Summary
אנחנו ראווה הפיתוח של חבילות שהורכב עצמית, תלת מימדי של somata astrocytic longitudinally מיושר ותהליכים בתוך למטרתו biomaterial הרומן. אלה מהונדסים "חי פיגומים", מפגין בקנה מידה מיקרון קוטר עדיין הארכת ס מ אורך, עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד מנגנוני התפתחותיות או להקל על neuroregeneration על-ידי הגירה העצבית המשגה ו/או עצב pathfinding.
Abstract
מחלת Neurotrauma, ניווניות לעיתים קרובות לגרום שנמשך גרעונות בשל הקיבולת המוגבלת של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי להחליף את הנוירונים לאיבוד והפק מסלולים עצב. עם זאת, במהלך פיתוח מערכת העצבים, הגירה העצבית והסיומת עצב לעיתים קרובות להתרחש לאורך מסלולים נוצר על ידי תאים אחרים, המכונה "חיים פיגומים". המבקשים לחקות מנגנונים אלה לתכנן אסטרטגיה העוקפות את הסביבה המעכבת של מערכת העצבים, כתב יד זה מציג את פרוטוקול כדי לבדות רקמות מהונדסים מבוססי אסטרוציט "חי פיגומים". כדי ליצור את המבנים האלה, אנחנו מועסקים ערכה למטרתו biomaterial הרומן לזירוז האסטרוציטים להרכיב עצמית צפופה תלת מימדי בחבילות של הפרעה דו קוטבית somata מיושר לימין longitudinally ותהליכים. ראשית, חלול הידרוג מיקרו-עמודות כונסו ולאחר לומן הפנימי היה מצופה מטריצה חוץ-תאית של קולגן. חלופה מועדפת את מוחי האסטרוציטים בקליפת המוח ואז נשלחו לתוך לומן של המיקרו-העמודה גלילי, קריטי בקוטר הפנימי של < מיקרומטר 350, באופן ספונטני עצמית ויישור מתכווץ כדי לייצר זמן כמו סיבים כבלים המורכב חבילות עבות תהליכים אסטרוציט ו קולגן הסיבים מדידה < מיקרומטר 150 קוטר עדיין הרחבת מספר ס מ אורך. אלה מהונדסים חיים פיגומים הציג > 97% תא הכדאיות והיו כמעט באופן בלעדי מורכבת האסטרוציטים לבטא שילוב של פילמנט ביניים חלבונים גליה-fibrillary חומצי החלבון (GFAP), vimentin, ו nestin. אלה המיושר אסטרוציט רשתות נמצאו לספק מצע מתירניות עבור הקובץ המצורף עצביים וכל neurite הרחבה. יתר על כן, מבנים אלה לשמור על שלמות ויישור כאשר מופק למטרתו הידרוג, שהופך אותם למתאימים להשתלה CNS. אלה בונה preformed מבנית לחקות את יסודות cytoarchitectural מפתח באופן טבעי מבוסס על גליה "חיים פיגומים" בתוך vivo. ככזה, פיגומים מהונדסים חיים אלה עשוי לשמש מבחן-מיטות לימוד התפתחותיות מנגנונים במבחנה או להקל על neuroregeneration על ידי הפניית הגירה העצבית ו/או עצב pathfinding בעקבות התנוונות מערכת העצבים המרכזית ויוו .
Introduction
מערכת העצבים המרכזית (CNS) בעל קיבולת מוגבלת כדי לנטרל את אובדן ו/או תפקוד לקוי של נוירונים מסלולים עצב שמלווים מצבים כגון פגיעה מוחית טראומטית (TBI), שבץ, מחלת פציעה (מדע), ניווניות חוט השדרה1 ,2,3,4,5. נוירוג'נסיס ב מערכת העצבים היא מוגבלת למספר מוגבל של אזורים במוח, פוגעות השיקום של נוירונים אבודים6,7. בנוסף, התחדשות של מסלולים עצב לאיבוד בתוך מערכת העצבים אינה מספיקה בשל העדר הדרכה מכוונת, הנוכחות של מעכבי תוצר, ו astrogliosis תגובתי בעקבות נזק רקמה עצבית2,8, 9,10. האסטרוציטים בדרך כלל יש פונקציות מגוונות בקליטת נוירונים עם יון הומאוסטזיס, סיווג נוירוטרנסמיטר, היווצרות סינפסה נוירו-וסקולריים צימוד11. יחד עם זאת, בעקבות פגיעה קלה אפילו רקמה עצבית, האסטרוציטים עלול לעבור שינויים מולקולרית מבנית, פונקציונלי במעבר המדינה היפרטרופית11. בתגובה neurotrauma חמורה, שינויים אלה לגרום היווצרות צלקת עם הילה המכילה האסטרוציטים תגובתי נודדים, ליבה של הנגע הכולל לויקוציטים דלף מן קרע מחסום הדם - מוח (BBB), מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך ולאחר fibroblasts11,12,13. האסטרוציטים הממוגן אלה להשיג את המורפולוגיה של תהליכים filamentous, לא מאורגן ולהציג ביטוי מוגבר של חלבונים פילמנט ביניים, כונדרויטין סולפט proteoglycans (CSPGs), אשר להפריע התחדשות עצבית12. אף-על-פי הצלקת גליה בתחילה עוזר לשחזר BBB שלמות ולהימנע שידור של תגובת דלקתית לרקמות בריאות, משמשת מחסום פיזי וביוכימי נגד האקסון התחדשות12,14 15, ,16. למשל, אקסונים המפגש הצלקת גליה להציג צמיחה dystrophic בולבוסי קונוסים, ננסיים צמיחה12. יתר על כן, חוסר הארגון של תהליכים astrocytic לאחר פציעה פוגעת ההרחבה של רגנרציה אקסונים17. התוצאה של תכונות מעכבות אלה באה לידי ביטוי את קבוע לעיתים קרובות נוירולוגיות פיזיקליות ליקויי חולים סובלים לאחר neurotrauma חמורות, לרבות TBI לביוטכנולוגיה
ללא קשר חיצוני האתגרים התחדשות תפקודית של מערכת העצבים, אקסונים הוכחו בעלי יכולת מהותי להתחדש. למשל, באופי הדינמי של הקונוסים צמיחה dystrophic בקשר עם הצלקת גליה מציע סופים אלה שומרים על היכולת שלהם להרחיב את12. כתוצאה מכך, הוא האמין כי ליצור הפרעה עצב מחדש את הצמיחה העיקרי הוא הסביבה המעכבת של מערכת העצבים לאחר פציעה, וכי מתן סביבה מתירנית יותר באמצעות הפחתת גליה הצטלקות ו/או במתן משובי גשרים על פני הצלקת יהיה יתרון. ואכן, מחקרים קודמים הדגימו כי CNS הנוירונים מסוגלים הארכת אקסונים באמצעות פגיעה באמצעות שתלי במערכת העצבים ההיקפית כמו גשרים, מציג סביבה אוהדת יותר האקסון התחדשות12,18, 19. כנראה תפס מספר אסטרטגיות אחרות כדי לנצל את יכולת ההתחדשות מנוונת. לדוגמה, מניפולציה של התא צמיחה איתות המסלולים במודלים שונים של פגיעה הביא התחדשות עצב וגליה הצלקת הפחתת10,20,21. בנוסף, מחקרים הראו כי טיפול עם chondroitinase ABC, אשר cleaves את רוב הרשתות סוכר ב- CSPGs, מפחיתה את ההשפעה המעכבת של CSPGs מופרש על ידי האסטרוציטים תגובתי22. למרות מעודד תוצאות, גישות אלה אינם מספקים מכוונת ההדרכה של גביעי צמיחה, אשר יכול לגרום פוטנציאל התחדשות aberrant12, גם חשבון על האובדן של נוירונים. כבר מנוצל גישות תא ניסיונות כדי להתגבר על ההשפעות של הצלקת גליה וכדי לחדש תאים אבודים, במיוחד נוירונים. כמה קבוצות יש dedifferentiated האסטרוציטים תגובתי לתוך הנוירונים, בעוד אחרים יש מושתלים ובתאים העצבי לתוך נגעים CNS לאכלס אזור הפציעה ולקדם האקסון התחדשות23,24, 25. עם זאת, השתלת תא גזע לבד הוא מוגבל על ידי שיעורי הישרדות נמוכים, אינטגרציה המסכן ושמירה צנוע רקמות שנפגעו5. יתר על כן, אסטרטגיות אלו מבוססת תא להיכשל לשחזר ספינלי עצב למרחקים ארוכים, במיוחד בצורה מבוקרת. לכן, להיות נידונות biomaterials בשילוב עם גישות אחרות כמו רכבי ההעברה שונות עצבית, ובתאים וצמיחה גורמים26. גישות biomaterial כוללים רמה גבוהה של עיצוב פקד כדי לייצר מבנים המחקים את haptotaxic הפיזי, ספציפי, וכן רמזים chemotaxic להציג microenvironment תלת מימדי (3D) המטרה המארח רקמות27, 28,29,30,31,32,33,34. רבייה של אותות סביבתיים אלה הוא בעל חשיבות עליונה עבור התאים המושתלים להציג מורפולוגיה מקורי כמו התפשטות, הגירה, איתות, בין שאר המאפיינים הנוירוביולוגי29. למרות מאפיינים אלה יתרון, קידום מעבר תא מסורתי נזרע biomaterial פיגומים נדרש בעת ובעונה אחת לקדם התחדשות שיחות לחו ל עצב מכוונת ולהחליף נוירונים אבוד.
התחלה מבטיחה גישה חלופית מבוססת על רקמה עצבית מהונדסים "חי פיגומים", אשר נבדלים גישות אחרות בשל נוכחותם של לחיות תאים עצביים עם cytoarchitecture preformed שמדמה נוירואנטומיה מקורית מבוססת-תא או מנגנונים התפתחותית כדי להקל על החלפת יישוב, שיקום והתחדשות של המעגלים העצביים4,35. שיקולים על העיצוב של פיגומים המגורים כוללים את פנוטיפים ואת מקורות של תאים עצביים, כמו גם את תכונות מכאניות/פיזי, אותות ביוכימיים שמכתיבה ההרכב של כל biomaterials הנלווה35. לאחר ייצור במבחנה, פיגומים החיים האלה יכולים להיות מושתל ויוו מולקולות אדהזיה התא הנוכחי, chemotactic ואותות neurotrophic להסדיר באופן פעיל את נדידת תאים עצביים, האקסון תוצר בהתאם למצב, התפתחות לתהליכי הרגנרציה35... גלייה יכול לשמש כבסיס cytoarchitecture שעברו הנדסה לאחור של פיגומים החיים מאז תאים אלה לתווך שונים מנגנוני התפתחותית ויוו. במהלך התפתחות המוח, נוירונים חדשים להסתמך על תהליכים הבזליים המורחבת על ידי עכשיו, דונלד רדיאלי מאזור חדרית לעבר הצלחת בקליפת המוח המתפתח כמו חיים פיגומים עבור ההעברה מכוונת36,37. יתר על כן, הרחבת צמיחה קונוסים הינם שמוצג כדי להציב את עצמם על ידי חש אותות דוחה ומושכת שהפיק תאי גליה guidepost, מה שנקרא "חלוצי" אקסונים מוצעים כדי להגיע אל המטרות הנכונות על-ידי הרחבת לאורך מראש בדוגמת גליה פיגומים35,38,39. לפיכך, גלייה נחוצים עבור ההדרכה של חלוצי אקסונים, אשר מאוחר יותר משרתים גם מבוסס על האקסון "חי פיגומים" לכוון את הקרנת אקסונים "חסיד". יתר על כן, מנגנוני גדילה בתיווך עכשיו, דונלד הוכחו להתמיד נוצרו אחרי הלידה, כפי neuroblasts לכו בעקבות הזרם נודדות rostral (RMS) כדי לנווט מאזור subventricular (SVZ), אחד האזורים הנותרים האחרונים של נוירוג'נסיס במוח למבוגרים, הריח הנורה (אבוב)40. Neuroblasts אלה ב- RMS להעביר בתוך הצינור גליה (איור 1 א'-1), אשר כולל מיושר לימין longitudinally תהליכים astrocytic, באמצעות תאים תאים ישירה הדבקויות, לשפות אחרות גורמים מסיסים-37, 41. סוף סוף, בעוד נזק CNS יונקים גורם שיבשו סידור תהליך astrocytic ויוצרים צלקת גליה פיזית פוגעת התחדשות עצב17, מערכות מידע שאינם יונקים רבים חוסר היווצרות צלקת גליה מזיקה. במקום זאת, תאי גליה של מינים שאינם מידע יונקים לשמור על יותר מאורגן, מיושר תבניות המשמשות כקווי עזר דרך42,17,האזור הפגוע43. למשל, מידע שאינם יונקים SCI דגמים, אקסונים מוצגים לגדול בשיתוף הדוק עם גליה הגשרים שחוצים את הנגע, רומז תפקיד חשוב עבור פיגומים גליה מאורגן בשם דיאלקטריים הקלת עצב רגנרציה ומחזור (שחזור פונקציונלי איור 1A -2) 42 , 44 , 45. החוק הביוגנטי של התכונות neuroanatomical ואת המנגנונים התפתחותית/משובי שתוארו לעיל, תניב סוג חדש של פיגומים מהונדסים מבוסס על גליה חי במקביל שיכולים להביא הגירה העצבית ילדותי, עצב pathfinding דרך סביבות אחרת שאינה מתירני, שעשוי להיות ובכך מקלים את ההשפעות של עצביים האקסון בדרכי ניוון המשויך CNS פציעות ומחלות.
קבוצת המחקר שלנו תוכנן בעבר מספר סוגים של פיגומים חי עבור שחזור ומתוכננים התחדשות של עצב ספינלי מערכת העצבים, מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית) באמצעות מיקרו-רקמת רשתות עצביות (מיקרו-TENNs) ורקמות מתוכנן החוצפה-שתלים (TENGs), בהתאמה27,46,47,48. שתי אסטרטגיות מבוססים מטבעם על ביומימטיקה. מיקרו-TENNs הם מבנים בהשראת אנטומית המיועד מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית להחליף שטחים עצב המחבר ברורים אוכלוסיות עצביים במוח. TENGs לנצל את מנגנון התפתחותית של התחדשות עצב הקלו האקסון, ומעוררות "חסיד" צמיחה האקסון לאורך אקסונים "חלוץ", כדי להשיג את מארח היעד התחדשות עצב35,46,48. אנחנו לאחרונה מהוונות על צדדיות של לגרדום חיים טכניקה באמצעות ערכה דומה למטרתו כמו מיקרו-TENNs ומחפשים השראה מן המנגנונים מבוסס עכשיו, דונלד להציג במהלך הפיתוח. . הנה, פיתחנו בונה המורכב מיושר חבילות astrocytic פורש לומן סילוק של מיקרו-טור הידרוג49. פיגומים אלו החיים astrocytic מפותחים באמצעות מילוי אסיפה המחט צינור קפילר-דיקור עם agarose נוזלי כדי ליצור של הידרוג גליל חלול עם הקוטר החיצוני (OD), הקוטר הפנימי (ID) המתאים הקוטר של שפופרת ואת המחט, בהתאמה. בעקבות agarose gelation החילוץ של המיקרו-העמודה הידרוג מהצינור נימי, הפנים חלול הוא מצופה סוג אני קולגן לספק סביבה מתירניות עבור אדהזיה אסטרוציט ו מיושר צרור היווצרות (איור 1B -1). לאחר מכן, לומן הוא נזרע עם מוחי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן החולדה לאחר הלידה הגורים (איור 1B-2). בניגוד דו-ממדית (2D) שיטות ליישור המסתמכים על היישום של שדות חשמליים, חריצים micropatterned מטריצה חוץ-תאית חלבון (ECM) תכנים, היישור אסטרוציט לגרדום חיים טכניקה מסתמך על הרכבה עצמית לפי משתני לשליטה כגון עקמומיות המצע (העמודה ID), צפיפות תא קולגן ריכוז50,51,52. האסטרוציטים חוזה לשפץ הקולגן ו לרכוש מורפולוגיה דו-קוטבי, מיושר לימין longitudinally מקביל פיגומים טבעי ויוו (איור 1B-3). אכן, אנחנו הם שואפים השימוש של המבנים האלה, כמו כבלים בשם דיאלקטריים פיזי עבור הדרכה ממוקד של העברת נוירונים לא בוגר, כמו גם בקידום התחדשות עצב באמצעות הסביבה שלילי של מערכת העצבים פגום, במיוחד בתרבית של גליה הצלקת (איור 1C). במאמר זה תוכלו להציג את שיטת ייצור מפורט עבור העמודות-המיקרו astrocytic, שלב תמונות חדות עם immunofluorescence את cytoarchitecture הצפוי, דיון מקיף על המגבלות הנוכחי וכיוונים עתידיים של טכניקה.
איור 1: השראה, ייצור פרוטוקול ויישומים המוצע עבור הרשתות Astrocytic מיושר. ההשראה הנוירוביולוגי (A): Neuroblasts (1) שמקורן באזור ' neurogenic subventricular ' (SVZ) לנצל את הצינור גליה longitudinally מיושר בזרם נודדות rostral (RMS) עבור העברה מכוונת לעבר הנורה הריח (אבוב); (2) אי-יונקים כגון דו-חיים, דגים יכול להימשך התחדשות לאחר רקמה עצבית נזק בחלקו בשל היווצרות של גליה גשר המחבר את הקצוות של פגיעה (למשל חוט השדרה transected) ומשמש עשו איתו בהדרכת רגנרציה אקסונים. (B) סקירה פבריקציה נוספת: (1) הקמת הידרוג בגודל מיקרון, חלול מיקרו-עמודה בעלת לומן מצופה ECM, (2) זריעה של ראשי האסטרוציטים קורטיקלית מבודד מן הגורים עכברוש כמחנכת, (3) הרכבה עצמית של longitudinally מונחה חבילות תרבות, ו (4) הפקת הצרור מ למטרתו biomaterial ללימודי השתלה עתידית. (ג) יישומים In vivo : (1) פיגומים חיים אלה עשוי לשמש מהונדסים גליה צינורות להעברת נוירון מכוונת ממרכזי neurogenic לשקם אזורים נוירון לקויה; (2) החוק הביוגנטי של מנגנון התפתחותית של חלוצי האקסון הדרכה, מנגנון הרגנרציה של גשרים גליה שאינם יונקים שיעניק אלה פיגומים astrocytic את היכולת לכוון רגנרציה האקסון על פני הלא-מתירני סביבה של הצלקת גליה יונקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים היו אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש ב אוניברסיטת פנסילבניה ו מייקל ג'יי Crescenz ותיקי לענייני המרכז הרפואי, דבקה בהתאם להנחיות המפורטות במדיניות שירות בריאות הציבור NIH על להומניות טיפול ושימוש חיות מעבדה (2015).
1. פיתוח של הידרוג מיקרו-העמודות Agarose
- הפוך פתרון משקל/נפח (w/v) 3% agarose על ידי שקילה דור 3 של agarose ולא העברת אותו גביע סטרילי המכיל 100 מ ל תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). להוסיף פס מגנטי סטרילי כדי כשהספל, ומניחים אותו על פני השטח של בחישה/פלטה. שמור את הספל כוסה על מנת למנוע אידוי של התוכן שלה בשלב הבא.
- מחממים את agarose ואת DPBS בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ומערבבים במהירות של 60-120 סל ד. לכוונן הגדרות אלה בהתאם לצורך, כל הזמן עוקב אחרי ההתקדמות של תהליך ההמסה כמו הפתרון משתנה בתחילה מאטום מראה נקי זה מסמל agarose כבר התפרקה לחלוטין.
התראה: כשהספל חם והפתרון שוות! - הפתרון agarose מחוממת ונסערת, לאחזר ארבע צלחות פטרי ריק 10 ס מ, להוסיף שניים מהם 20 מ של DPBS. מקום דיקור מחטים (קוטר: 300 מיקרומטר, אורך: 40 מ מ), זכוכית צינורות קפילר microliter (קוטר: 701.04 מיקרומטר, אורך: 65 מ מ, קיבולת: 25.0 µL), ומתקן הנורה בתוך ארון אבטחה. כאשר הפתרון agarose נוזלי מתרוקנת, לשמור על חימום כ 50 ° C קבוע, זע להימנע gelation של agarose.
- להציג מחט אקופונקטורה לתוך הפתח התחתון של מתקן הנורה. הכנס צינור קפילרי מעל המחט נחשף מבחוץ. אבטח את צינור קפילרי על-ידי הזנת חלק אותו לתוך המקטע גומי של הגליל מנפק הנורה.
- להעביר 1 מ"ל של agarose נוזלי עם micropipette פני השטח של צלחת פטרי ריק, מקם קצה אחד של הצינור נימי אנכית (עם מחט מוכנס) במגע עם agarose, בעוד הכיפה גומי של מנפק הנורה הוא צבט פנימה. לאט לאט לשחרר את הלחץ על המכסה מנפק הנורה כדי לצייר agarose לתוך הצינור נימי.
הערה: ההעברה של agarose נוזלי לתוך צינורות קפילר חייב להתבצע במהירות. אם agarose נוזלי נותר כדי להתקרר על פני צלחת פטרי למשך מספיק זמן (כ 60 s), זה מתחיל להתחבר, מניעת suctioning מתאים של agarose לאורך הצינור נימי. - המקום כל הרכבה הנורה-צינור-המחט פטרי חינם, ולתת agarose ג'ל בתוך הצינורות נימי לחזק עבור 5 דק משוך בזהירות את צינור קפילרי עם הידיים החוצה פקק הגומי בתוף מנפק הנורה, להשאיר את המחט ו agarose ג'ל במקומו בתוך הצינור.
- לחלץ באופן ידני של דיקור סיני על ידי לאט מוציאים זה צינור קפילרי; הצילינדר agarose הקרושה לאחרונה גם שקופיות יצאה מהשפופרת בהליך זה, עדיין המקיפים את המחט. בעדינות הסטת המיקרו-העמודה לאורך דיקור עם קצה מלקחיים סטרילי כדי להזיז את הסוף. מיקום המחט מעל צלחת פטרי פתוח, המכיל DPBS, דחפו המיקרו-העמודה DPBS עם מלקחיים.
הערה: אם agarose המיקרו-העמודה נותר בתוך הצינור נימי זכוכית על סילוק דיקור סיני, לאט לדחוף את agarose המיקרו-מהטור צינור קפילרי עם מחט בקוטר 25 מ מ עם ולתוך המנה עם DPBS. - לחטא microscalpels או מלקחיים באמצעות מעקר חרוז חם. הפוך agarose w/v 4% על ידי שקילה 4 גר' agarose והעברתו 100 מ של DPBS. מחממים ומערבבים כמוסבר בשלב 1.2 להשגת פתרון ברור של agarose נוזלי 4%. לשמור על חימום, ערבוב של הפתרון לאורך כל השלבים הבאים.
- להעביר את פטרי המכילות את המיקרו-העמודות לנתיחה מכסה המנוע, ולהעביר מיקרו-עמודה עם מלקחיים בסדר אל צלחת פטרי ריק. לנצל את סטריאוסקופ עבור הנחיה חזותית, microscalpel לחתוך המיקרו-העמודות עד לאורך הרצוי. חתוך בשני הקצוות לקצוות טופס משופע בזווית 45o מאופקי כדי להקל על הטיפול של המיקרו-העמודות במהלך הוספת ECM ותא.
- חזור על שלב 3 מיקרו-עמודות נוספות בצלוחית הפטרי אותה הקודם ו בשורה של בונה ארבע במקביל פרידה של < 3 מ מ בין כל הגלילים. לטעון µL 50 של 4% פתרון agarose עם micropipette ושופכים קו/רצף של נוזל מעל המערך מיקרו-עמודה כדי להתחבר ולכרוך את המבנים לקבוצות של ארבעה (מכאן והלאה נקרא "מיקרו-עמודה סירות"). למנוע תנועה של 4% agarose בקצוות של המיקרו-העמודות, אשר עלול לסתום את הפנים, על-ידי צמצום המרחק בין המבנה והוספת את agarose במהירות בקו דק.
הערה: סידור קבוצות של ארבעה מיקרו-עמודים לתוך "סירות" לא נדרש להמציא פיגומים astrocytic. למרות זאת, הסירות מגישות לזרז את תהליך ייצור להציע דרך בטוחה יותר להעביר ולטפל מיקרו-עמודות בשלבים מאוחר יותר. - ומצננים את הסירה מיקרו-עמודה 1-2 דקות לאפשר gelation של agarose נוסף 4%. לאסוף את הסירה מיקרו-עמודה עם מלקחיים בסדר על-ידי agarose חיבור 4%, ומעבר המיקרו-העמודות אחרות המכילות DPBS הפטרי מוכן בשלב 1.1.3. להמציא עוד קערות עם המיקרו-העמודים הנותרים כרצונכם.
- להזיז את פטרי המכילות את מיקרו-עמודות ו/או סירות אבטחה ארון ולחטא עם חשיפה לאור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
התראה: לענוד הגנה הולמת כדי למנוע חשיפה UV. - לאחסן את הכלים עם הסירות מיקרו-טור ב- DPBS ב 4 ° C, אם תוספת ECM ו יופיצ תא לא יתבצעו מיד לאחר מכן, עד שבוע. חזור על השלבים ייצור מיקרו-עמודה אם בונה לא משמשים במהלך פרק זמן זה.
2. התא הראשי תרבות ובידוד
- אסטרוציט קורטיקלית בידוד מן הגורים עכברוש
- לקראת השלבים הבאים, להוסיף 20 מיליליטר של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) כדי ארבע צלחות פטרי 10 ס מ אשר ישמש מאגרי רקמות גזור. שמור את כל הצלחות על קרח. לחטא מספריים כירורגיים נקי, מלקחיים, מיקרו-מרית, מיקרו נלווה ב מעקר חרוז חם.
- Prewarm 0.25% טריפסין עם 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ו- 0.15 מ"ג/מ"ל deoxyribonuclease (DNase) אני ב HBSS ב 37 º C. בנוסף, prewarm של המדיום תרבות אסטרוציט ב 37 מעלות צלזיוס, אשר מורכב של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם תערובת התזונתי של חזיר F-12 ו 10% סרום שור עוברית (FBS).
- עזים ומתנגד כמחנכת יום 0 או יום 1 ספראג-Dawley חולדה הגורים מאת לחשוף אותם תנאים בהיפותרמיה, המתת חסד ע י עריפת ראשו. סיכת הראש לבמה באמצעות של 19 מ מ. קוטר המחט להציב את החוטם והשתרשה עמוק בלבה העיניים
- לעשות חתך עם איזמל באמצע כדי הקדמי, האחורי מבסיס הצוואר ועד ממש מאחורי העיניים. לבצע את חיתוך נוסף הולך רוחבית מ ישירות מאחורי עיניה כלפי מטה, ויוצרים צורת T. להשתמש מלקחיים בסדר כדי לשלוף את הגולגולת של העור/הגולגולת אל הצד.
- . תחזיק את הראש על ידי החוטם (כלפי מעלה) על-ידי הצבת אחד לתקעים של המלקחיים בתוך הפה של החיה והשני על המשטח החיצוני. מסירים את המוח עם מיקרו-מרית סטרילי ולמקם אותו באחת צלחות פטרי מלא HBSS צוננות. המקום הזה פטרי על הקרח מיד לאחר מכן, כל עת מלבד כאשר בשימוש.
- מקם גוש גרניט שאוחסנו בעבר ב-20 ° C מתחת סטריאוסקופ בתוך ברדס לנתיחה. מניחים על צלחת פטרי עם רקמת המוח על פני השטח של גוש גרניט כדי לשמר את הטמפרטורה נמוכה שלו במהלך ההליך לנתיחה. להשתמש את סטריאוסקופ הנחיה חזותית לאורך כל השלבים הבאים.
- אם הנורות הריח נותרו ללא פגע, לחלץ אותם על ידי חיתוך עם מלקחיים או microscalpels. בנוסף, להשתמש microscalpel כדי להסיר את המוח הקטן עושים חתך קו האמצע המפריד בין שתי ההמיספרות. העבר את ההמיספרות עם מלקחיים צלחת פטרי המכילות HBSS טריים, צונן.
- לנתח את מבנה המוח האמצעי מהחלק הפנימי של ההמיספרות עם microscalpel כדי לקבל רק את cortices מופרדים. להשתמש מלקחיים בסדר לקלף את קרומי המוח, מבנה דמוי גיליון, מתוך הרקמה קורטיקלית להעביר את cortices מבודדים צלחת פטרי חדש עם HBSS קר. השתמש את microscalpel לרכך את הרקמה כדי להגדיל את שטח הפנים לפעולה טריפסין בשלב הבא.
- השתמש פיפטה של פסטר להעביר cortices את שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ של טריפסין prewarmed-EDTA (8 cortices כל צינור). לחשוף את רקמות קורטיקלית טריפסין-EDTA למשך 5-7 דקות ב 37 º C.
- עם פיפטה פסטר, בזהירות להסיר את טריפסין-EDTA ולהוסיף 400 µl של 0.15 מ"ג/מ"ל DNAse אני לפתרון הצינורית צנטריפוגה. להתסיס את צינור או מערבולת עד כל הרקמה הוא חלופה מועדפת ויש אין חתיכות רקמה שנותרו בתוך הנוזל. אם זה לא אפשרי נמסים לחלוטין את הרקמה, להסיר מן הקטעים עם קצה פיפטה פסטר.
- צנטריפוגה הצינור המכיל הפתרון תא חלופה מועדפת-200 g x עבור 3 מינימלית להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה פסטר מבלי להפריע את התאים. להוסיף 1 מ"ל אסטרוציט תרבות בינוני (שהוגדרו בשלב 2.1.2) ברכבת התחתית עם micropipette, להתסיס resuspend וליצור פתרון הומוגני.
- להעביר 10 מ"ל אסטרוציט בינוני תרבות עם פיפטה סרולוגית בקבוקון T-75. להוסיף 250 µl של 1 מ"ל תא הפתרון (להכין בשלב 2.1.11) עם micropipette שתייה צידניות כדי צלחת מח גור אחד שווה של תאים לכל את הבקבוק. פזר את הפתרון תא משוחררים באופן שווה על פני המדיום תרבות, בעדינות להתסיס את הבקבוק כדי לקדם ריפודי כתופיים.
- תרבות המבחנות מצופה ב חממה humidified-CO 37 ° C ו-5%2. כשמגיעים 24 ו 72 h בתרבות, מכנית להתסיס את הבקבוקון. לנתק סוגי תאים שאינם מחסידי, כגון נוירונים ו אוליגודנדרוציטים.
- לאחר מכן, בכל אחד timepoints האלה, לבצע שינוי מדיה. להחזיק את הבקבוק אנכית כדי שהתקשורת תרבות שוכנת על החלק התחתון של הבקבוק, לא מסתיר את התאים מודבקת. האחות המדיום תרבות עם פיפטה פסטר, הקשה על קצה פיפטה נגד בפינה התחתונה של הבקבוק כדי להימנע מחלץ את התאים. למקם את הבקבוק. את המיקום האופקי המקורי ולהוסיף בעדינות 10 מ"ל אסטרוציט בינוני מעל התאים עם פיפטה סרולוגית.
- להחזיר את המבחנות החממה לאחר כל שינוי מדיה. אחרי 90% confluency מושגת, מכנית להתסיס את הבקבוקון פעם נוספת כדי להסיר תאים ללא הקפדה הנותרים.
- המעבר האסטרוציטים את לוקח את המדיום תרבות עם ואקום, פיפטה של פסטר. הוסף 5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA עם פיפטה סרולוגית על פני התאים מודבקת. בעדינות להתסיס את הבקבוק כדי להבטיח שטריפסין מכסה את כל התאים, דגירה. הבקבוק למשך 5-7 דקות ב 37 ° C ו- 5% CO2.
- להרוות טריפסין על-ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום אסטרוציט לתאים עם פיפטה סרולוגית. לחלץ את הפתרון הסלולרי הבקבוק עם פיפטה סרולוגית ולהעביר אותו שפופרת צנטרפוגה סטרילי 15 מ"ל. Centrifuge את הצינור ב g x 200 למשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית ולאחר resuspend זה ב 1 מ"ל אסטרוציט תרבות בינוני. להתסיס את הצינור כדי להבטיח שהפתרון הסלולרי הוא הומוגני. לספור את מספר התאים הפתרון עם hemocytometer או מונה אוטומטי תא הניתן.
הערה: בקבוקון זה 90% confluent בדרך כלל מניבה כ 3 מיליון האסטרוציטים. - להוסיף 10 מ של מדיום תרבות אסטרוציט בקבוקון T-75. לבצע לדילול 1:4 על ידי העברת µl 250 של הפתרון הסלולרי (שלב 2.1.18) עם micropipette הבקבוק T-75 כבר המכיל תרבות בינוני. להתסיס בעדינות כדי להבטיח התפלגות התא הומוגנית ברחבי השטח + בקבוקי שתייה צידניות.
- חזור על צעדים 2.1.16-2.1.19 בכל פעם confluency 90% מושגת על המעבר את התאים.
- תא עצב בקליפת המוח בידוד מעוברים עכבר
- בצע את ההכנות דומה צעדים 2.1.1 ו 2.1.2, למעט זה התקשורת prewarmed תרבות שיתוף מדיה, המורכב Neurobasal בינוני + 2% תוספת B-27 (עבור נוירונים) + 1% G-5 סרום ללא תוספת (עבור האסטרוציטים) + 0.25%-גלוטמין.
- המתת חסד יום עובריים בהריון-מתוזמן 18 חולדות ספראג-Dawley עם פחמן דו-חמצני חנק ואשר למוות ע י עריפת ראשו.
- תמצית העוברים עכברוש ומנתחים את cortices משאר הרקמה המוחית בפטרי המכילות HBSS על פני השטח של גוש גרניט צוננת, באמצעות סטריאוסקופ הנחיה חזותית, מספריים מעוקר, microscalpel של מלקחיים53 . לאחר הקרע רצופים של ראשי, המוח האונות, cortices, להעביר כל רקמה חדשה מלא HBSS פטרי.
- מינצ הרקמה בקליפת המוח לחלקים קטנים יותר כדי להגדיל את שטח הפנים של טריפסין. העברה 4-6 cortices עם פסטר פיפטה לרכבת התחתית עם 5 מ של טריפסין prewarmed-EDTA ולתחזק ב 37 מעלות צלזיוס מביצועם הרקמה. ב- 5-7 דקות ידנית להתסיס את הצינור כדי לערבב ולמנוע הצליעה של הרקמה.
- הסר את הצינורית של 37 ° C לאחר 10 דקות. כפי שהוסבר קודם לכן בשלב 2.1, לחלץ את טריפסין-EDTA, תחליף עם 1.8 מ של 0.15 מ"ג/מ"ל DNAse פתרון. לאחר מכן, מערבולת הרקמה עד הפתרון מופיע הומוגני, עם אין שברי רקמת צף בנוזל.
- Centrifuge הפתרון רקמות הפומבית ב g x 200 למשך 3 דקות. לאחר הסרת את תגובת שיקוע, resuspend ב 2 מ של תרבות משותפת בינוני. לספור את מספר התאים בפתרון זה עם hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
הערה: התשואה הרגילים היא 3.0-5.0 x 106 תאים/קורטיקלית האונה. - להכין פתרון סלולרי חדש עם צפיפות של 2.0-4.0 x 105 תאים למ"ל בתקשורת תרבות משותפת שהוגדרו לעיל.
3. פיתוח של הכבלים Astrocytic בתוך המיקרו-העמודות
-
ECM הליבה פבריקציה נוספת
הערה: ה-ECM יש להוסיף הפנים של הידרוג המיקרו-העמודות באותו יום שבו תא זריעה, יבוצעו.- בתוך ארון אבטחה, להכין 1 מ"ג/מ"ל של תמיסת זנב החולדה מסוג קולגן במדיום תרבות משותפת צינור microcentrifuge סטרילי. לשמור על הצינור microcentrifuge עם פתרון ה-ECM על קרח כל הזמן. חוץ בשימוש.
- העברת µL 1-2 של פתרון ה-ECM עם micropipette על רצועת נייר לקמוס כדי להעריך את החומציות. להוסיף 1 µL 1 N הידרוקסיד הנתרן (NaOH) או חומצת מלח (HCl) עם micropipette כדי להגדיל או להקטין את ה-pH של התמיסה ECM, בהתאמה, פיפטה למעלה ולמטה כדי homogenize. בדוק את ה-pH חדש עם רצועת נייר לקמוס ולהוסיף יותר חומצה או בסיס, לפי הצורך, עד ה-pH תהיה יציבה בטווח 7.2-7.4.
- להעביר את צלחות פטרי שלב 1.2 ברדס לנתיחה, להעביר 4-5 מיקרו-עמודות או סירה עם מלקחיים בסדר סטרילי ריקה, סטרילי 35 או 60 מ מ פטרי. באמצעות את סטריאוסקופ להדרכה, מקם קצה 10 µL micropipette בקצה אחד של כל עמודה מיקרו, שאיבה לרוקן לומן של בועות DPBS ואוויר. אשר העדרו של בועות אוויר עם סטריאוסקופ כדי להבטיח ה-ECM הוסיף בשלב הבא יכול לזרום בחופשיות ברחבי לומן.
- לטעון micropipette P10 של פתרון ה-ECM, במקום µL 10 עצה כנגד קצה אחד של הידרוג המיקרו-העמודות, ולספק פתרון מספיק כדי למלא לומן (כ 3-5 µL), התבוננות על כניסת ECM עם סטריאוסקופ. Pipette (µL 2-4) מאגר קטן של פתרון ה-ECM בכל אחד מהקצוות של המיקרו-העמודה.
הערה: תמיד לנהל מיקרו-עמודות של 4-5 או בסירה אחת בכל פעם כדי למנוע ממושך ייבוש של המבנה, כמו התוצאה עשויה הקורסת של מבנה מיקרו-טור. מיקרו יבשים לחלוטין-עמודות לצרף בחוזקה אל פני השטח של הכלים פטרי, אשר מונע ניצול שלהם עבור תא זריעה. אין אפשרות להוסיף עודפות של תרבות שיתוף מדיה (כאמצעי הידרציה) המיקרו-בעמודות כי הדבר עלול לגרום את ה-ECM לזרום החוצה במהלך תקופת הדגירה המתוארים להלן. - פיפטה תרבות שיתוף מדיה טבעת סביב הפטרי לספק כיור לחות כדי למנוע את העמודות מתייבשת בתקופת הדגירה. דגירה הפטרי המכיל המכיל ECM המיקרו-העמודות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב 1 h כדי לקדם פלמור של קולגן לפני הוספת את הנוירונים ו/או האסטרוציטים.
הערה: ה-ECM צריך ליצור שכבת ציפוי המשטח הפנימי של לומן חלול, במקום גרעין ECM מוצק המקיף את הפנים, אשר שניהם יכול להיות שנצפו באמצעות סטריאוסקופ. אם ה-ECM טפסים גרעין, המשך תקופת הדגירה עד שנשאר רק את השכבה. עם שכבה זו נוצר, הפתרון תא אסטרוציט ניתן למלא את הפנים של המיקרו-העמודה השלבים ציפוי. - במהלך תקופת דגירה, להכין את הפתרון תא אסטרוציט (כמפורט להלן).
-
אסטרוציט ו נוירון זריעה בעמודות-מיקרו
- המעבר של האסטרוציטים מצופה (בין המעבר הרביעי ו-12) כמוסבר שלבים 2.1.16-2.1.19. לאחר ספירת מספר התאים הבקבוק, להכין פתרון תא צפיפות של 9.0-12.0 x 105 תאים למ"ל פתרון מושעה בתקשורת תרבית תאים.
- שימוש סטריאוסקופ, המקום קצה micropipette P10 בקצה אחד של המיקרו-העמודות, להעביר תא מספקת פתרון (µL ~ 5) לתוך לומן למלא אותה לחלוטין. כפי שנעשה לעיל עם ECM, להוסיף מאגרים קטנים של פתרון תא בשני הקצוות של כל מיקרו-עמודה.
- דגירה המיקרו-העמודות מצופה על בצלחות פטרי-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לשעה לקדם את הקובץ המצורף של האסטרוציטים ECM. אם נוירונים לא יתווספו מיקרו-עמודות, להמשיך לצעוד 3.2.5.
- בעקבות תקופת הדגירה הראשונית, להוסיף 1-2 µL של הפתרון נוירון קורטיקלית שהושג בשלב 2.2.7 בשני הקצוות של המיקרו-העמודות עם micropipette, תוך התבוננות על תחת סטריאוסקופ. ודא כי מדיה מספיקה נוכח הכלים כדי למנוע ייבוש ולאחר תקופת דגירה שוב של 40 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לאפשר הידבקות של נוירונים.
הערה: פתרון תא עצב בקליפת המוח גם ניתן להוסיף 1-2 ימים לאחר היווצרות צרור, ביצוע שלב 3.2.4 לאחר בקפידה הסרת התקשורת התרבות צלחת פטרי עם micropipette. - לאחר דגירה תקופה, בזהירות למלא את פטרי המכילות את העמודות-המיקרו מצופה עם 3 או 6 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה עבור 35 או 60 מ מ צלחות פטרי, בהתאמה. לשמור על המיקרו-העמודים מצופים בתרבות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי לקדם הרכבה עצמית של חבילות astrocytic מיושר, אשר יוצרות מבנה ארוזות, כמו כבלים לאחר 6-10 h.
-
ייצוב לאדריכלות כבל אסטרוציט
הערה: לאחר היווצרות חבילות, כ- 6-12 h של culturing המבנה, בצע את השלבים הבאים כדי למנוע את התמוטטות המבנה המיושרת של פיגומים astrocytic.- צינור microcentrifuge סטרילי, להכין קולגן זנב החולדה 3 מ"ג/מ"ל אני הפתרון ב תרבות שיתוף מדיה. התאם את רמת החומציות של הפתרון 7.2-7.4 ביצוע שלבי ההליך המפורטים בשלב 3.1.2. לשמור על קולגן מניות ותרבות משותפת בתקשורת על הקרח כאשר אינו בשימוש, ולמקם את הפתרון קולגן מוכן על קרח בכל עת.
- הסר את המדיה פטרי המכילות פיגומים astrocytic עם micropipette, להשאיר כמה כלי תקשורת בצדדים של המנה ליצירת כיור בלחות המבטיח את הידרציה של המיקרו-העמודות. המקום המנה תחת סטריאוסקופ כדי לסייע פריט חזותי.
- עם micropipette, לקחת 2-3 µL של פתרון קולגן, הפרשות בכל קצה של המיקרו-העמודות, באמצעות את סטריאוסקופ עבור הנחיה חזותית. ודא שהמנה יש מדיה מספיקה בצדדים לפעול כמו כיור לחות בקצוות של המנה. דגירה של צלחות פטרי עם המיקרו-העמודות למשך 30 דקות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב חממה humidified כדי לקדם את gelation של הקולגן שנוספו לאחרונה.
- לאט לאט להוסיף 3 או 6 מ"ל של תרבות שיתוף מדיה (35 או 60 מ"מ פטרי מנות, בהתאמה) כדי פטרי מנות פיפטה, תרבות את הכלים חממה humidified ב 37 oC ו- 5% CO2.
4. החילוץ של חבילות Astrocytic מן הפנים הידרוג
- לחטא coverslips זכוכית דקה ב החיטוי. להכין פתרון µg/mL 20 של פולי-L-ליזין (PLL) במים כיתה תרבות תא סטרילי.
- בתוך ארון אבטחה, באופן ידני להעביר את coverslips זכוכית מעוקר דקה ס מ 10 עקר פטרי, וכן להוסיף פתרון PLL מספיק כדי לכסות על coverslips.
- דגירה על coverslips, מכוסה הפתרון PLL, למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי להרגיע את השטח. הסר את הפתרון PLL עם פיפטה פסטר לאחר 30 דקות יש לשטוף שלוש פעמים על-ידי הוספת תא תרבות כיתה מים coverslip הסרתו עם פיפטה פסטר.
- לאחר היווצרות הצרור גליה מיושר, להעביר המיקרו-העמודה בעדינות אל צלחת פטרי סטריליות עם מלקחיים בסדר סטרילי, וכן להוסיף בריכה קטנה של 10 µL של תרבות שיתוף מדיה עם micropipette כדי למנוע התייבשות ולהבטיח צרור בריאות. לחלץ את הצרור astrocytic הידרוג המיקרו-עמודה על-ידי משיכה עדינה מקצה אחד עם מלקחיים כירורגיים סטרילי, שימוש סטריאוסקופ עבור הנחיה חזותית.
- מחזיק את הצרור astrocytic עם מלקחיים, לעלות אותו על coverslip PLL מצופים. לתקן, כתם עם פרוטוקול להלן.
5. Immunocytochemistry ללימודי במבחנה
הערה: במחקר זה, הנוגדנים העיקרי היו ארנב אנטי-גליה חומצי fibrillary חלבון (GFAP) (שבערך), העכבר השלישי נגד-β-טובולין (שבערך), ראביט אנטי-קולגן אני (שבערך) העכבר אנטי-nestin (1:200), ארנב אנטי-vimentin (1: 100). הנוגדנים משני היו חמור אנטי-העכבר 568, החמור נגד הארנב 568, החמור נגד הארנב 488, והעכבר חמור נגד 568 (שבערך כל). בכל המקרים, להוסיף נפח מספיק של כל פתרון לכסות לגמרי את העמודות המיקרו.
- להכין פתרון פורמלדהיד נפח/אמצעי האחסון (v/v) 4% ב- x DPBS 1 בתוך ברדס fume כימי.
התראה: פורמלדהיד הוא תרכובת רעילה ידוע כמסרטן, חייב להיות מסולק במיכל נפרד. תמיד לתפעל את המתחם בתוך ברדס fume כימיים ולהשתמש ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כגון מעיל מעבדה, בטיחות משקפיים וכפפות. - במקרה של המיקרו-העמודות, למחוק את מדיה תרבות פטרי המכילות את בונה עם פיפטה פסטר בלי בטעות suctioning הגלילים הידרוג. הוספת פתרון פורמלדהיד מספיק כדי לכסות המיקרו-העמודות או את coverslips הנטען (שניהם נשארים על בצלחות פטרי) ואת תקופת דגירה של 35 דקות ב 18-24 ° C.
- לחלץ את הפתרון פורמלדהיד 4.0% מ קבוע המיקרו-העמודות או את coverslips עם פיפטה סרולוגית. יש לשטוף את העמודות-המיקרו קבוע 3 פעמים עם PBS על-ידי הוספת במהירות, הסרת PBS פעמיים ואת ולתת להם להשרות במשך 10 דקות בפעם השלישית.
- להמיס סרום סוס רגיל (NHS) ב- PBS עבור ריכוז של 4% v / v. הכן פתרון עם סבון ללא יונית-ריכוז של 0.3% v/v באמצעות הפתרון NHS כמו הממס.
- הסר את PBS פטרי המכילות המיקרו-העמודות או את coverslips עם פיפטה. הוסף מספקת פתרון דטרגנט 0.3% כדי לכסות על המיקרו-העמודות/coverslips עבור 60 דקות ב 18-24 ° C כדי permeabilize את התאים.
- להוציא את הפתרון דטרגנט, ולאחר מכן לשטוף במהירות פעמיים עם PBS, שלוש פעמים למסמס עבור 5 דק חישוב הנפח הנדרש של 4% NHS וכל אחד של הנוגדנים העיקרי להכין פתרון עם ריכוז נוגדן הרצוי.
- להסיר את PBS צלחות פטרי ומוסיפים מספיק נוגדנים הראשי (מדולל ב 4% NHS-DPBS) פתרון כדי לכסות המיקרו-העמודות או חבילות astrocytic שחולצו. דגירה לילה (12-16 ג) ב 4 º C.
- להוציא את הפתרון נוגדן ראשוני ולשטוף במהירות פעמיים עם PBS, שלוש פעמים למסמס למשך 5 דקות. הכינו את הפתרון נוגדנים משניים, בחושך, עם כל נוגדן נוכח לדילול שבערך ב- 4.0% NHS פתרון.
- דגירה תאים עם הפתרון נוגדנים משניים עבור 2 h ב- 18-24 מעלות צלזיוס. לאורך כל זמן של דגירה, לכסות את פטרי המכילות המיקרו-העמודות ברדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה לאור.
- להסיר את הפתרון נוגדנים משניים ולהוסיף Hoechst פתרון (1:10, 000) למשך 10 דקות ב 18-24 מעלות צלזיוס כתם הגרעינים.
זהירות: Hoechst היא מוטגן ידוע כי יש להתייחס כאל חומר מסרטן. לכן, זה חייב להיות מסולק במיכל נפרד, עיקרון השוויון הפוליטי אמור לשמש בכל עת כאשר מניפולציה סוכן זה. - לשטוף עם PBS חמש פעמים, בכל פעם במשך 5-10 דקות לאחר מכן, לאחסן המיקרו-העמודות ויטראז'ים ב 4 ° C ב- PBS ומכסים ברדיד אלומיניום. במקרה של חבילות astrocytic הנטען, להוסיף טיפה של הרכבה מימית בינוני על הצרור במקום אחר coverslip זכוכית מעל הצרור קבוע, חותם בשני coverslips עם לק עבור אחסון לטווח ארוך והדמיה עוקבות.
6. הכדאיות Assay עם חי-מת (Calcein-AM/אתידיום Homodimer) Staining
- להכין את הפתרון מגיב על-ידי הוספת 10 מ"ל של 1 x DPBS μl 5 calcein AM (4 מ מ בנטול מים דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) וμl 20 אתידיום homodimer-1 (EthD-1) (2 מ מ ב- H דימתיל סולפוקסיד2O 1:4 וי/v...). לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום או לאחסן בחושך כדי להגן עליה מפני האור.
- האחות מדיה הפטרי המכיל המיקרו-העמודות מצופה עם פיפטה פסטר, וכן להוסיף פתרון מספיק (להכין לעיל) כדי לכסות את המבנים. תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, שמירה על צלחת פטרי מכוסה כדי להגן על הפתרון מן האור.
- הסר את הפתרון עם micropipette או פיפטה פסטר. לשטוף 2 - 3 פעמים עם DPBS כמוסבר בשלב 5.3. להציף את צלחות פטרי עם DPBS בהתאם לגודל המנה. התמונה תאים מיד לאחר מכן שימוש epifluorescence או הדמיה קונפוקלי.
הערה: המרה של calcein קרום חדיר AM כדי calcein על ידי תאים פעילים סמויה התשואות של זריחה הירוק של calcein. תאים מתים מסומנים ממברנה-לסיכון תאים, אשר להתיר את כניסתם של EthD-1 לתוך התא שלה מחייב חומצות גרעין, גורם פלואורסצנטי אדום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתחילה, שלב-ניגודיות מיקרוסקופ שימש כדי לעקוב אחר ההתקדמות של אדהזיה אסטרוציט היווצרות צרור ואת יציבותו הכללית cytoarchitecture כפונקציה של הזמן. ב- h 1 לאחר ציפוי, האסטרוציטים נמצאו ברחבי לומן של המיקרו-העמודות עם מורפולוגיה כדורית (איור 2 א). -5 שעות, האסטרוציטים התחיל להרחיב תהליכים, קבלנות, בעוד מאת 8 h תאים הציג מורפולוגיה מלאה של תהליך מניבי ויצרו מבנים דמויי-כבל מונחה לאורך ציר האורך של העמודה המיקרו (איור 2 א). ראוי לציין, לעומת מפוזרת בתחילה הנוכחות של תאים המיקרו-העמודות, האסטרוציטים הופיע שנדבקתי ליצור רשת של חבילות צפופה לאורך הפנים (איור 2B). לאחר יישור תא הראשונית, הרשתות אסטרוציט תדירות ומשך יחד לאורך ציר האורך, דמוי רוכסן סגירה, כדי ליצור חבילה צפופה במרכז של המיקרו-הטור (איור 2C). היווצרות של ארכיטקטורה מצורפות זו היה בשל תהליך הרכבה עצמית, בחלקם מוכתב על ידי הבחירה של צפיפות התאים והמזהה מיקרו-טור. האסטרוציטים מיושר ונרכשה על מורפולוגיה דו-קוטבי כאשר נזרע מיקרו-עמודות עם זיהוי. של פחות מ- 350 מיקרומטר (איור 3B, העליונה והאמצעית, ו 3D-3F)49. להפך, תאים אלה הפגינו כיוון אקראי כאשר זיהוי של 1 מ מ היה מנוצל (איור 3B, התחתון), בדומה המראה של תרבויות אסטרוציט 2D לחשוף את הנסיוב-חופשית, בשיתוף תרבות בינוני (איור 3A, נכון). יתר על כן, למרות האסטרוציטים עדיין להציג יישור צפיפויות נמוכות זריעה (2.0 – 3.0 x 105 תאים למ"ל או 2.0 – 3.0 x2 10 תאים/מ מ3) (איור 3C), רשתות צפופות נוצרות רק בשעה הצפיפויות גבוהות (9.0-12.0 x 105 תאים למ"ל או 9.0-12.0 x 102 תאים/מ מ3) בתוך גלילי מיקרו-עמודי הממדים הדומים (ראה איור 3B, העליון), כפי שהוצע ב פרוטוקול49. הכדאיות בחבילות astrocytic הייתה לכמת, באמצעות וזמינותו חי/מת, כמו היחס של האזור של תאים ואזוריט גרין (calcein AM) יחסית מכלל השטח של תאים ואזוריט ירוק (calcein AM) ואדום (EthD-1). הכדאיות של חבילות astrocytic היה 97.4%, אשר דומה הכדאיות 98.2% של פקדים תרבות אסטרוציט 2D (איור 4A-4B), מוכיח כי הסביבה בתוך המיקרו-העמודות מתאים אסטרוציט חיוניות ( איור 4E). שחזורים תלת-ממד של התאים מתים וחיים פיגומים astrocytic גם להוכיח את היישור תא הכוללת בתוך המבנה (איור 4C-4 D). בנוסף, ארוכים במיוחד astrocytic מיקרו-עמודות פותחו כדי לחקור את היציבות של חבילות אסטרוציט עם אורך משמעותי. גם ממרחק יוצאת דופן של 3.5 ס"מ, cytoarchitecture של חבילות astrocytic מיושר, צפופה, מכווצים התקבלה באופן עקבי לכל אורך העמודה-המיקרו (איור 5A), ראיתי בבירור זום-אין באזורים מיקרו-עמודות (איור 5B-ג 5).
לאחר שהוקמה, חבילות היו קבועים, מוכתמת הטכניקות immunocytochemistry הלהט ביניים חלבונים האופייניים גלייה, כגון GFAP, nestin, vimentin. הדימויים קונאפוקלית אשר המורפולוגיה מניבי תהליך של האסטרוציטים ויישור האורך של תהליכים (איור 6 ואיור 7). ניתן לראות ביטוי החלבונים פילמנט ביניים בתרבויות בשתי 2D אסטרוציט (איור 7 א) כמו גם חבילות אסטרוציט בתוך העמודה המיקרו (איור 6, איור 7 ב-7 D). בנוסף, קולגן מכתים לאשר הנוכחות של חלבון זה ECM המיקרו-עמודות. האסטרוציטים לא יוצרים מבנה רציף עם הקולגן כאשר תרבותי בסביבה 2D (איור 8A), ואילו האסטרוציטים הופיע כדי לדבוק לשפץ הקולגן מתנה בתוך לומן כאשר תרבותי המיקרו-עמודות, המאפשר עבור חבילה להתכווצות כדוריות (איור 8 ב'). שכבת-על ערוצי GFAP וקולגן הוכיח כי הכבלים אסטרוציט כללה תהליכים הקשורים בחוזקה עם סיבי קולגן האורך (איור 8 ב'). לכן, מלבד המציע anchorage, קולגן הסיבים עשויים גם סיפקו ברמזים כיוונים נוספים עבור האסטרוציטים ליצור חבילות צפוף לאחר התכווצות. במקרים מסוימים, התכווצות אסטרוציט-קולגן עקביים, וכתוצאה מכך קריסה של הקיבוץ מיושר מעל 12-24 שעות לאחר היווצרות (איור 9 א). על מנת לייצב את הארכיטקטורה כבל דמוי אסטרוציט הערימות הידרוג המיקרו-, מטריצת קולגן נוספת נוספה לקצה חבילה מגובשת כדי לעכב עוד התכווצות והכיווץ. זה חיזוק בטכניקה מותר להישרדותה של הארכיטקטורה כבל הרצוי למשך 4 ימים לפחות, עם חלון זמן של יציבות צפוי (איור 9B). יתר על כן, נציג חבילות astrocytic היו מופק המיקרו-העמודה הידרוג רכוב, קבוע עם 4% פורמלדהיד על coverslips זכוכית דקה כדי להעריך את החוסן שלהם כאשר הם נחשפים לכוחות מתח, לסביבה החיצונית. גם לאחר מיצוי טיפול גופני לצורות שונות (איור 10A, 10 ב'), astrocytic somata ואת תהליכי מתוחזק מיושר, ארוזות מיקרו-סולם מורפולוגיה (איור 10C), המדגיש גמישים של לגרדום astrocytic עצמית מסודרים, פעם נוצר, גם אם תמיכה מבנית של המיקרו-העמודה הידרוג נעדר.
נוירונים בקליפת המוח העיקרי היו גם תרבותי משותף עם האסטרוציטים בתוך המיקרו-העמודות לחקור חבילות אסטרוציט מסוגלים מהשגיו אדהזיה עצביים, תוצר neurite. GFAP, החלבון microtubule β-טובולין השלישי היו המשמשים כסמנים ספציפי האסטרוציטים הנוירונים, בהתאמה. איור 11 א מציג האסטרוציטים נזרע במשותף עם נוירונים בקליפת המוח היו גם מסוגל מפגין תהליכים ויוצרים חבילות מיושר. נוירונים הופיע אמורים להיות מעדיפים חבילות אסטרוציט, מאז כל חיובי β-טובולין השלישי מכתים משותפת לשפות אחרות עם GFAP (שכבות איור 11B-ג 11). כדי להדגים את תכונות הרגנרציה של המבנה astrocytic, מצופים נוירונים בקליפת המוח (איור 12B) בעמודה הידרוג המיקרו-2 ימים לאחר האסטרוציטים היו מצופים (איור 12 א). נוירונים המצורפת הצרור אסטרוציט ולאחר מורחב neurites ישירות לאורך שטחים astrocytic. בדיקה נוספת הראה תוצר neurite אוריינטציה לכיוון של הכבל astrocytic, ואילו באזורים שבהם מערכת אסטרוציט לא היה נוכח, neurites נראו גדל באופן לא מאורגן (12C איור). תצפיות אלה מדגימים כי הפרוטוקול תוצאות ברשתות מיושר, מעשית, חזקים astrocytic שיש להם פוטנציאל לשמש מסלולים חי מושתלת קידום נוירון תוצר אדהזיה ו- neurite.
איור 2: מיקרוסקופ Brightfield מציגה את היווצרות אסטרוציט חבילות הידרוג מיקרו-בעמודות לאורך זמן. (א) אסטרוציט מורפולוגיה כפונקציה של הזמן לאחר ציפוי: האסטרוציטים (1h) הם כדורי במצב והתפזרו ברחבי הבונה; האסטרוציטים (5 שעות) ליזום תהליך ההרחבה והכיווץ; האסטרוציטים (8 שעות) מיושרים, מתכווץ. גודל ברים = 100 צרור היווצרות מיקרומטר. (B) לאורך זמן ב לגרדום נציג נוסף: (1h) בתחילה האסטרוציטים כדורית, לא מוצג תהליכים; (24 שעות) צרור צפופה של תהליכים astrocytic נוצר. גודל ברים = 300 מיקרומטר (משמאל) ו- 500 מיקרומטר (מימין). (ג) גובשה במלואה astrocytic צרור 24 שעות לאחר ציפוי, מציג אפקט "zippering", שבו הקצוות של הכבל הצמד לקצוות ברורים של הקירות של לומן. סרגל קנה מידה = 1000 מיקרומטר.
איור 3: הקוטר הפנימי של מיקרו-עמודה וההשפעה צפיפות תא הרכבה עצמית של חבילות המיושרת של הפרעה דו קוטבית האסטרוציטים. (א) תרבויות אסטרוציט 2D עם סרום המכיל מדיה (משמאל) ומדיה ללא סרום תרבות משותפת (מימין) להראות מורפולוגיה-תהליך והתהליך רב השפעה, בהתאמה. גודל ברים = 100 מיקרומטר. (B) האסטרוציטים נזרע על צפיפות גבוהה (9.0-12.0 x 105 תאים/mL) מיקרו-עמודות עם מזהה של 180 ו 350 מיקרומטר חבילות טופס מיושר ביחס ציר האורך, תוך זיהוי של 1 מ מ תוצאות האסטרוציטים הצגת מרובות, תהליכים unaligned לאורך הקוטר של לומן. גודל ברים = 100 מיקרומטר (למעלה, באמצע) ו- 150 מיקרומטר (למטה). (ג) האסטרוציטים נזרע בעמודה מיקרומטר 350 מזהה מיקרו-על צפיפות נמוכה (2.0-4.0 x 105 תאים למ"ל) מיושרים, אך לא ארוזות. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ד) כאשר מצופה בעמודה מיקרומטר 350 מזהה מיקרו-על צפיפות נמוכה או בינונית תא, האסטרוציטים לרכוש מורפולוגיה של הפרעה דו קוטבית. גודל ברים = 300 מיקרומטר. (E) תיבת D מציג זום-אין כוחם של הפרעה דו קוטבית האסטרוציטים טופס זה בתוך הידרוג המיקרו-העמודות. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. (F) דוגמה אסטרוציט דו-קוטבי בודדים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: האסטרוציטים מורדם לאחר היווצרות צרור בתוך הידרוג מיקרו-העמודה. (A-B), (C-D) שחזורים קונאפוקלית תלת-ממדית מציג את הכדאיות של תאים ברחבי מישורי תרבויות, חבילות astrocytic מיושר, בהתאמה, כפי לבדיקה עם homodimer calcein-AM/אתידיום מכתים (ירוק-live תאים; אדום-מת תאים). (E) כימות של תאים חיים וגם מתים כתוצאה באחוז דומה של האסטרוציטים חי/מת כאשר תרבותי על משטחים 2D ו- micro-עמודות. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: שלב חדות התמונה של נציג ארוכים במיוחד מיושר Astrocytic צרור בתוך הידרוג מיקרו-העמודה. (א) צרור היווצרות לכל אורך 3.5 ס"מ מיקרו-טור שלם. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. (B-C) גבוה יותר הגדלה זום-in בסה כ מציג אסטרוציט היישור באזורים שונים לאורך מכלול של הבונה, התואם התיבות ב- A. גודל ברים = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: Immunolabeling של פיגומים Astrocytic מדגים את היישור האורך של תהליכים Astrocytic. (א) שחזור קונאפוקלית של צרור astrocytic מציג כתמים GFAP (אדום; שמאלה), גרעינים (Hoechst; התיכון), כיסוי של שני ערוצים (מימין). (B) גבוה יותר הגדלה זום-אין של הקיבוץ astrocytic באזור A מסגרת מאפשר הדמיה של cytoarchitecture של האסטרוציטים מיקרו-בעמודות. גודל ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: אפיון של נציג חבילות Astrocytic דרך Immunocytochemistry. (A-B) האסטרוציטים תרבותי על משטחים 2D, נזרע ב הידרוג מיקרו-עמודות אקספרס סמנים astrocytic דומה GFAP (אדום), vimentin (ירוק). (א) שחזור קונאפוקלית של תרבות אסטרוציט מישורי דו-ממדי מציג את ערוצים נפרדים הממוזג. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) קונאפוקלית תמונות של צרור astrocytic, המאשר ביטוי סמנים ו showcasing אסטרוציט יישור. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C-D) האסטרוציטים בתרבית בתוך מיקרו-עמודות גם לבטא את הלהט ביניים חלבונים nestin (אדום) ו vimentin (ירוק). (ג) תמונה קונאפוקלית של צרור astrocytic. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) גבוה יותר הגדלה זום-אין של C. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: האסטרוציטים בחבילות מיושר מקרוב אינטראקציה עם מטריצה קולגן מכווצים, האורך, לעומת הסידור לא סדיר של קולגן בתרבויות 2D- התאים היו immunolabeled להתבונן האסטרוציטים (GFAP; אדום), גרעינים (Hoechst; כחול) ו קולגן (ירוק). (א) תרבויות אסטרוציט 2D עם קולגן-1 מ"ג/מ"ל להראות האסטרוציטים unaligned וקולגן מפוזרות באקראי. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. קולגן (B) הוא הוריד מן הקירות של לומן מיקרו-טור, מכווץ לטופס של מטריקס מיושר המהווה חלק הצרור astrocytic. סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: קולגן נוספים יכול לשמש כדי לייצב את המבנה של כבלי Astrocytic. (א) חבילות נוצר כ- 6 שעות אחרי ציפוי האסטרוציטים הידרוג מצופים קולגן מיקרו-בעמודות. ברגע חבילות נוצרו קולגן ריכוז (3 מ"ג/מ"ל) גבוה יותר הוסיפו את הקצוות של המיקרו-העמודה כדי לעכב את ההתכווצות של הכבלים astrocytic. ב בונה לא התייצבו עם קולגן נוספים, חבילות astrocytic-קולגן החלה החוזה על ידי 18 h, שהכבלים אסטרוציט קרסו לחלוטין על ידי 24 שעות ביממה. התכווצות זו לא נצפתה כאשר חבילות חיזוק עם 3 מ"ג/מ"ל קולגן. סרגל קנה מידה = 1,000 μm. (B) זום-אין של קרסו צרור astrocytic לא מחוזק עם 3 מ"ג/מ"ל קולגן. סרגל קנה מידה = 500 μm. (ג) זום-אין של אזורים מחוזק קולגן מיקרו-עמודות. אסטרוציט צרור מורפולוגיה נשמר לאורך כל מכלול של המיקרו-הטור. גודל ברים = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10: מיצוי של חבילות Astrocytic מיקרו-טור, גובר על coverslips זכוכית מצופה פולי-L-ליזין דקה Evidences החוסן של הטכניקה. (א) שלב חדות התמונה של כמה שחולצו חבילות astrocytic, מניפולציות לתוך איות המילה "פן". (B) שחזור קונאפוקלית של אותו חילצה חבילות צבעונית עבור סמן astrocytic GFAP (אדום) וגרעין התא (Hoechst; כחול). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ג) הגדלה של האזור מסגרת ב' מציג, גם כאשר מניפולציה לצורות לא סדיר, פיגומים astrocytic שומרים לעצמנו מורפולוגיה מיושר, הפרעה דו קוטבית cytoarchitecture מצורפות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. שים לב כי כל ההבדלים מבנית בין שלב תמונות קונאפוקלית הוא סביר להניח חפץ של בונה הסטה עקב שטיפה במהלך ההליך immunocytochemistry. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 11: נוירונים לדבוק ולהרחיב את Neurites לאורך חבילות אסטרוציט מיושר בעוד נוירון-אסטרוציט פיגומים תרבותי משותף- (א) שלב חדות התמונה של צרור astrocytic מתחילה נוירון. סרגל קנה מידה = 300 מיקרומטר. (B)-(ג) נוירונים נצפו לדבוק חבילות astrocytic ולהרחיב neurites לאורך הכיוון של הכבל (Hoechst-כחול; ירוק-GFAP; Β-טובולין השלישי-אדום). גודל ברים = 200 ו- 100 מיקרומטר, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 12: כבלים אסטרוציט לשמש לפיגום חי ביים תוצר Neurite. שחזורים קונאפוקלית מציג אזור של מיקרו-עמודה המורכב של נוירונים נזרע כ- 2 ימים לאחר היווצרות צרור. (א) GFAP-חיוביות אסטרוציט חבילות (B) β-טובולין השלישי-חיוביות נוירונים, מיזוג (C) של כל הערוצים, כולל הגרעינים שהוכתמו HOECHST (כחול). שים לב כי נוירונים הציג יישור neurite כאשר דבקה אזורים עם תהליכים אסטרוציט מיושר (חיצים), ואילו נוירונים לא דבקה ל מיושר האסטרוציטים הופיע שהפגינו אקראי (קרי רב כיוונית) neurite תוצר (חץ). (ד) זום-אזור מראה. הכיוון של תוצר neurite. גודל ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר לעומת הסביבה יותר תומכת של מערכת העצבים ההיקפית, מערכת העצבים מוגבל במיוחד בטיפול ההשלכות מזיקה של neurotrauma, הקשורים ניוון מוחיים. לאחר עלבון רציני מערכת העצבים יונקים, נוצרת צלקת גליה המורכב גרעין של תאים דלקתיים שהותירה מוקף meshwork צפופה של האסטרוציטים תגובתי לא מאורגן להפריש proteoglycans עיכוב תוצר של האקסון14. הצלקת הזו פועלת כמו חסימה ביוכימיות ופיזיות נגד לרגנרציה של האקסון סופים12. יתר על כן, מערכת העצבים יונקים בוגרים הנו מוגבל מקורות של נוירונים חדשים לשחזור תאים אבודים בעקבות טראומה או הקשורים ניוון מוחיים, מאז מרכזי neurogenic מוגבלים SVZ את הכישור משוננת בהיפוקמפוס, פוטנציאל אחרים בדרך כלל לא פעילים אזורים54. אסטרטגיית אידיאלי לעקוף בשני היבטים של היכולות שכעבור מוגבלת של מערכת העצבים, הנכשלים לגישות לכתובת. ככזה, קבוצת המחקר שלנו פיתחה מבוססי אסטרוציט פיגומים מכוון מציגים חי מסלולים עבור העברה עצבית לעבר אזורים חשוכת-נוירון והסיומת מודרכים של רגנרציה האקסון צמיחה קונוסים. חבילות astrocytic מיושר הכלול בתוך הפנים קולגן של מיקרו-טור agarose מהווים פיגומים astrocytic החיים האלה. הבדל ניכר מן קונבנציונאלי תא biomaterial מבוססות אסטרטגיות בשימוש עבור התחדשות ותיקון של מערכת העצבים המרכזית היא cytoarchitecture של המבנים האלו הוא לחלוטין שהופעתם בהם בתוך חוץ גופית כדי לדמות מספר ויוו הדרכה מבוססת-עכשיו, דונלד וארכיטקטורות פיגומים. למשל, במהלך התפתחות עובריים, עכשיו, דונלד רדיאלי מסלולים לפעול כפי חי פיגומים על נוירונים חדשים לפלטפורמת וקליפת, ותאי גלייה לתווך הרחבת יישוב של חלוצי אקסונים שהתחזה מצעים בדוגמת ו/או תאים guidepost35 38, ,39. עובריים עכשיו, דונלד מוקדית באזור subventricular לייצר גם האסטרוציטים בצורת צינורות גליה longitudinally מיושר, שבמהלכן neuroblasts להעביר נוצרו אחרי הלידה במבנה כבול-מן SVZ כדי OB41. יתר על כן, זה הוכח ביונקים מסוימים שאינם-זה, בעקבות CNS נזק, מידה רבה יותר של התחדשות אפשרית בשל היווצרות של מאורגן, מיושר סידור astrocytic44. לדוגמה, דג זברה הבוגרים מסוגלים להפיק מחדש שלהם שידרה בעקבות ההעברה של ילדותי גלייה כדי לאתר הנגע, בידול לתוך מורפולוגיה דו-קוטבי, התארכות של תהליכים גליה לגשר הנגע, ויוצרים נתיב זה הכוונת אקסונים ההתחדשות45. בונה מהונדסים מיושר חבילות astrocytic עשוי להיות מסוגל recapitulating מנגנונים אלה מציגים את האותות מסיסים מבניים הדרושים עבור הגירה העצבית בתיווך עכשיו, דונלד, האקסון התחדשות35. בנוסף, בשל הכללת האסטרוציטים מגורים, מבנים אלה יכול באופן פעיל להציג את רמזים סביבתיים הנדרשים בהתבסס על משוב מהמחשב המארח.
בשיטה שלנו, יישור אסטרוציט הוא תהליך הרכבה עצמית מכסה על סימנים פיזיים ואינטראקציות תא-תא קידמו את הקוטר הפנימי של מיקרו-טור, קולגן לריכוז צפיפות זריעה. תכונה נוספת של שיטה זו היא מושכת את גודלו בקנה מידה מיקרון, דבר אשר עלול לאפשר להשתלה פולשנית באזורים פגום של מערכת העצבים. יתר על כן, תוצאות שהוצגו בכתב היד להדגים כי המבנה שהושג עם הפרוטוקול בעלי יכולת הקיום גבוהה ולבטא את הלהט ביניים חלבונים GFAP nestin, vimentin, ללא קשר לגיל אסטרוציט כפי שהוגדרו על ידי מספר מעבר . בעוד הן GFAP והן vimentin באים לידי ביטוי האסטרוציטים לא בשלה ובוגרת, nestin הוא מוגבל בעיקר תאים מובחן או בוסר, עם מתבגר עכשיו, דונלד upregulating קולטני הביטוי של GFAP וייצור הפחתת nestin45, 55. הקודם מחקרים הראו כי אסטרוציט שינויים בהתנהגות עם הגיל, אולם הביטוי עקבית של חלבונים פילמנט ביניים, כמו גם bundling נראתה על פני מגוון של המעבר מספרים (פסוקים 4-12)56. פיגומים astrocytic גם הוצגו להשגת ארוכים במיוחד, סרגל סנטימטר אורכי במבחנה, אשר טוען כי טכניקה זו ניתנת להתאמה המרחק פציעה שונות, גיאומטריות נתקל ויוו. יתר על כן, חבילות astrocytic מיושר התערוכה המדהימה המבנית ויציבות, כפי cytoarchitecture כבל דמוי שלהם נשמר גם לאחר להיות נתון החילוץ המיקרו-העמודים. חיים מבוססי אסטרוציט פיגומים גם תמיכה נוירון אדהזיה ו neurite תוצר, מחזקת את הפוטנציאל של טכניקה זו כדי לקדם את סיומת ההעברה של האקסון נוירון מכוונת לתיקון מערכת העצבים המרכזית.
חבילות astrocytic מיושר נכללות פנים סילוק למטרתו הידרוג צינורי מגן. ייצור של פיגומים astrocytic מתחילה עם מיקרו-עמודה הרכבה על ידי החדרת מחט אקופונקטורה לתוך צינור קפילרי suctioning agarose נוזלי לתוך זה. Agarose היה biomaterial שנבחר בגלל שלה מאפיינים אינרטי, הביו מכניים לשליטה, מאפיינים פיזיים, הביוכימי49. ריכוז Agarose הידרוג עשוי להיות משתנה חשוב מאז תאי חוש גירויים מכניים מן המצע שלהם (למשל נוקשות) ולהגיב עם שינויים תאיים57. עיצוב קריטריונים עבור המיקרו-עמודות אלה כוללת של נקבוביות גבוהה מספיק כדי לאפשר תחבורה המונית נאותה, אבל קטן מספיק גודל הנקבוביות לאסור את תוצר תהליך לרוחב; קריטריונים אלה מסופקות על-ידי פתח בקנה מידה ננו-שהנקבוביות הן נוכח agarose-הריכוז בשימוש בפרוטוקול זה. ריכוז agarose ב פרוטוקול זה נבחר גם בשל יציבות, קלות הטיפול, ואת הדמיון במאפייני מכני הסביבה58המוח שלה. שיקול ראוי לציון הוא המיקום המרכזי של המחט בתוך צינור קפילרי. לעיתים קרובות, המחט עשוי להיות מעט מלוכסנות או העקורים במהלך התהליך, גורם לומן להיות ממוקם יחסית מחוץ למרכז הקירות החיצוניים בעקבות gelation agarose והסרת מיקרו-עמודה באמצעות הרכבת התחתית. כדי למנוע זאת, המחט צריך להיות ישר, מכלול הבוכנה-צינור-מחט צריך להישמר בצורה מאונכת בזמן agarose להיות מצויר לשמר את המחט לאורך הציר המרכזי. ריכוז מדויק של לומן ומשמרת את האסטרוציטים מיושר בין הקירות agarose; לומן הוא נוטה יותר אם ממוקם proximal השפה החיצונית של הגליל. בנוסף, מרחק מספיק בין לומן הקיר החיצוני עשוי להציע הטבות מגן במהלך ואחרי השתלת (בתנאי המבנה astrocytic לא יוסרו מן המנזר מיקרו-עמודה כדי implant). זה השלב הראשוני של ייצור לגרדום astrocytic הוא בעל חשיבות עליונה להצלחת השיטה, כמו הבחירה של קוטר המחט הוא קריטי עבור אסטרוציט נאות soma/תהליך יישור וכבלים הרכבה עצמית. מצאנו כי יישור אסטרוציט הייתה תלויה הפוך מיקרו-בעמודה מזהה, עם טווח מזהה אופטימלית עבור תא יישור והיווצרות של חבילות אסטרוציט חזקים להיות 180 עד 350 מיקרומטר (איור 3). באופן דומה, זה הודגם קודם לכן כי נוירונים ישיר תוצר שלהם לאורך הכיוון של עקמומיות המצע המינימלי כדי להפחית את תהליך כיפוף59,60, מנגנונים דומים צפויים בעבודה כדי להשפיע על אסטרוציט המערכת שלנו49היישור. בנוסף עקמומיות המשפיעים על יישור אסטרוציט, מצאנו כי של 180 עד 350 מיקרומטר זיהוי טווח גרמו האסטרוציטים רכישת של הפרעה דו קוטבית מורפולוגיה49, בניגוד הטופס stellate, רב-קוטבי נצפתה עם מזהה של 1 מ מ או כאשר האסטרוציטים היו תרבותי ב 2D (איור 3). סביר להניח כי אלה שינויים מורפולוגיים מורפולוגיה אסטרוציט דו-קוטבי לשנות את המאפיינים הפיזיולוגיים שלהם כמו גם; למשל, אלה האסטרוציטים עשוי לבטא גורמים secretable חלופי או סמני פני שטח התא עשוי להיות יתרון עבור התחדשות, אבל זה עוד יותר ייפוי כוח אפיון. בסך הכל, הממצאים שלנו להפגין כי מבחר מתאים של סימנים פיזיים, כגון עקמומיות השטח, הן לבריאותה של הדמיית cytoarchitecture מקורי בחי astrocytic פיגומים.
בניית פיגומים astrocytic ממשיך עם הכללת רציפים של פתרון ה-ECM קולגן, האסטרוציטים בקליפת המוח לתוך הפנים החלול של המיקרו-העמודות. לומן הפנימי של המיקרו-הטור מצופה קולגן לתמוך אסטרוציט הישרדות, קובץ מצורף, היווצרות צרור מיושר, בשל חוסר היכולת של agarose לתמוך באופן עצמאי neurite תוצר61. ריכוז קולגן של 1 מ"ג/מ"ל נבחר מחקרים קודמים נקבע כי ריכוזי נמוכות וגבוהות, גרמו חוסר הידבקות וחוסר יציבות של ECM, בהתאמה49. לפיכך, כצפוי, ריכוז קולגן יש השפעה דרמטית על היעילות של טכניקה זו. יתר על כן, פתרון ה-ECM מורכב רק סוג אני קולגן. כאשר לעומת laminin ותערובות מצופים Matrigel עבור תרבויות astrocytic 2D, האסטרוציטים מצופה בסוג אני אדהזיה אופטימלי קולגן הפגינו ו היווצרות רשת62. זמן הדגירה משמש הקולגן הפילמור לפני תא זריעה הוא גם צעד חיוני בפרוטוקול. קודם לכן מצאנו כי כאשר נוירונים נמסרו/ת באמצעות ECM unpolymerized agarose המיקרו-בעמודות, תוצר neurite מופחת, עצב fasciculation היו ראיתי47, זה אפשרי כי ממצאים אלה להאריך האסטרוציטים גם כן. מאז קולגן נדרשת עבור אדהזיה אסטרוציט היווצרות צרור, הנוכחות של ECM ברחבי הבונה ואת העדר בועות אוויר או כיסים ריקים צריך להיות דמיינו והוא אישר עם טכניקות מיקרוסקופיים.
הפרוטוקול מסכם עם אסטרוציט יופיצ, תקופת דגירה כדי להבטיח תא אדהזיה קולגן, ותרבות לטווח קצר להיווצרות cytoarchitecture המטרה. האסטרוציטים בין קטע מספר 4-12 שימשו, כפי שהם הציגו חזקים astrocytic הרפורמציה bundling וקולגן. האסטרוציטים אלה הציג גם הפנוטיפ בוגרת המורכב > 95% טהור תרבויות63,64 עם מעט שום זיהום עצביים. בניגוד תרבויות אסטרוציט רגילים, אשר מעסיקים סרום המכיל בינוני (איור 3 א, משמאל), הטכניקה שלנו מנצל ללא סרום בינוני כדי לאפשר האסטרוציטים לאמץ תהליך מניבי מורפולוגיה (איור 3 א, ימין ) ויוצרים חבילות של somata מיושר ותהליכים בתוך65,62,66מיקרו-עמודות. מבחינת תא זריעה ריכוז, ריכוז גבוה בטווח של 9.0-12.0 x 105 תאים למ"ל, עם זיהוי של 350 מיקרומטר, גרמו להיווצרות של חבילות אציקלוביר בליווי קולגן שיפוץ, בעוד האסטרוציטים פוזרו יותר , אבל עדיין מיושר, כאשר ריכוז נמוך יותר נוצלו (איור 3C). לכן, ההשפעה של זריעה ריכוז על אינטראקציות תא-תא משפיעה מידת אסטרוציט היישור ואת היווצרות המבנים כבל דמוי שנצפו. ההזרקה של הפתרון תא לתוך לומן הוא בדרך כלל visualized באמצעות סטריאוסקופ על מנת להבטיח משלוח הומוגנית על פני האורך של מיקרו-טור, על היווצרות צרור רציפה. לאחר זריעה, זמן הדגירה ראשוני לפני השטפונות עם תרבות המדיה הוא חיוני כדי לאבטח את המעגנה של האסטרוציטים ECM. משך הזמן ניתן לשנות אם האסטרוציטים לברוח מן המבנה, ובלבד המבנה נמצאים מספיק humidified כדי למנוע ייבוש. תמונות חדות שלב של פיגומים astrocytic כפונקציה של זמן כי עד 8 h, רשת של חבילות astrocytic מיושר הוא בתהליך בהקמה. בנוסף, הניתוק של ECM הקיר לומן, התכווצות שהתפתח שלה, האגודה הדוק בין תאי הקולגן מכווצים נצפתה כאשר בונה הודבקו תוויות קולגן, GFAP כמוצג באיור8. תופעה זו היא כנראה תוצאה של astrocytic כוחות כויץ ניתוק הקולגן מהקירות, בהתבסס על דיווחים קודמים של מקיבולת פיברובלסט דמוי גלייה לייצר כוחות המטים סובסטרטים גמיש ובניה של המטריקס- היכולת של האסטרוציטים ב אסטרוציט בלבד ובתרבויות נוירון-אסטרוציט משותפת28,-49,-67,-68. באופן ספציפי, אחת ההשלכות של תנועתיות אסטרוציט ו בתיווך אינטגרין האינטראקציה עם קולגן הסיבים הוא הדור של כוחות מספיקים לכווץ את הסיבים17,69. בסך הכל, מימוש הפרוטוקול המתואר יהיה לייצר פיגומים מגורים המורכב רשתות שהורכב עצמית של צפוף, מיושר astrocytic כבל מבנים דמויי-זה מסכם את הדברים נוכח מספר שלבים של התפתחות מערכת העצבים המרכזית הפיזי סובסטרטים.
בנוסף בודדים בעיות עלולות לצוץ ברחבי הפרוטוקול, הטכניקה לגרדום astrocytic הנו מכשולים אחרים שעשויים להשפיע על יכולתה כדי לתקן את מערכת העצבים. למשל, ההצלחה האולטימטיבי של טכניקה זו נמדדת לפי מערכת העצבים פלסטיות ושילוב תפקודי של לגרדום astrocytic עם המעגלים המארח. הקשורים ההשתלה של פיגומים אלו היא האפשרות מתגובה דלקתית זה עלול לסתור את התכונות משובי pro של חבילות astrocytic. כל טכניקות מבוססות ההשתלה יש יכולת קרע את מחסום הדם - מוח ולגרום חדירה של תאים דלקתיים, בשל הקרבה בין הנוירונים נימים ב רקמת47. במקרה זה, המיקרו-העמודה הידרוג או ערכת למטרתו עוד על פיגומים astrocytic היכולה לשמש ככלי לשחרור מבוקר של גורמים אנטי דלקתיות להפחית את התגובה דלקתית. בתחילה, הצרור astrocytic מיושר הייתה לא יציבה בתוך העמודה-המיקרו, כמו הכוחות לאלץ יישור תא, מטריקס שיפוץ והוביל בסופו של דבר לקריסת cytoarchitecture הרצוי לאחר 1-2 ימים בתרבות. עם זאת, כיווץ נוסף להתכווצות צרור היה המניע על-ידי מתן חיזוק נוסף עבור חבילות בקצוות של המיקרו-העמודה על-ידי הוספת קולגן ריכוז גבוה יותר על מנת להחזיק את הצרור במקום. טקטיקה נוספת יכול להיות להעסיק כימוס המשני, לפיה ציפוי הידרוג החדשה מוחלת על חבילות astrocytic מיושר כפי שהם נמשכים המיקרו-העמודים. יש להניח כי המשלוח של הרשתות אסטרוציט מיושר לתוך המוח גם לייצוב המבנה עקב הדבקויות תא-תא בין תאי הפונדקאי ובבניית לכל אורכו, למרות יהיה צורך להיבדק ישירות במחקרים עתידיים.
בהתאם לכך, המאמצים העתידיים יהיה מכוון לפתח שיטה יעילה השתלת המבטיחה והגנת של הקיבוץ astrocytic במהלך ואחרי משלוח ויוו כדי לאפשר הגירה העצבית, תיקון, ו התחדשות ב מערכת העצבים פצועים. בעבר הראו השתלה מוצלחת של עצביים/עצב-מבוסס מיקרו-TENNs, אשר חולקים את ערכת למטרתו של המבנה astrocytic, במשעולים corticothalamic, וכתוצאה מכך שילוב הישרדות מבניים עם המארח רקמה-לפחות עד חודש46,47. לפיכך, אפשר לנצל את היציבות של הכבלים לאחר החילוץ המיקרו-העמודים. במקרה זה, הידרוג agarose תשמש המיטה התרבות הראשונית לזירוז הרכבה עצמית ואז הכבל astrocytic ניתן להסיר את למטרתו מוזרק ישירות לתוך המוח באמצעות מחט עם קירות דקים. אסטרוציט דפורמציה בשל כוחות מכני במהלך החילוץ הידרוג המיקרו-עמודה לא נצפתה, והוא לא צפוי. העבודות הקודמות לומד את ההשפעות של דפורמציה מכאנית על אסטרוציט תגובתיות עולה כי כל דפורמציה וכתוצאה מכך לא תוחל במהירות מספיק כדי לגרום astrocytosis או תהליך התארכות62,70. כדי למזער את הנזק רקמת המוח ואת התגובה דלקתיות אפשרי, חבילות בתוך הידרוג יכול להיות מושתלים בטכנולוגיה מחט-פחות שפותחו בעבר עבור מיקרו-TENNs. במתודולוגיה זו, הידרוג מצופה בשכבה דקה של חומצה גליקולית תאית המאפשר עבור מחט-פחות הערך לתוך המוח אשר עשוי לצמצם את טביעת רגלו משובש ולא דלקתית של ההשתלה47. לאחר מכן, השתלת מחקרים ניתן לבצע כדי להעריך את היכולת של אלה פיגומים כדי לשרוד, לשלב עם הרקמה המארח, לקדם העברה עצבית והדרכה האקסון. במיוחד, מבנים אלה עשויים להיות מושתלים עם קצה אחד שמקורם אזור neurogenic כגון SVZ כדי לגשת בריכת של תאי גזע עצביים, neuroblasts, תוך חיקוי ישיר של RMS של, ואת הקצה השני מחובר לאתר פציעה לנהוג באופן פוטנציאלי העברה עצבית ולאכלס את האזור אופנה מוניות.
מיד לאחר ההשתלה פרוטוקול אופטימיזציה, ניתן לשפר את הטכניקה בתחומים אחרים. המיקרו-העמודות יכול להיות מפוברק במיוחד עם האסטרוציטים ילדותי (למשל עכשיו רדיאלי, דונלד, תאים מסוג RMS) או בוגר פנוטיפים מתקדמים dedifferentiated להגדיל את קיבולת משובי בתדר של אלה בונה49. במבחנה דגמים של הצלקת גליה, האסטרוציטים בוגר לא הייתה את היכולת להרכיב נתיבים האקסון תוצר71. לעומת זאת, לא בוגר האסטרוציטים הוכחו לקדם neurite תוצר במבחנה , התחדשות עצב ויוו כאשר מושתלים/ת עם chondroitinase ABC לפנות את רמות גבוהות של CSPGs הצלקת גליה71 , 72. בקנה אחד עם הופעתו של רפואה אישית, עצמיים astrocytic מיקרו-עמודות יכולים להיות מפותחים על-ידי זריעת תאי גזע, תאי גזע pluripotent מקורות כגון המושרה (iPSCs), תאי גזע עצביים אנושי (hNSCs). שינוי זה יאפשר אלה פיגומים לתפקד כערוצים עבור פרטנית, מסלול ספציפי תיקון והתחדשות. יתר על כן, השימוש מקורות תאים אלה עשויה לעקוף את האפשרי התגובה immunogenic את ההשתלה אסטרוציט עלול לגרום. אף-על-פי immunogenicity שונה על פי שורות תאים iPSC, תאים אלה מסוגלים תיאורטית של הסב או הולכת ופוחתת תגובות חיסוניות על ההשתלה, כפי שהוצע על ידי העדר תגובות מזיקות לאחר נגזר iPSC איברים השרשה של עכברים73,74. יתר על כן, hNSCs עצמיים ונגזרותיהם astrocytic לדכא את תגובות מערכת החיסון allogeneic75. כתוצאה מכך, בדיית אלה המיושר אסטרוציט רשתות עם תאי גזע עצמיים. עשוי להיות עתיד קריטי להתערב ביצוע טכניקה זו ישימה בקלות רבה יותר בקביעת קליני.
מלבד היישום כערוצים עבור CNS תיקון והתחדשות, פיגומים חי astrocytic יכולה לשמש במבחנה מבחן-מיטות, עם או בלי למטרתו של הידרוג בהתבסס על המטרות של תפיסה בדיקה מסוימת. למשל, אלה בונה astrocytic עשוי לשמש כדי לחקור תופעות הנוירוביולוגי כמו הגירה נוירון סיומת neurite מתווכת על-ידי האסטרוציטים, מנצלים את מאפייני לשליטה ואת הסביבה תלת-ממד של פיגומים חיים כמודלים של אין ויוו תנאים. פרוטוקול שנדונו בכתב יד זה מפורט הזיוף של עצמי שהורכב חבילות astrocytic מיושר במטריצה סילוק בתוך הידרוג מיקרו-עמודה. על ידי recapitulating תכונות של המוח נוירואנטומיה, מנגנוני התפתחותית/משובי neuroblast ההעברה משעולים, פיגומים astrocytic מושתלת אלה יש פוטנציאל מציעים מסלולים תומכת בבימויו של העברה עצבית האקסון הדרכה בסביבה אחרת המעכבת של מערכת העצבים פגום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
תמיכה כספית סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [U01-NS094340 (קולן) & F31-NS090746 (Katiyar)], מייקל ג'יי פוקס קרן [טיפולית צינור תוכנית #9998 (קולן)], פן רפואה Neuroscience מרכז טייס פרס (קולן), הקרן הלאומית למדע [מחקר לתואר שני מלגות DGE-1321851 (Struzyna)], המחלקה לענייני חיילים משוחררים [RR & D ההצטיינות לסקור #B1097-אני (קולן)], מחקר רפואי של צבא ארה ב ואת פיקוד [#W81XWH-13-207004 (קולן) & W81XWH-15-1-0466 (קולן)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acupuncture needle (300 µm diameter) | Lhasa Medical | HS.30x40 | The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen. |
| Petri dish | Fisher | 08772B | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14200075 | |
| Polystyrene disposable serological pipet | Fisher | 13-678-11D | |
| Agarose | Sigma | A9539-50G | |
| Microliter glass capillary tube (701 µm) | Fisher | 21-170J | The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell. |
| Microcap bulb dispenser | Fisher | 21-170J | Bulb comes with the microcap tubes. |
| Hot plate | Fisher | SP88857200 | |
| Magnetic bar | Fisher | 1451352 | |
| Micropipette | Sigma | Z683884-1EA | |
| 25 mm gauge needle | Fisher | 14-826-49 | |
| Microscalpel | Roboz Surgical | RS-6270 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Hot bead sterilizer | Sigma | Z378550-1EA | |
| Stereoscope | Nikon | SMZ800N | |
| Micro-spatula | Fisher | S50821 | |
| Rat tail type I collagen | Corning | 354236 | Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use. |
| Microcentrifuge tube | Fisher | 02-681-256 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | SS2661 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher | SA48-1 | |
| Litmus paper | Fisher | 09-876-18 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | 14170112 | Store at 4 ºC. |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I | Sigma | 10104159001 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11330-032 | Store at 4 ºC. |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11195 | Store at -20ºC. |
| Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups | Charles River | Strain 001 | |
| Neurobasal embryonic neuron basal medium | Invitrogen | 21103049 | Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use. |
| B-27 serum free supplement | Invitrogen | 12587010 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use. |
| G5 astrocytic supplement | Invitrogen | 17503012 | |
| Sprague Dawley embryonic day 18 rats | Charles River | Strain 001 | |
| Pasteur pipette | Fisher | 22-042816 | |
| 15 mL centrifuge tube | EMESCO | 1194-352099 | |
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Centrifuge | Fisher | 05-413-115 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-6 | |
| Incubator | Fisher | 13 998 076 | |
| Formaldehyde 40% | Fisher | F77P-4 | Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container. |
| Glass cover slip | Fisher | 12-548-5M | |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 72180 | |
| Fluoromont mounting medium | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal horse serum | Gibco | 16050-122 | |
| Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody | Millipore | AB5804 | Store at -20ºC. |
| Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody | Sigma | T8578 | Store at -20ºC. |
| Rabbit anti-collagen I primary antibody | Abcam | ab34710 | Store at -20ºC. |
| Rabbit anti-vimentin | Millipore | AB3400 | Store at -20ºC. |
| Mouse anti-nestin | Millipore | AB5326 | Store at -20ºC. |
| Donkey anti-mouse 568 secondary antibody | Invitrogen | A10037 | Store at 4ºC. |
| Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody | Invitrogen | A10042 | Store at 4ºC. |
| Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody | Invitrogen | A21206 | Store at 4ºC. |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Invitrogen | H3570 | Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container. |
| Calcein AM | Sigma | C1359 | 4 mM in anhydrous DMSO |
| Ethidium homodimer-1 | Life Technologies | E1169 | 2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v) |
| Dimethyl sulfoxane (DMSO) | Sigma | 276855 | |
| A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs. | |
| Eclipse Ti-S Microscope | Nikon | Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01). |
References
- Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
- Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
- Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
- Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
- Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
- Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
- Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
- Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
- Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
- Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
- Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
- David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
- Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
- Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
- Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
- Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
- Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
- Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
- Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
- Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
- Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
- Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
- Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
- Morrison, B. I. III, Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
- Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
- Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
- LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
- Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
- Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
- Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
- Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
- Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
- Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
- Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
- Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
- Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
- Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
- Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
- Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
- Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
- Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
- Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
- Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
- Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
- Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
- Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
- Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
- Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
- Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
- Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
- Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
- McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
- Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
- Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
- Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
- Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
- Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
- Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
- Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
- Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
- Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
- Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).
