen langs de longitudinale as, die lijkt op een rits sluiting, vormen een dichte bundel in het midden van de micro-kolom (figuur 2C). De vorming van deze gebundelde architectuur moest een zelf-assemblage proces, deels ingegeven door de keuze van de micro-kolom-ID en cel dichtheid. Astrocyten uitgelijnd en verworven van een bipolaire morfologie wanneer zaadjes in micro-kolommen met een ID van minder dan 350 µm (figuur 3B, bovenste en middelste, en 3D-3F)⁴⁹. Integendeel, deze cellen willekeurige directionaliteit aangetoond wanneer een ID van 1 mm werd gebruikt (figuur 3B, bodem), die is vergelijkbaar met de verschijning van 2D Astrocyt culturen blootgesteld aan de serumvrij, mede cultuur medium (figuur 3A, rechts). Bovendien, hoewel astrocyten nog steeds weergeven uitlijning op lage seeding dichtheden (2.0-3.0 x 10⁵ cellen/mL of 2.0-3.0 x 10² cellen/mm³) (Figuur 3 c), dichte netwerken alleen op de hoge dichtheid (9.0-12.0 worden gevormd x 10⁵ cellen/mL of 9.0-12,0 x 10² cellen/mm³) binnen cilindrische micro-kolommen met vergelijkbare afmetingen (gezien in figuur 3B, bovenaan), zoals voorgesteld in de protocol-⁴⁹. Levensvatbaarheid in de astrocytic bundels werd gekwantificeerd, aan de hand van het leven/dood assay, als de verhouding van het oppervlak van cellen oplichtende groen (calceïne AM) ten opzichte van de totale oppervlakte van cellen oplichtende groen (calceïne AM) en rood (EthD-1). De levensvatbaarheid van de astrocytic bundels was 97,4%, die vergelijkbaar is met de levensvatbaarheid van de 98,2% van 2D Astrocyt cultuur besturingselementen (figuur 4A-4B), waaruit blijkt dat het milieu binnen de micro-kolommen geschikt voor Astrocyt vitaliteit ( is Figuur 4E). De 3D-reconstructies van de levende en dode cellen in de steigers van astrocytic tonen ook de algehele Celuitlijning binnen de constructies (figuur 4C-4 D). Bovendien, werden ultra lange astrocytic micro-kolommen ontwikkeld om de stabiliteit van de Astrocyt bundels met aanzienlijke lengte onderzoeken. Zelfs op de buitengewone afstand van 3,5 cm, de cytoarchitecture van uitgelijnd, dichte en gecontracteerde astrocytic bundels was consequent volgehouden door de lengte van de micro-kolom (figuur 5A), zo duidelijk gezien in de regio's zoom-in van de Micro-kolommen (figuur 5B-5 C).

Eenmaal gevormd, de bundels waren vastgesteld en gekleurd door immunocytochemie technieken voor tussenliggende gloeidraad eiwitten karakteristiek van gliale cellen, zoals algemeen kaderakkoord voor vrede, nestin en vimentin. De confocal beelden bevestigen de proces-bevattende morfologie van astrocyten en longitudinale uitlijning van processen (Figuur 6 en Figuur 7). Expressie van de tussenliggende gloeidraad eiwitten kan worden gezien in zowel de 2D Astrocyt culturen (figuur 7A) evenals de Astrocyt bundels binnen de micro-kolom (Figuur 6, figuur 7B-7 D). Bovendien, bevestigd collageen kleuring van de aanwezigheid van deze ECM-eiwit in de micro-kolommen. De astrocyten vormden geen een continue structuur met de collageen als gekweekt in een 2D omgeving (figuur 8A), terwijl de astrocyten leek te voldoen aan en het remodelleren van de collageen aanwezig binnen de lumen wanneer gekweekt in de micro-kolommen, waardoor voor samentrekking en bundel celvorming (Figuur 8). Overlay van het algemeen kaderakkoord voor vrede en collageen kanalen aangetoond dat de Astrocyt kabels bestond uit strak bijbehorende processen met longitudinale collageenvezels (Figuur 8). Dus naast het aanbieden van anchorage, hebt collageen fibrillen ook verstrekt extra directionele signalen voor astrocyten vormen dichte bundels na contractie. In sommige gevallen Astrocyt-collageen contractie persistent gemaakt, resulterend in een ineenstorting van de uitgelijnde bundel van meer dan 12-24 uur na de vorming (figuur 9A). Om te stabiliseren van de kabel-achtige Astrocyt architectuur binnen de hydrogel micro-kolommen, is extra collageen matrix toegevoegd aan de uiteinden van een volledig gevormde bundel remmen verdere contractie en samenvouwen. Dit versterking techniek toegestaan voor het voortbestaan van de gewenste kabel architectuur gedurende ten minste 4 dagen, met een langere venster van stabiliteit verwacht (figuur 9B). Bovendien, representatieve astrocytic bundels werden gewonnen uit de hydrogel micro-kolom gemonteerd en bevestigd met 4% formaldehyde op glas coverslips aan het beoordelen van hun robuustheid wanneer blootgesteld aan de krachten van de spanning en het externe milieu. Zelfs na extractie en fysieke manipulatie in verschillende vormen (figuur 10A, 10B), de astrocytic waarin en processen onderhouden een uitgelijnd, gebundeld micro-schaal morfologie (Figuur 10 c), markeren de veerkracht van de zelf-gebonden astrocytic steiger, eenmaal gevormd, zelfs als de structurele steun van de hydrogel micro-kolom afwezig is.

Primaire corticale neuronen waren ook mede gekweekt met astrocyten binnen de micro-kolommen om te onderzoeken of de Astrocyt bundels konden stimuleren van neuronale hechting en een uitvloeisel van de neurite. GFAP en het eiwit microtubulus β-tubuline III werden gebruikt als specifieke markers voor astrocyten en neuronen, respectievelijk. Figuur 11 toont aan dat astrocyten mede bezaaid met corticale neuronen ook geschikt waren voor het tentoonstellen van processen en vormen uitgelijnd bundels. Neuronen leek te hebben gehouden bij voorkeur aan de Astrocyt bundels, sinds alle positieve β-tubuline III kleuring mede gelokaliseerd met GFAP (overlays in Figuur 11-11 C). Om aan te tonen de regeneratieve eigenschappen van de astrocytic constructies, corticale neuronen (figuur 12B) werden bekleed binnen de hydrogel micro-kolom 2 dagen nadat de astrocyten waren verguld (figuur 12A). Neuronen verbonden aan de Astrocyt bundel en uitgebreid neurites direct langs de astrocytic traktaten. Nadere inspectie bleek neurite uitgroei georiënteerd in de richting van de astrocytic kabel, overwegende dat in regio's waar de tractus Astrocyt niet aanwezig was, werden de neurites gezien groeien in een ongeorganiseerd wijze (figuur 12C). Deze waarnemingen tonen aan dat het protocol leidt tot uitgelijnd, levensvatbare en robuuste astrocytic netwerken die het potentieel om op te treden als implanteerbare levende trajecten bevordering van neuron hechting en neurite uitgroei hebben.

Figuur 2: helderveld microscopie toont vorming van Astrocyt bundels binnen Hydrogel Micro-kolommen mettertijd. (A) Astrocyt morfologie als functie van de tijd na de beplating: (1 h) astrocyten zijn sferisch in vorm en verspreid gedurende de constructie; (5 h) astrocyten initiëren proces uitbreiding en inkrimping; (8 h) astrocyten zijn uitgelijnd en gecontracteerd. Schaal bars = 100 µm. (B) bundel vorming na verloop van tijd in een extra vertegenwoordiger steiger: (1 h) in eerste instantie de astrocyten zijn bolvormig en geen vertonen processen; (24u) een dichte bundel van astrocytic processen wordt gevormd. Schaal bars = 300 µm (links) en 500 µm (rechts). (C) volledig gevormd astrocytic bundel 24 h na beplating, tonen een "dichtdoen"-effect, waar de uiteinden van de kabel aan verschillende uiteinden van de muren van de lumen. Schaal bar = 1000 µm.

Figuur 3: Micro-kolom binnendiameter en cel dichtheid invloed de zelf-assemblage van uitgelijnde bundels van bipolaire astrocyten. (A) 2D Astrocyt culturen met serum-bevattende media (links) en serumvrij co voedingsbodems (rechts) tonen de morfologie van een niet-proces en multi-proces invloed, respectievelijk. Schaal bars = 100 µm. (B) astrocyten zaadjes bij hoge dichtheid (9.0-12,0 x 10⁵ cellen/mL) in micro-kolommen met een ID van 180 en 350 µm formulier uitgelijnd bundels ten opzichte van de lengteas, terwijl een ID van 1 mm resultaten in astrocyten weergeven, meerdere unaligned processen in de gehele van de diameter van de lumen. Schaal bars = 100 µm (boven, midden) en 150 µm (onder). (C) astrocyten zaadjes in een 350 µm micro-kolom ID bij lage dichtheid (2.0-4.0 x 10⁵ cellen/mL) zijn uitgelijnd, maar niet wordt geleverd. Schaal bar = 100 µm. (D) bij het uitplaten in een 350 µm micro-kolom ID op lage of middelgrote celdichtheid, astrocyten verwerven een bipolaire morfologie. Schaal bars = 300 µm. (E) vak in D een zoom-in van de ketens van bipolaire astrocyten tonen van dat formulier in de hydrogel micro-kolommen. Schaal bar = 300 µm. (F) voorbeeld van een individuele bipolaire Astrocyt. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: astrocyten levensvatbaar blijven na bundel vorming binnen de Hydrogel Micro-kolom. (A-B), (C-D) 3D-confocale reconstructies toont de levensvatbaarheid van de cellen in de hele vlakke culturen en uitgelijnde astrocytic bundels, respectievelijk, zoals vehiculumcontrolegroep met calceïne-AM/ethidium homodimer kleuring (groen-wonen cellen; rood-dode cellen). (E) kwantificering van levende en dode cellen resulteerde in een vergelijkbaar percentage van leven/dood astrocyten bij gekweekt op 2D oppervlakken en in de micro-kolommen. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: fase Contrast foto van een representatieve ultra lange uitgelijnde Astrocytic bundel binnen de Hydrogel Micro-kolom. (A) bundel vorming gedurende de hele lengte van een 3,5 cm micro-kolom. Schaal bar = 1.000 µm. (B-C) hogere vergroting zoom-ins weergegeven: Astrocyt uitlijning in verschillende regio's langs de totaliteit van de constructie, overeenkomt met de vakken in A. Schaal bars = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: Immunolabeling van de Astrocytic steigers toont de longitudinale uitlijning van Astrocytic processen. (A) Confocal reconstructie van een astrocytic bundel tonen kleuring voor GFAP (rood; links) en kernen (Hoechst; midden) en een deken van beide kanalen (rechts). (B) hogere vergroting zoom-in van de astrocytic bundel in de vakken regio in A toelaat visualisatie van de cytoarchitecture van de astrocyten binnen micro-kolommen. Schaal bars = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: karakterisering van representatieve Astrocytic bundels door middel van immunocytochemie. (A-B) Astrocyten gekweekt op 2D oppervlakken en zaadjes in hydrogel micro-kolommen express soortgelijke astrocytic markers GFAP (rood) en vimentin (groen). (A) Confocal reconstructie van een 2D platte Astrocyt cultuur met de aparte en samengevoegde kanalen. Schaal bar = 100 µm. (B) Confocal beelden van een astrocytic bundel, bevestiging van de expressie van de markers en presentatie van Astrocyt uitlijning. Schaal bar = 50 µm. (C-D) astrocyten gekweekte binnen micro-kolommen ook uitdrukkelijk de tussenliggende gloeidraad eiwitten nestin (rood) en vimentin (groen). (C) Confocal afbeelding van een astrocytic bundel. Schaal bar = 100 µm. (D) hogere vergroting zoom-in van C. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: astrocyten bij de uitgelijnde bundels nauw samenwerken met een gecontracteerde, longitudinale collageen Matrix, in tegenstelling tot de onregelmatige rangschikking van collageen in 2D culturen. Cellen werden immunolabeled te observeren astrocyten (GFAP; rood), kernen (Hoechst; blauw) en collageen (groen). (A) 2D Astrocyt culturen met collageen bij 1 mg/mL tonen unaligned astrocyten en willekeurig verdeelde collageen. Schaal bar = 250 µm. (B) collageen is trok van de wanden van de micro-kolom lumen en is uitbesteed aan het vormen van een uitgelijnde matrix die deel uitmaakt van de astrocytic bundel. Schaal bar = 150 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: extra collageen kan worden gebruikt om de structuur van Astrocytic kabels stabiliseren. (A) bundels gevormd ongeveer 6 h na plating astrocyten binnen collageen beklede hydrogel micro-kolommen. Zodra bundels werden gevormd, werd hogere concentratie (3 mg/mL) collageen toegevoegd aan de uiteinden van de micro-kolom voor de remming van de samentrekking van de astrocytic kabels. De astrocytic-collageen bundels was begonnen met het contract door 18 h in constructies niet gestabiliseerd met extra collageen, en de Astrocyt kabels was volledig ingestort door 24 h. Deze contractie werd niet waargenomen wanneer de bundels werden versterkt met 3 mg/mL collageen. Schaal bar = 1.000 μm. (B) Zoom-in van samengevouwen astrocytic bundel niet versterkt met 3 mg/mL collageen. Schaal bar = 500 μm. (C) Zoom-in van regio's uit collageen-versterkt micro-kolommen. Astrocyt bundel morfologie werd gehandhaafd gedurende het geheel van de micro-kolom. Schaal bars = 500 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 10: extractie van de Astrocytic bundels van de Micro-kolom en montage op Poly-L-lysine gecoat glas Coverslips bewijzen de robuustheid van de techniek. (A) fase contrast foto van verschillende geëxtraheerd astrocytic bundels, gemanipuleerd in de spelling van het woord "Penn". (B) Confocal wederopbouw van hetzelfde geëxtraheerd bundels gekleurd voor de astrocytic marker GFAP (rood) en de celkernen (Hoechst; blauw). Schaal bar = 100 µm. (C) vergroting van de doos regio B toont dat, zelfs wanneer gemanipuleerd in onregelmatige vormen, de astrocytic steigers een uitgelijnd, bipolaire morfologie en een gebundeld cytoarchitecture behouden. Schaal bar = 200 µm. Let erop dat eventuele structurele verschillen tussen de fase en de confocal beelden is waarschijnlijk een artefact van constructies verschuiven als gevolg van tijdens de procedure immunocytochemie spoelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 11: neuronen houden aan en uit te breiden van Neurites langs de uitgelijnde Astrocyt bundels in Neuron-Astrocyt mede gekweekte steigers. (A) fase contrast foto van een neuron-geplaatste astrocytic bundel. Schaal bar = 300 µm. (B)-(C) neuronen werden waargenomen om te voldoen aan de astrocytic bundels en uitbreiden van de neurites in de richting van de kabel (Hoechst-blauw; GFAP-groen; Β-tubuline III-rood). Schaal bars respectievelijk 200 en 100 µm, =. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 12: Astrocyt kabels dienen als een steiger wonen voor regie Neurite uitgroei. Confocale reconstructies tonen van een regio van een micro-kolom bestaat uit neuronen zaadjes ongeveer 2 dagen na de vorming van de bundel. (A) algemeen kaderakkoord voor vrede-positieve Astrocyt bundels, (B) β-tubuline III-positieve neuronen en (C) fusie van alle kanalen, waaronder HOECHST gebeitste kernen (blauw). Merk op dat neuronen tentoongesteld neurite uitlijning wanneer vastgehouden aan regio's met uitgelijnde Astrocyt processen (pijlen), overwegende dat neuronen niet gehandeld naar uitgelijnde astrocyten leek te vertonen willekeurige (dat wil zeggen meerdere directionele) neurite uitgroei (pijlpunten). (D) Zoom-in van regio toont de directionaliteit van neurite uitgroei. Schaal bars = 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In vergelijking met de meer ondersteunende omgeving voor de PNS, beperkt de CNS is met name bij de behandeling van de nadelige gevolgen van neurotrauma en neurodegeneratie. Na een ernstige belediging van de zoogdieren CNS, een gliale litteken gevormd, bestaande uit een kern van fibrotische en inflammatoire cellen omgeven door een dichte Zitschalen van ongeorganiseerd reactieve astrocyten die afscheiden van axon uitgroei-remmende proteoglycans¹⁴. Dit litteken fungeert als een fysische en biochemische obstakel tegen de regeneratie van axon uitgangen¹². Bovendien, de volwassen zoogdieren CNS beschikt over beperkte bronnen van nieuwe neuronen te herstellen verloren cellen na trauma of neurodegeneratie, aangezien neurogene centers beperkt tot de SVZ, de hippocampal getand gyrus en mogelijk andere gewoonlijk inactief zijn gebieden⁵⁴. Een ideale strategie zou het omzeilen van beide aspecten van de beperkte yogatechnieken mogelijkheden van de CNS, die de huidige aanpak niet adres. Als zodanig heeft onze onderzoeksgroep Astrocyt gebaseerde steigers gericht op het presenteren van levende trajecten voor de neurale overgang naar neuron-deficiënte gebieden en begeleide uitbreiding van het regenereren van axon groei kegels ontwikkeld. Uitgelijnde astrocytic bundels die deel uitmaakt van het collageen interieur van een agarose micro-kolom vormen deze steigers van astrocytic leven. Een aanzienlijk onderscheid van conventionele cel - en biomaterial-gebaseerde strategieën gebruikt voor CNS herstel en regeneratie is dat de cytoarchitecture van deze constructies volledig voorgevormde in vitro te simuleren verschillende in vivo glia gebaseerde begeleiding en steigers platforms. Bijvoorbeeld, tijdens de ontwikkeling van het embryo fungeren radiale glia trajecten als levende steigers voor nieuwe neuronen migreren naar de neocortex en gliacellen de gerichte extensie bemiddelen van baanbrekende axonen die zich voordeed als patroon substraten en/of markering cellen^{35 3938, ,}. Embryonale radiale glia in de subventriculaire zone produceren ook astrocyten die vormen lengterichting uitgelijnde gliale buizen, waarover migreren de neuroblasten postnatale stadium manifesteren in een geketend-formatie uit de SVZ de OB-⁴¹. Bovendien is gebleken in sommige niet-zoogdieren die, na CNS beschadigen, een grotere mate van regeneratie is mogelijk als gevolg van de vorming van een georganiseerde, uitgelijnde astrocytic regeling⁴⁴. Bijvoorbeeld, kunnen volwassen zebrafish regenereren hun spinal koorden na de migratie van onrijpe gliale cellen aan de laesie site is de differentiatie in een bipolaire morfologie en rek van gliale processen te overbruggen de laesie, vormen een pad dat regisseert regeneratie axonen⁴⁵. Gemanipuleerde constructies van uitgelijnde astrocytic bundels kunnen kunnen Recapitulerend van deze mechanismen en presenteren van de vereiste structurele en oplosbare signalen voor glia-gemedieerde neuronale migratie en axon regeneratie³⁵. Bovendien, als gevolg van het opnemen van levende astrocyten, kunnen deze constructies actief presenteren de vereiste ecologische signalen op basis van feedback van de host.

In onze techniek, Astrocyt uitlijning is een zelf-assemblage proces afhankelijk van de fysieke signalen en cel-cel interacties bevorderd door de micro-kolom binnendiameter, collageen concentratie en seeding dichtheid. Een ander aantrekkelijk kenmerk van deze methode is de micron-schaal grootte, die in minimaal invasieve implantatie in beschadigde gebieden van het centraal zenuwstelsel voorzien kan. Bovendien aantonen resultaten gepresenteerd in dit manuscript dat de constructies verkregen met het protocol hoge levensvatbaarheid bezitten en geven de tussenliggende gloeidraad eiwitten GFAP, nestin en vimentin, ongeacht de leeftijd van de Astrocyt zoals gedefinieerd door de passage nummer . Terwijl zowel GFAP en vimentin worden uitgedrukt in onvolwassen en volwassen astrocyten, is nestin voornamelijk beperkt tot ongedifferentieerde of onrijpe cellen, met het rijpen van glia upregulating de uitdrukking van GFAP en dalende productie van nestin^{45, 55}. vorige studies hebben aangetoond dat Astrocyt gedrag veranderingen met de leeftijd, maar consistent expressie van tussenliggende gloeidraad eiwitten, evenals bundeling werd gezien in een heel scala van passage nummers (passages 4-12)⁵⁶. De astrocytic steigers werden vertoond tot ultra lange, centimeter-schaal lengtes in vitro, die erop wijst dat deze techniek aan te passen aan de verschillende letsel lengtes en geometrieën in vivo ondervonden. Bovendien vertonen de uitgelijnde astrocytic bundels opmerkelijke structurele integriteit en stabiliteit, als hun kabel-achtige cytoarchitecture wordt gehandhaafd zelfs na wordt onderworpen aan de extractie van de micro-kolommen. Astrocyt gebaseerde levende steigers ook ondersteuning neuron hechting en neurite uitgroei, versterking van het potentieel van deze techniek te bevorderen gericht neuron migratie en axon extensie voor CNS reparatie.

De uitgelijnde astrocytic bundels bevinden zich in het collagene interieur van een beschermende buisvormige hydrogel omhulsel. Fabricage van de steigers van astrocytic begint met de vergadering van de micro-kolom door het invoegen van een acupunctuur-naald in een capillair en vloeibare agarose suctioning erin. De geselecteerde biomaterial was agarose vanwege haar inerte eigenschappen, biocompatibiliteit en gemakkelijk gecontroleerde mechanische, fysische en biochemische eigenschappen⁴⁹. Agarose concentratie in de hydrogel kan worden een belangrijke variabele sinds cellen zin mechanische prikkels uit hun substraat (bv stijfheid) en reageren met intracellulaire wijzigingen⁵⁷. Ontwerpcriteria voor deze micro-kolommen bevat een hoog genoeg porositeit te voorzien in adequate massatransport, maar een klein genoeg poriegrootte te verbieden van laterale proces uitgroei; deze criteria zijn voldaan door de nano-schaal open-porositeit aanwezig in agarose op de in dit protocol gebruikte concentratie. De concentratie van de agar in dit protocol werd ook gekozen vanwege haar stabiliteit, het gebruiksgemak behandeling en gelijkenis in de mechanische eigenschappen de hersenen milieu⁵⁸. Een opmerkelijk overweging is de centrale plaatsing van de naald in het capillair. Dikwijls, de naald mogelijk iets schuin of ontheemde tijdens het proces, waardoor het lumen te ligt uit het midden ten opzichte van de buitenmuren na agarose gelering en micro-kolom verwijderen uit de buis. Om dit te voorkomen, de naald recht moet zijn en de vergadering van de plunjer-buis-naald moet worden gehandhaafd in een verticale positie, terwijl agarose wordt getekend de naald langs de middenas behouden. Precieze centralisatie van de lumen beschermt de uitgelijnde astrocyten tussen de agarose muren; de lumen is gevoeliger voor bezwijken als proximale aan de buitenste rand van de cilinder bevindt. Daarnaast voldoende afstand tussen de lumen en de buitenmuur kan beschermende voordelen bieden tijdens en na de transplantatie (op voorwaarde dat de astrocytic constructies zijn niet verwijderd uit de micro-kolom voorafgaand aan het implantaat). Deze eerste fase van de fabricage van astrocytic steiger is primordiaal voor het welslagen van de techniek, zoals de selectie van de diameter van de naald cruciaal voor een goede Astrocyt soma/proces uitlijning en kabel zelf-assemblage is. We vonden dat Astrocyt uitlijning was omgekeerd afhankelijk van micro-kolom-ID, met een optimaal bereik van de ID voor de celuitlijning en de vorming van robuuste Astrocyt bundels wordt 180 tot 350 µm (Figuur 3). Op dezelfde manier was eerder blijkt dat neuronen hun uitgroei in de richting van minimale substraat kromming direct te verminderen proces buigen^59,60, en soortgelijke mechanismen waarschijnlijk op het werk zijn beïnvloeden Astrocyt aanpassing in ons systeem⁴⁹. Naast de kromming op het gebied van Astrocyt uitlijning, vonden we dat een 180 tot 350 µm ID bereik in het verwerven van een bipolaire morfologie⁴⁹, in tegenstelling tot de vorm van het Notti, multipolaire waargenomen met een ID van 1 mm of resulteerde wanneer astrocyten werden gekweekt astrocyten 2D (Figuur 3). Het is waarschijnlijk dat deze diepgaande morfologische veranderingen in de morfologie van een bipolaire Astrocyt hun fysiologische kenmerken veranderen bijvoorbeeld, deze astrocyten kunnen uitdrukken alternatieve secretable factoren of cel oppervlakte markeringen die kunnen nuttig zijn voor regeneratie, maar dit nog verdere karakterisering. Over het geheel genomen blijkt onze bevindingen dat geschikt selectie van lichamelijke signalen, zoals de kromming van het oppervlak, noodzakelijk om te emuleren van inheemse cytoarchitecture in astrocytic levende steigers.

Bouw van de astrocytic steigers opbrengst met de sequentiële opname van de collageen ECM-oplossing en corticale astrocyten in het holle interieur van de micro-kolommen. De innerlijke lumen van de micro-kolom is bedekt met collageen ter ondersteuning van de Astrocyt overleven, bijlage en uitgelijnde bundel vorming, als gevolg van het onvermogen van agarose onafhankelijk neurite uitgroei⁶¹te steunen. Een collageen concentratie van 1 mg/mL werd gekozen omdat eerdere studies bepaald dat lagere en hogere concentraties hebben geleid tot een gebrek aan hechting en instabiliteit van de ECM, respectievelijk⁴⁹. Dus, zoals verwacht, collageen concentratie heeft dramatische gevolgen voor de effectiviteit van deze techniek. Bovendien, de ECM-oplossing bestaat uit alleen type I collageen. In vergelijking met laminin en Matrigel-gecoate ondergronden voor 2D astrocytic culturen, vergulde astrocyten op type I collageen aangetoond optimale hechting en netwerk vorming⁶². De incubatietijd gebruikt voor collageen polymerisatie voorafgaand aan cel zaaien is ook een essentiële stap in het protocol. Eerder vonden we dat toen neuronen werden gelijktijdig geleverd met Ongepolymeriseerd ECM aan de agarose micro-kolommen, verminderde neurite uitgroei en axonale Fasciculatie gezien^{47 waren}, en het is mogelijk dat deze bevindingen tot astrocyten uitstrekken zou ook. Aangezien collageen nodig voor de hechting en bundel vorming Astrocyt is, moeten de aanwezigheid van ECM gedurende de constructie en de afwezigheid van luchtbellen of lege zakken worden gevisualiseerd en bevestigd met microscopische technieken.

Het protocol wordt afgesloten met Astrocyt plating, een incubatieperiode om cel adhesie collageen, en op korte termijn cultuur voor de vorming van de target cytoarchitecture. Astrocyten tussen passage nummer 4-12 werden gebruikt, zoals ze tentoongesteld robuuste astrocytic bundelen en collageen Reformatie. Deze astrocyten ook gepresenteerd een volwassen fenotype bestaande uit > 95% reinculturen^63,64 met weinig tot geen neuronale besmetting. In tegenstelling tot gewone Astrocyt culturen, die dienst serum-bevattende medium (figuur 3A, links), onze techniek maakt gebruik van serumvrij medium zodat astrocyten te nemen van een proces-bevattende morfologie (figuur 3A, rechts ) en vormen van bundels van uitgelijnde waarin en processen binnen de micro-kolommen^62,65,66. In termen van cel zaaien concentratie, resulteerde hogere concentraties in het bereik van 9.0-12,0 x 10⁵ cellen/mL, met een ID van 350 µm, in de vorming van opeengepakte bundels met bijbehorende collageen Remodellerend, terwijl astrocyten waren meer verspreid , maar toch zijn uitgelijnd, wanneer lagere concentraties werden gebruikt (Figuur 3 c). Het effect van de concentratie op cel-cel interacties zaaien beïnvloedt dus de mate van Astrocyt uitlijning en de vorming van de waargenomen kabel-achtige structuren. De injectie van de cell-oplossing in de lumen is over het algemeen gevisualiseerd met behulp van een stereoscoop om homogene levering over het micro-kolomlengte, die is van cruciaal belang voor de vorming van de continu bundel. Na het zaaien, is de voorlopige incubatietijd voorafgaand aan overstromingen met voedingsbodems onmisbaar voor het beveiligen van de ankerplaats van astrocyten aan de ECM. De duur kan worden gewijzigd als astrocyten aan de constructies ontsnappen, op voorwaarde dat de constructies voldoende bevochtigde zijn om te drogen in de weg. Phase-contrast beelden van de astrocytic steigers als functie van de tijd bleek dat door 8 h, een netwerk van uitgelijnde astrocytic bundels in het proces wordt gevormd. Bovendien werd het detachement van ECM uit de muur lumen, de daaruit voortvloeiende contractie en de strakke associatie tussen cellen en de gecontracteerde collageen waargenomen wanneer constructies waren gelabeld voor collageen en GFAP zoals aangegeven in Figuur 8. Dit verschijnsel is wellicht een gevolg van astrocytic contractiele krachten loskoppelen van het collageen van de muren, op basis van voorafgaande verslagen van de capaciteit van de fibroblast-achtige van gliale cellen voor het genereren van krachten die flexibele substraten en de matrix-remodeling verstoren vermogen van astrocyten in alleen-Astrocyt en neuron-Astrocyt culturen samen^28,49,67,68. In het bijzonder, is een van de gevolgen van Astrocyt beweeglijkheid en de interactie van integrine-gemedieerde met collageen fibrillen de generatie van troepen voldoende om het contract van de fibrillen^17,69. Globaal, tenuitvoerlegging van het protocol beschreven zal produceren levende steigers samengesteld van zelf geassembleerde netwerken van dichte, uitgelijnde astrocytic kabel-achtige structuren die fysieke substraten aanwezig in verschillende stadia van ontwikkeling van de CNS recapituleren.

Naast individuele problemen die zouden kunnen ontstaan in het gehele protocol, bezit de astrocytic steiger techniek andere belemmeringen die invloed kunnen hebben op haar vermogen om te herstellen van de CNS. Bijvoorbeeld, is het uiteindelijke succes van deze techniek afhankelijk van de plasticiteit van het zenuwstelsel en functionele integratie van de astrocytic steiger met de host-circuits. Aan de implantatie van deze steigers gerelateerde is de mogelijkheid van een ontstekingsreactie die kan tegen de pro-regeneratieve kenmerken van de astrocytic bundels. Alle transplantatie gebaseerde technieken hebben de capaciteit om scheuren van de bloed - hersenbarrière en infiltratie van ontstekingscellen, vanwege de nabijheid van tussen neuronen en haarvaten in het weefsel⁴⁷veroorzaken. In dit geval kan de hydrogel micro-kolom of een ander omhulsel schema voor de astrocytic steigers worden gebruikt als een voertuig voor de gecontroleerde afgifte van anti-inflammatoire factoren te verminderen van de ontstekingsreactie. In eerste instantie de uitgelijnde astrocytic bundel was niet stabiel binnen de micro-kolom, als de krachten die Celuitlijning dwingen en matrix remodelleren uiteindelijk heeft geleid tot een ineenstorting van de gewenste cytoarchitecture na 1-2 dagen in de cultuur. Extra contractie en bundel ineenstorting was echter belemmerd door het verstrekken van extra versterking voor de bundels aan de uiteinden van de micro-kolom door hogere concentratie collageen toe te voegen om de bundel op zijn plaats houden. Een extra tactiek zou kunnen zijn om een secundaire inkapseling, waarbij een nieuwe hydrogel coating wordt toegepast op de uitgelijnde astrocytic bundels, zoals zij uit de micro-kolommen worden opgehaald in dienst. Het is waarschijnlijk dat de levering van de uitgelijnde Astrocyt netwerken in de hersenen zou ook het stabiliseren van de constructies als gevolg van cel-cel verklevingen tussen de cellen van de gastheer en construct langs de gehele lengte, hoewel dit moeten zal rechtstreeks in toekomstige studies worden getest.

Dienovereenkomstig, toekomstige inspanningen zullen worden gericht op het ontwikkelen van een effectieve transplantatie-methode die zorgt voor stabilisering en bescherming van de bundel astrocytic tijdens en na in vivo levering zodat voor neuronale migratie, reparatie, en regeneratie van de gewonde CNS. We hebben eerder bewezen succesvolle implantatie van neuronale/axonale gebaseerde micro-TENNs, die delen van de regeling van het omhulsel van de astrocytic constructies, in corticothalamic-trajecten, resulterend in overleving en structurele integratie met de host weefsel in ieder geval tot 1 maand^46,47. Dus, de robuustheid van de kabels na extractie van de micro-kolommen kan worden benut. In dit geval de agarose hydrogel zou dienen als de oorspronkelijke cultuur bed voor het opwekken van zelf-assemblage en vervolgens de astrocytic kabel zou worden verwijderd uit het omhulsel en direct geïnjecteerd in de hersenen met behulp van een naald dunwandige. Astrocyt vervorming als gevolg van mechanische krachten tijdens de extractie van de hydrogel micro-kolom niet is nageleefd, en is niet te verwachten. Vorige werk bestudeert de effecten van mechanische vervorming op Astrocyt reactiviteit suggereert dat eventuele resulterende vervorming niet snel genoeg zou worden toegepast voor het opwekken van astrocytosis of proces rek^62,70. Om te minimaliseren van de schade aan hersenweefsel en de mogelijke ontstekingsreactie, kunnen de bundels binnen de hydrogel worden geïmplanteerd met behulp van de technologie van de naald-minder ontwikkeld eerder voor de micro-TENNs. In deze methodiek, is de hydrogel bedekt met een dun laagje carboxymethylcellulose waarmee de naald-minder binnenkomst in de hersenen die de ontwrichtende en inflammatoire voetafdruk van implantatie⁴⁷kan verminderen. Daarna, transplantatie studies kunnen worden uitgevoerd voor de beoordeling van het vermogen van deze steigers integreren in het weefsel van de gastheer te overleven, en bevordering van de neurale migratie en begeleiding van de axon. In het bijzonder kunnen deze constructies worden geïmplanteerd met een einde die afkomstig zijn uit een neurogene regio zoals de SVZ tot zijn pool van neurale stamcellen en neuroblasten, in directe mimicry van de RMS, en het andere uiteinde verbonden met een schade-site mogelijk rijden neurale migratie en weer toevoegen aan het gebied in een gemeten mode.

Na transplantatie protocolverbetering, kan de techniek in andere gebieden worden verbeterd. De micro-kolommen kunnen worden vervaardigd met onrijpe astrocyten (bijvoorbeeld radiale glia, RMS-type cellen) of volwassen fenotypen die later dedifferentiated als aanvulling op de regeneratieve-inducerende capaciteit van deze constructies⁴⁹. In in vitro -modellen van de gliale litteken hebben volwassen astrocyten niet de mogelijkheid van de vorming van opleidingstrajecten axon uitgroei⁷¹. In tegenstelling, is onvolwassen astrocyten gebleken dat neurite uitgroei in vitro en axonale regeneratie in vivo bij getransplanteerde gelijktijdig met chondroitinase ABC inspelen op de hoge niveaus van CSPGs in de gliale litteken⁷¹ te bevorderen ^{, 72}. samenvallen met de komst van gepersonaliseerde geneeskunde, autologe astrocytic micro-kolommen kunnen worden ontwikkeld door het zaaien van stamcellen uit bronnen zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en menselijke neurale stamcellen (hNSCs). Deze wijziging zal toestaan deze steigers te functioneren als leidingen voor geïndividualiseerd en specifieke traject reparatie en regeneratie. Bovendien gebruik van de bronnen van deze cel kan het omzeilen van de mogelijke immunogene antwoord dat Astrocyt implantatie kan veroorzaken. Hoewel de immunogeniciteit verschilt volgens iPSC cellijnen, zijn deze cellen theoretisch kunnen afwenden of het afnemen van immuunresponsen bij transplantatie, zoals voorgesteld door de afwezigheid van schadelijke reacties na iPSC afkomstige orgel implantatie in muizen^73,74. Bovendien onderdrukken autologe hNSCs en hun astrocytic derivaten allogene immuunresponsen⁷⁵. Bijgevolg, fabriceren deze uitgelijnd Astrocyt netwerken met autologe stamcellen een kritische toekomst stap worden kunnen in het maken van deze techniek gemakkelijker toepassing in de klinische setting.

Behalve de toepassing als de leidingen voor CNS herstel en regeneratie, kunnen astrocytic levende steigers worden gebruikt als in vitro proefnetwerken, met of zonder het omhulsel van de hydrogel op basis van de doelstellingen van een bepaalde testen paradigma. Bijvoorbeeld, kunnen deze astrocytic constructies worden gebruikt voor het onderzoeken van neurobiologische verschijnselen zoals neuron migratie en neurite uitbreiding gemedieerd door astrocyten, exploiteren de controleerbaar eigenschappen en de 3D-omgeving van levende steigers als modellen van in vivo voorwaarden. Het protocol besproken in dit manuscript gedetailleerd de fabricage van zelf geassembleerde uitgelijnde astrocytic bundels in een collagene matrix binnen een hydrogel micro-kolom. Door Recapitulerend functies van hersenen neuroanatomie, developmental/regeneratieve mechanismen en neuroblast migratie trajecten, hebben deze implanteerbare astrocytic steigers het potentieel om het bieden van ondersteunende trajecten voor regie neurale migratie en axon begeleiding in de anders remmende omgeving van de beschadigde CNS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).