Tredimensionella vävnadstekniska justerad Astrocyten nätverk att Recapitulate utvecklingsmässiga mekanismer och underlätta nervsystemet regenerering

Summary

Vi visa upp utvecklingen av själv monterade, tredimensionell buntar av längdriktningen justerad astrocytic somata och processer inom en roman biomaterial fodral. Dessa konstruerade ”levande ställningar”, uppvisar micron-skala diameter ännu att utvidga centimeter i längd, kan fungera som test-sängar att studera nervsystemets mekanismer eller underlätta neuroregeneration av rikta neuronala migration och/eller axonal pathfinding.

Abstract

Neurotrauma och neurodegenerativa sjukdomen ofta resultera i bestående neurologiska bortfall på grund av den begränsade kapaciteten på det centrala nervsystemet (CNS) att ersätta förlorade nervceller och regenerera axonal vägar. Dock under nervsystemet utveckling, neuronala migration och axonal förlängning ofta uppstå längs vägar som bildas av andra celler, kallad ”levande ställningar”. Detta manuskript strävar efter att efterlikna dessa mekanismer och utforma en strategi som kringgår den hämmande miljön i CNS, och presenterar ett protokoll för att fabricera vävnadstekniska Astrocyten-baserade ”levande ställningar”. För att skapa dessa konstruktioner, anställt vi en roman biomaterial fodral systemet att inducera astrocyterna att själv montera i tät tredimensionella buntar av bipolär longitudinellt-anpassade somata och processer. Första, ihåliga hydrogel mikro-kolumner var samlade, och inre lumen var belagda med kollagen-extracellulärmatrix. Dissocierade cerebral kortikal astrocyter levererades sedan in i lumen för cylindriska mikro-kolumnen och vid en kritisk inre diameter på < 350 µm, spontant själv arrangera i rak linje och kontrakterade att producera långa fiber-liknande kablar bestående av täta buntar Astrocyten processer och kollagen fibriller mäta < 150 µm i diameter men sträcker sig flera centimeter lång. Dessa konstruerade levande ställningar uppvisade > 97% cellviabilitet och var nästan uteslutande består av astrocyter uttrycker en kombination av mellanliggande glödtråden proteiner glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande), vimentin, och nestin. Dessa linje Astrocyten nätverk hittades för att tillhandahålla ett tillåtande substrat för neuronal fastsättning och anpassad neurite förlängning. Dessutom upprätthålla dessa konstruktioner integritet och anpassning när den extraheras från den hydrogel fodral, vilket gör dem lämpliga för CNS implantation. Dessa förformade konstruktioner emulera strukturellt viktiga cytoarchitectural element av naturligt gliaceller-baserade ”living ställningar” in vivo. Som sådan, kan dessa konstruerade levande ställningar fungera som test-sängar att studera nervsystemets mekanismer i vitro eller underlätta neuroregeneration genom att rikta neuronala migration och/eller axonal pathfinding efter CNS degeneration i vivo .

Introduction

Det centrala nervsystemet (CNS) har begränsad förmåga att motverka den förlust eller dysfunktion av nervceller och axonal vägar som åtföljer villkor såsom traumatisk hjärnskada (TBI), stroke, ryggmärgen skadan (SCI) och neurodegenerativa sjukdomen^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenes i CNS är begränsad till ett begränsat antal områden i hjärnan, hämmar återställandet av förlorade nervceller^6,7. Dessutom är regenerering av förlorade axonal vägar i CNS otillräcklig på grund av bristen på riktad vägledning, förekomsten av utväxt hämmare och reaktiva astrogliosis efter skada till nervvävnad^{2,8, 9,10}. Astrocyterna har vanligtvis olika funktioner hjälpa nervceller med ion homeostas, signalsubstansen clearance, synaps bildas och neurovaskulära koppling¹¹. Dock efter även lindriga skador till nervvävnad, kan astrocyter genomgå molekylär, strukturella och funktionella förändringar som de övergången till en hypertrofisk stat¹¹. Svar på svåra neurotrauma resultera ändringarna i bildandet av ett ärr med en penumbra innehållande migrerar reaktiva astrocyter och en lesion kärna som innehåller leukocyter som läckt ut från en brusten blod - hjärnbarriären (BBB), mikroglia, oligodendrocyter och fibroblaster^11,12,13. Dessa reaktiva astrocyter uppnå en morfologi av trådformiga, oorganiserad processer och uppvisar ökat uttryck av mellanliggande glödtråden proteiner och chondroitin sulfate proteoglykaner (CSPGs), som hindrar neurala regenerering¹². Även om gliaceller ärret hjälper först återställa BBB integritet och undvika överföring av den inflammatoriska reaktionen till omkringliggande frisk vävnad, fungerar det som en fysiska och biokemiska barriär mot axon regenerering^{12,14 ,15,16}. Exempelvis axoner som möter gliaceller ärret Visa uppsvällda dystrofa tillväxt kottar och hämmad tillväxt¹². Dessutom hindrar desorganisation av astrocytic processer efter skada utvidgning av regenererande axoner¹⁷. Resultatet av dessa hämmande egenskaper manifesteras i de ofta permanenta fysiska och neurologiska funktionsnedsättningar som patienter lider efter svår neurotrauma, inklusive TBI och SCI.

Oavsett de yttre utmaningarna funktionell förnyelse i CNS, har axoner visat sig ha en inneboende förmåga att regenerera. Exempelvis antyder den dynamiska karaktären av dystrofa tillväxt kottarna i kontakt med gliaceller ärret att dessa ändelser behåller sin kapacitet att utöka¹². Följaktligen, man tror att ett främsta hinder för axonal re-tillväxt är hämmande miljön efter skada CNS och som ger en mer tillåtande miljö via minska gliaceller ärrbildning och/eller tillhandahålla regenerativ broar över ärret skulle vara fördelaktiga. Ja, tidigare studier har visat att CNS nervceller kunde utvidga axoner genom en lesion med perifer nerv ympkvistar som broar, som medför en mer gynnsam miljö för axon regenerering^{12,18, 19}. Flera andra strategier har bedrivits för att utnyttja denna rudimentära förnyelseförmåga. Till exempel har manipulation av cell tillväxt signalvägar i olika skada modeller resulterat i axonal regenerering och gliaceller scar minskning^10,20,21. Studier har dessutom visat att behandling med chondroitinase ABC, som klyver majoriteten av sockerkedjor i CSPGs, minskar den hämmande effekten av CSPGs utsöndras av reaktiva astrocyter²². Trots de uppmuntrande resultat, dessa metoder ger inte riktat vägledningen av tillväxt kottar, vilket potentiellt kan resultera i aberrant regeneration¹², och också inte redovisa förlust av nervceller. Cellbaserade metoder har använts i försök att övervinna effekterna av gliaceller ärret och att återanskaffa förlorade celler, särskilt nervceller. Vissa grupper har dedifferentiated reaktiv astrocyter till nervceller, medan andra har transplanterats neurala stamceller in i CNS-lesioner att återbefolka området skada och främja axon regenerering^{23,24, 25}. stamcellstransplantation ensam är dock begränsad av låga överlevnaden, dålig integrering och blygsamma lagring i skadad vävnad⁵. Dessutom misslyckas dessa cellbaserade strategier att återställa långdistans axonal skrifter, särskilt på ett kontrollerat sätt. Därför biomaterial i kombination med andra metoder utforskas som leveransfordon för olika neurala och stamceller och tillväxt faktorer²⁶. Biomaterial-baserade metoder har en hög grad av kontroll att producera konstruktioner som efterliknar den specifika fysiska, haptotaxic och chemotaxic cues presentera i den tredimensionella (3D) närmiljön för target host vävnad^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduktion av dessa Miljösignaler är avgörande för transplanterade celler presentera native morfologi, spridning, migration och signalering, bland andra neurobiologiska egenskaper²⁹. Trots dessa fördelaktiga egenskaper krävs avancemang bortom traditionella cell seedade biomaterial ställningar att samtidigt främja riktad långdistans axonal regenerering och ersätta förlorade nervceller.

En lovande alternativa tillvägagångssätt bygger på nervvävnad konstruerad ”levande ställningar”, som är åtskilda från andra cell-baserat tillvägagångssätt på grund av levande neurala celler med en förformade cytoarchitecture som emulerar infödda neuroanatomi och/eller utvecklingsmässiga mekanismer för att underlätta riktade utbyte, återuppbyggnad och regenerering av neurala kretsar^4,35. Överväganden för utformningen av levande ställningar inkluderar fenotyper och källor av neurala celler, samt mekanisk/fysiska egenskaperna och de biokemiska signalerna av sammansättningen av någon medföljande biomaterial³⁵. Efter tillverkning i vitro, dessa levande ställningar kan vara implanterad i vivo till nuvarande cell-adhesionsmolekyler och kemotaktisk och neurotrofa signalerar att aktivt reglera neurala cellmigration och axon utväxt beroende på tillståndet och progression av regenerativ processer³⁵. Gliaceller kan fungera som underlag för den bakåtkompilerade cytoarchitecture av levande ställningar eftersom dessa celler medla olika utvecklande mekanismer i vivo. Under hjärnans utveckling åberopa nya nervceller basala processer utvidgad genom radiella glia från ventrikulära zonen mot utveckla kortikala plattan som levande ställningar för riktad migration^36,37. Dessutom sträcker sig tillväxt kottar är visat att orientera sig genom att känna attraktivt och motbjudande signaler som framkallas av gliaceller VÄGSTOLPE celler, och så kallade ”banbrytande” axoner föreslås för att nå de rätta målen genom att utvidga längs pre mönstrade gliaceller ställningar^35,38,39. Gliaceller är således nödvändiga för vägledningen av banbrytande axoner, som senare tjäna som axon-baserade ”levande ställningar” direkt projektionen av ”efterföljare” axoner. Dessutom glia-medierad tillväxt mekanismer har visats kvarstå efter födseln, som neuroblasts följer rostralt flyttande strömmen (RMS) för att navigera från den subventrikulära zonen (SVZ), en av de få återstående områdena av neurogenes i den vuxna hjärnan, att den luktbulben (OB)⁴⁰. Dessa neuroblasts i RMS migrera inom gliaceller röret (figur 1A-1), som består av longitudinellt-anpassade astrocytic processer, via direkt cell-cell sammanväxningar och lokaliserade lösliga faktorer^{37, 41}. Slutligen, medan CNS skada i däggdjur orsakar stört astrocytic processen arrangemang bildar ett gliaceller ärr som fysiskt hindrar axonal regenerering¹⁷, många icke däggdjur system saknar bildandet av ett skadligt gliaceller ärr. Snarare, upprätthålla gliaceller icke däggdjur arter mer organiserad, justerad mönster som används som guider genom den skada regionen^17,42,43. Exempelvis i icke däggdjur SCI modeller visas axoner att växa i nära samarbete med gliaceller broarna över lesionen, vilket tyder på en viktig roll för organiserade gliaceller ställningar som substrat underlätta axonal regenerering och funktionell återhämtning ( Figur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. rekapitulation neuroanatomiska funktioner och de utvecklingsmässiga/regenerativa mekanismer som beskrivs ovan kan ge en ny klass av modifierade gliaceller-baserade levande ställningar som kan samtidigt driva omogna neuronala migration och axonal pathfinding genom annars icke-tillåtande miljöer, därmed potentiellt mildra effekterna av neuronala och axon tarmkanalen degeneration är associerad med CNS skada och sjukdom.

Vår forskargrupp har tidigare designat flera typer av levande ställningar för återuppbyggnad och regenerering av axonal skrifter i CNS och det perifera nervsystemet (PNS) via micro-vävnad konstruerade neurala nätverk (mikro-villkoren) och vävnad bakåtkompilerade nerv transplantat (TENGs), respektive^27,46,47,48. Båda strategierna baseras sig på biomimicry. Micro-villkoren är anatomiskt-inspirerade strukturer för att strukturellt och funktionellt ersätta axonal skrifter ansluta distinkta neuronala populationer av hjärnan. TENGs utnyttja utvecklingsmässiga mekanismen av axon-stödda axonal regenerering, exemplifierat av ”efterföljare” axon tillväxt längs ”pioneer” axoner, att uppnå riktade värd axonal regenerering^35,46,48. Vi nyligen balanserade på mångsidigheten hos levande schavotten tekniken använder ett liknande system för fodral som mikro-villkoren och söker inspiration från de glia-baserade mekanismerna presentera hela utveckling. Här utvecklade vi konstruktioner bestående justerad astrocytic buntar spanning kollagena lumen en hydrogel mikro-kolumn⁴⁹. Dessa astrocytic levande ställningar är utvecklat av första fylla en kapillär tube-akupunktur nål församling med flytande agarosgelelektrofores för att skapa en ihålig cylindrisk hydrogel med ytterdiameter (OD) och innerdiameter (ID) motsvarar diametrarna på de röret och nål, respektive. Efter agaros gelation och utvinning av hydrogel mikro-kolumnen från kapillärröret, ihåliga interiören är belagda med typ I kollagen att tillhandahålla en miljö som är tillåtande för Astrocyten vidhäftning och justerad bunt bildandet (figur 1B -1). Efteråt, lumen är seedade med cerebral kortikal astrocyter isolerade från postnatal råttungar (figur 1B-2). Tvärtemot tvådimensionell (2D) justering tekniker som förlitar sig på tillämpningen av elektriska fält, micropatterned grooves och extracellulär matrix (ECM) protein mönstring, astrocyt justering i levande schavotten bygger teknik på självmontering enligt kontrollerbara variabler såsom substrat krökning (kolumnen ID), cell densiteten och kollagen koncentration^50,51,52. Astrocyterna kontrakt och omskapa kollagen och förvärva en bipolär, longitudinellt-anpassade morfologi som är analoga med de naturliga ställningar som observerats i vivo (figur 1B-3). Faktiskt, vi bedriver aktivt användningen av dessa kabel-liknande strukturer som fysiska substrat för målinriktad vägledning av migrera omogna nervceller samt underlätta axonal regenerering genom den ogynnsamma miljön i skadade CNS, särskilt däggdjur gliaceller ärret (figur 1 c). Denna artikel kommer att presentera metoden detaljerade tillverkning för astrocytic mikro-kolumner, fas kontrast och immunofluorescens bilder av den förväntade cytoarchitecture och en omfattande diskussion om de nuvarande begränsningarna och framtida inriktningar av de teknik.

Figur 1: Inspiration, Fabrication protokoll och föreslagna program för de justerade Astrocytic nätverk. (A) neurobiologiska inspiration: (1) Neuroblasts med ursprung från neurogen subventrikulära zonen (SVZ) utnyttja längdriktningen justerad gliaceller röret i rostralt flyttande strömmen (RMS) för riktad övergång till luktbulben (OB); (2) icke-däggdjur såsom groddjur och fisk kan upprätthålla förnyelse efter nervvävnad skador delvis på grund av bildandet av en gliaceller bro som förbinder ändarna av en lesion (t.ex. transected ryggmärgen) och fungerar som en klätterställning för vägledningen av regenererande axoner. (B) tillverkning översikt: (1) byggandet av en micron stora, ihåliga hydrogel mikro-kolumn med lumen belagd med ECM, (2) sådd av primära kortikala astrocyter isolerade från postnatal råttungar, (3) självmontering av longitudinellt-orienterade buntar i kultur och (4) utvinning av bunten från den biomaterial fodral för framtida implantation studier. (C) In vivo program: (1) dessa levande ställningar kan tjäna som modifierade gliaceller rör för riktad neuron migrering från neurogen centra att återbefolka neuron-brist regioner. (2) rekapitulation av utvecklingstoxicitet mekanismen av banbrytande axon vägledning och regenerativ mekanismen av gliaceller broar i icke-däggdjur kan begåva dessa astrocytic ställningar med kapacitet att direkt axon regenerering över den icke-tillåtande miljön av däggdjur gliaceller ärr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittéer på University of Pennsylvania och Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center och anslutit sig till de riktlinjer som anges i principen NIH Public Health Service på humant Skötsel och användning av försöksdjur (2015).

1. utveckling av agaros Hydrogel Micro-kolumner

1. Göra en agaros 3% vikt/volym (w/v) lösning genom vägning 3 g av agaros och överföra den till en steril bägare innehållande 100 mL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS). Lägga till en steril magnetiska bar i bägaren, och placera den på ytan av en värmeplatta/omrörare. Hålla bägaren täckt för att förhindra avdunstning av dess innehåll i nästa steg.
2. Värm den agaros och DPBS vid en temperatur på 100 ° C och rör vid 60-120 rpm. Justera inställningarna efter behov, och ständigt övervaka utvecklingen av upplösningen processen som lösningen ändras initialt från ogenomskinlig till ett klart utseende som innebär att Agarens är helt upplöst.
   Försiktighet: Heta bägaren och lösningen är heta!
3. Som Agarens lösning är uppvärmd och rörde, Hämta fyra petriskålar av Tom 10 cm och tillsätt 20 mL av DPBS till två av dem. Placera akupunktur nålar (diameter: 300 µm, längd: 40 mm), glas mikroliter kapillärrör (diameter: 701.04 µm, längd: 65 mm, kapacitet: 25,0 µL), och en glödlampa dispenser inuti biosäkerhet skåp. När flytande agaros lösningen rensar ut, upprätthålla konstant värme vid cirka 50 ° C och omrörning för att undvika gelation Agarens.
4. Införa en akupunktur nål i nedre öppningen av en glödlampa dispenser. Infoga ett kapillärrör över nålen exponeras på utsidan. Säkra kapillärröret genom att ange en del av det i avsnittet gummi lampa dispenser cylindern.
5. Överför 1 mL flytande agaros med en mikropipett på ytan av en tom petriskål och placera ena änden av kapillärröret vertikalt (med nålen isatt) i kontakt med agaros, medan gummi locket av glödlampa dispensern är att klämmas inåt. Långsamt släppa trycket på glödlampa dispenser cap Rita agaros i kapillär röret.
   Obs: Överföringen av flytande agaros till kapillär rören måste utföras snabbt. Om flytande Agarens lämnas svalna på petriskål ytan tillräckligt länge (cirka 60 s), det börjar gel, förhindra lämpliga sugning Agarens längs kapillärröret.
6. Plats varje glödlampa-tube-nål sammansättning i en gratis petriskål, och låt agarosen gel inuti kapillärrör stelna för 5 min. Dra försiktigt kapillärröret med händerna ur gummiproppen i glödlampa dispenser cylindern, lämna nålen och den agarosgel på plats inuti röret.
7. Manuellt extrahera akupunktur nålen genom att långsamt dra ut kapillärröret; Nyligen stelnade agaros cylindern glider också ur röret i detta förfarande, fortfarande kring nålen. Försiktigt knuffa mikro-kolumnen längs akupunktur nålen med spetsen av steril pincett att flytta den till slutet. Placera nålen över en öppen, DPBS-innehållande petriskål och skjut den mikro-kolumnen i DPBS med pincett.
   Obs: Om agaros mikro-kolumnen förblir inom kapillär glasröret vid borttagning av akupunktur nålen, Tryck långsamt agaros mikro-kolumnen ur kapillärröret med en 25 mm gauge nål och in i skålen med DPBS.
8. Sterilisera microscalpels eller pincett med en het pärla sterilizer. Gör 4% w/v agaros genom vägning 4 g av agaros och överföra den till 100 mL DPBS. Värm och rör som förklaras i steg 1.2 att erhålla en klar 4% agaros som flytande lösning. Bibehålla värme och omrörning av lösningen under följande steg.
9. Överföra de petriskålar som innehåller mikro-kolumnerna till en dissection-hood och flytta en mikro-kolumn med fin pincett till en tom petriskål. Utnyttja stereoskop för visuell vägledning och en microscalpel att skära mikro-kolumnerna till önskad längd. Trimma båda ändar till form fasade ändar i 45^o vinkel från horisontalplanet att underlätta hantering av mikro-kolumnerna under ECM och cell tillägg.
10. Upprepa föregående steg för tre fler micro-kolumner i samma petriskål och rada upp fyra konstruktioner parallellt med en separation av < 3 mm mellan varje cylindrarna. Ladda 50 µL 4% agaros lösning med en mikropipett och häll en strimma/linje av vätska över matrisen mikro-kolumn att ansluta och bunt konstruktioner i grupper om fyra (härefter kallad ”mikro-kolumn båtar”). Undvika rörelse av 4% agaros till ändarna av mikro-kolumner, som kan täppa inre, genom att minimera avståndet mellan konstruktioner och lägga till Agarens snabbt i en tunn linje.
    Obs: Att arrangera grupper av fyra mikro-kolumner i ”båtar” krävs inte att fabricera de astrocytic ställningar. Dock tjänar båtarna att påskynda tillverkningsprocessen och erbjuda en säkrare sätt att flytta och hantera mikro-kolumner i senare steg.
11. Låt svalna mikro-kolumn båt för 1-2 min att tillåta gelation extra 4% Agarens. Plocka upp båtens mikro-kolumn med fin pincett av den anslutande 4% agarosen, och flytta mikro-kolumnerna till andra DPBS-innehållande petriskål bereddes i steg 1.1.3. Tillverka fler båtar med återstående mikro-kolumner som önskas.
12. Flytta de petriskålar som innehåller den mikro-kolumner eller båtar på en biosäkerhet skåp och sterilisera med exponering för ultraviolett (UV) ljus i 30 min.
    Försiktighet: Använd lämpligt skydd för att förhindra UV-exponering.
13. Lagra rätter med mikro-kolumn båtarna i DPBS vid 4 ° C, om ECM tillägg och cell plätering inte kommer att inträffa omedelbart därefter, fram till 1 vecka. Upprepa steg för mikro-kolumn fabrication om konstruktioner inte används under denna tidsram.

2. primär Cell kultur och isolering

1. Kortikala Astrocyten isolering från råttungar
   1. Förberedelse för följande steg, tillsätt 20 mL av Hanks balanserad saltlösning (HBSS) till fyra petriskålar av 10 cm som fungerar som reservoarer för dissekerade vävnader. Hålla alla rätter på is. Sterilisera ren kirurgisk sax, pincett, mikro-spatel och mikro-skalpeller i en het pärla sterilizer.
   2. Prewarm 0,25% trypsin med 1 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) och 0,15 mg/mL deoxyribonuclease (DNase) I HBSS vid 37 ° C. Dessutom prewarm Astrocyten odlingssubstratet vid 37 ° C, som består av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) med Hams F-12 näringsämne blandning och 10% fetalt bovint serum (FBS).
   3. Söva postnatal dag 0 eller dag 1 Sprague-Dawley råttungar genom att utsätta dem för hypotermiska förhållanden och eutanasi genom halshuggning. PIN huvudet in i en fas med en 19 mm gauge nål placeras i nosen anterior ögonen.
   4. Gör ett snitt med en skalpell i mitten bakre till främre, från basen av halsen upp till strax bakom ögonen. Utföra ett annat snitt gå sidled från direkt bakom ögonen nedåt, bildar en T-form. Använd fina pincett för att dra kraniala hud/skallen av sida.
   5. Håll huvudet nosen (uppåt) genom att placera ett stift av tången i munnen av djuret och den andra på utsidan. Ta bort hjärnan med en steril mikro-spatel och placera den i en av de Petri rätter fyllda med kylda HBSS. Plats denna petriskål på is gånger omedelbart efteråt och alla utom under användning.
   6. Placera ett granitblock som tidigare lagrats på-20 ° C under ett stereoskop inuti en dissektion huva. Placera petriskål med hjärnvävnad på ytan av granit blocket för att bevara dess låg temperatur under förfarandet för dissektion. Använd stereoskop som visuell vägledning under hela följande steg.
   7. Om luktsinnet lökarna förblir intakt, extrahera dem genom att skära med pincett eller microscalpels. Dessutom Använd en microscalpel att ta bort lillhjärnan och göra en mittlinjen snitt separera de två hjärnhalvorna. Överföra hjärnhalvorna med pincett till en petriskål som innehåller färska, kylda HBSS.
   8. Dissekera mellanhjärnan strukturer från insidan av hjärnhalvorna med en microscalpel att få endast de separerade cortices. Använd fina pincett lossnar hjärnhinnorna, en blad-liknande struktur, från kortikal vävnad och överföra de isolerade cortices till en ny petriskål med kall HBSS. Använd microscalpel skräda vävnaden för att öka yta för trypsin åtgärder i nästa steg.
   9. Använda en Pasteur-pipett för att överföra cortices till en 15 mL centrifugrör innehållande 4 mL förvärmd trypsin-EDTA (8 cortices i varje rör). Exponera den kortikala vävnaden som trypsin-EDTA under 5-7 minuter vid 37 ° C.
   10. Med en Pasteur-pipett, försiktigt bort den trypsin-EDTA och tillsätt 400 µl av 0,15 mg/mL DNAS jag lösningen till centrifugröret. Skaka den tube eller vortex tills alla vävnaden är separerade och det finns ingen kvarvarande vävnad stycken i vätskan. Om det inte är möjligt att helt upplösa vävnaden, ta bort återstående fragment med spetsen på en Pasteur-pipett.
   11. Centrifugera röret som innehåller den dissocierade cell lösningen vid 200 x g i 3 min. avlägsna supernatanten med en Pasteur-pipett utan att störa cellerna. Tillsätt 1 mL Astrocyten odlingsmedium (definierade i steg 2.1.2) till röret med en mikropipett och agiterar att resuspendera och skapa en homogen lösning.
   12. Över 10 mL av Astrocyten odlingsmedium med serologiska pipett till en T-75 kolv. Lägga till 250 µl av 1 mL cell lösning (bereddes i steg 2.1.11) med en mikropipett kolven så att plattan en pup hjärnan värt celler per kolv. Fördela den urladdade cell lösningen jämnt över odlingsmediet och skaka försiktigt kolven för att ytterligare främja en jämn fördelning.
   13. Kultur de guldpläterade kolvarna i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO₂. Efter att nå 24 och 72 h i kultur, mekaniskt skaka kolven för att lossa icke-anhängare celltyper, såsom nervceller och oligodendrocyter.
   14. Efteråt, vid varje av dessa tidpunkter, prestera media förändring. Håll kolven vertikalt så kultur media ligger på botten av kolven, inte täcker de klibbade cellerna. Aspirera odlingssubstratet med en Pasteur-pipett, trycka på spetsen på pipetten mot det nedre hörnet av kolven att undvika utvinna cellerna. Placera kolven i den ursprungliga horisontella positionen och varsamt tillsätt 10 mL av Astrocyten medium över cellerna med serologiska pipett.
   15. Återgå kolvar till inkubatorn efter varje media förändring. Efter 90% konfluens uppnås, mekaniskt skaka kolven en gång till för att ta bort alla återstående icke-klibba celler.
   16. Passagen astrocyterna genom att ta ut odlingssubstratet med ett vakuum och en Pasteur-pipett. Tillsätt 5 mL av 0,25% trypsin-EDTA med serologiska pipett över de klibbade cellerna. Skaka försiktigt kolven för att säkerställa trypsin täcker alla celler och inkubera kolven under 5-7 minuter vid 37 ° C och 5% CO₂.
   17. Släcka trypsin genom att tillsätta 1 mL Astrocyten medium till cellerna med serologiska pipett. Extrahera den cell lösningen från kolven med serologiska pipett och överföra den till en steril 15 mL centrifugrör. Centrifugera röret vid 200 x g i 3 min.
   18. Ta bort supernatanten med serologiska pipett och återsuspendera det i 1 mL Astrocyten odlingsmedium. Skaka tuben för att säkerställa cell lösningen är homogen. Räkna antalet celler i lösningen med en hemocytometer eller en automatisk cell räknare.
       Obs: En kolv som är 90% konfluenta vanligtvis ger cirka 3 miljoner astrocyter.
   19. Tillsätt 10 mL av Astrocyten odlingsmedium till en T-75 kolv. Utföra en 1:4 utspädning genom att överföra 250 µl av cell lösning (steg 2.1.18) med en mikropipett till T-75 kolven redan innehåller odlingsmedium. Skaka försiktigt för att säkerställa en homogen cell fördelning över hela ytan av kolven.
   20. Upprepa steg 2.1.16-2.1.19 varje gång 90% konfluens uppnås för att passage cellerna.
2. Kortikala Neuron isolering från råtta foster
   1. Följ liknande preparat som steg 2.1.1 och 2.1.2, med undantaget att förvärmd media är samtidig kulturmassmedia, bestående av Neurobasal medium + 2% B-27 tillägg (för nervceller) + 1% G-5 serumfritt tillägg (för astrocyter) + 0,25% L-glutamin.
   2. Euthanize timed-gravid embryonala dag 18 Sprague-Dawley-råttor med koldioxid kvävning och bekräfta död genom halshuggning.
   3. Extrahera de råtta foster och dissekera cortices från resten av cerebral vävnad i petriskålar som innehåller HBSS på ytan av den kylda granitblock, använder ett stereoskop för visuell vägledning och steriliserad sax, microscalpel och pincett⁵³ . Efter successiva dissektion av cheferna överföra hjärnor, hjärnhalvorna och cortices, varje vävnad till en ny HBSS-fyllda petriskål.
   4. Finhacka den kortikala vävnaden i mindre fragment att öka ytan för trypsin. Överföring 4-6 cortices med en Pasteur Pipettera till en tub med 5 mL av förvärmd trypsin-EDTA och underhålla vid 37 ° C att sära på vävnaden. Vid 5-7 min manuellt skaka röret för att blanda och förhindra klumpar av vävnad.
   5. Ta bort röret från 37 ° C efter 10 min. Som förklarats tidigare i steg 2.1, extrahera den trypsin-EDTA och ersätta med 1,8 mL 0,15 mg/mL DNAS lösning. Efteråt, vortex vävnaden tills lösningen visas homogen, med ingen vävnad fragment flytande i vätskan.
   6. Centrifugera dissocierade vävnad lösningen vid 200 x g i 3 min. Efter bort supernatanten, blandas i 2 mL Co odlingsmedium. Räkna antalet celler i den här lösningen med en hemocytometer eller en automatisk cell räknare.
      Obs: Vanligt avkastningen är 3,0-5,0 x 10⁶ celler/kortikala halvklotet.
   7. Förbered en ny cell lösning med en densitet på 2,0-4,0 x 10⁵ celler/mL i samtidig kulturmassmedia definitionen ovan.

3. utveckling av Astrocytic kablarna inuti Micro-kolumner

1. ECM core fabrication
   Obs: ECM har till vara adderat till inre av hydrogel mikro-kolumnerna på samma dag som cellen sådd kommer att utföras.
   1. Inuti en biosäkerhet skåp, förbereda en 1 mg/mL lösning rat tail typ I-kollagen i samtidig odlingsmedium i ett sterilt mikrocentrifug rör. Upprätthålla mikrocentrifug röret med ECM lösningen på isen hela tiden utom när används.
   2. Över 1-2 µL av ECM lösningen med en mikropipett på en remsa av lackmuspapper att uppskatta dess pH. Tillsätt 1 µL 1 N natriumhydroxid (NaOH) eller saltsyra (HCl) med en mikropipett för att öka eller minska pH av ECM lösningen, respektive, och Pipettera upp och ner för att homogenisera. Kontrollera nya pH med ett lackmuspapper remsa och lägga till mer syra eller bas, som behövs, tills pH är stabil i intervallet 7,2-7,4.
   3. Flytta Petriskålarna från steg 1.2 en dissection-Hood och överföra 4-5 mikro-kolumner eller en båt med steril fin pincett till en tom, steril 35 eller 60 mm petriskål. Använder stereoskop för vägledning, placera 10 µL spetsen av en mikropipett i ena änden av varje mikro-kolumn och en sug att tömma lumen DPBS och luft bubblor. Bekräfta avsaknaden av luftbubblor med den stereoskop att säkerställa att ECM läggas till i nästa steg kan flöda fritt över lumen.
   4. Ladda en P10 mikropipett med ECM-lösning, ställe den 10 µL spets mot ena änden av hydrogel mikro-kolumnerna, och leverera tillräckligt lösning för att fylla lumen (ca 3-5 µL), observerar tillträdeet av ECM med stereoskop. Pipettera en liten behållare (2-4 µL) av ECM-lösning på vardera änden av mikro-kolumnen.
      Obs: Hantera alltid 4-5 mikro-kolumner eller en båt i taget att förhindra långvarig torkning av konstruktioner, eftersom detta kan resultera i att skrynkla mikro-kolumn struktur. Helt torkat mikro-kolumner fast sätt på ytan av Petriskålarna, vilket hindrar deras utnyttjande för cell sådd. Stora mängder av samtidig kulturmassmedia (som en åtgärd för återfuktning) kan inte läggas till mikro-kolumner eftersom detta kan orsaka ECM att flöda ut under inkubationstiden beskrivs nedan.
   5. Pipett samtidig kulturmassmedia i en ring runt petriskål att tillhandahålla en luftfuktighet sjunker till förhindrar uttorkning under inkubation av kolumnerna. Inkubera petriskål innehållande ECM-innehållande mikro-kolumnerna vid 37 ° C och 5% CO₂ för 1 h att främja polymerisering av kollagen innan du lägger de nervceller eller astrocyter.
      Obs: ECM bör bilda ett lager beläggning den inre ytan av ihåliga lumen, snarare än en fast ECM kärna som omfattar interiören, som båda kan observeras med hjälp av stereoskop. Om ECM bildar en kärna, fortsätta inkubationstiden tills bara lagret är kvar. Med detta skikt bildas, kan astrocyt cell lösningen fylla inre av mikro-kolumnen i plätering steg.
   6. Under inkubationstiden, bereda Astrocyten cell lösning (som beskrivs nedan).
2. Astrocyten och Neuron seedning i mikro-kolumner
   1. Passagen guldpläterade astrocyterna (mellan fjärde och tolfte passagen) såsom förklaras i steg 2.1.16-2.1.19. Efter räknar antalet celler i kolven, Bered cell med en täthet av 9.0-12,0 x 10⁵ celler/mL lösning upphängd i cell-kultur media.
   2. Använder ett stereoskop, Placera spetsen på en P10 mikropipett i ena änden av mikro-kolumnerna, och överföra tillräckliga cell lösning (~ 5 µL) till lumen att helt fylla den. Som gjort ovan med ECM, lägga till små reservoarer av cell lösning i båda ändarna av varje mikro-kolumn.
   3. Inkubera guldpläterade mikro-kolumner på Petriskålarna vid 37 ° C och 5% CO₂ för 1 h att främja fastsättandet av astrocyter på ECM. Om nervceller inte kommer att läggas till mikro-kolumner, gå till steg 3.2.5.
   4. Efter inledande inkubationstiden, tillsätt 1-2 µL av den kortikala neuron-lösning som erhålls i steg 2.2.7 i båda ändarna av mikro-kolonnerna med en mikropipett, medan du observerar under stereoskop. Se till att tillräcklig medier är närvarande i disken för att undvika uttorkning och inkubera igen i 40 min vid 37 ° C och 5% CO₂ att möjliggöra adhesionen av nervceller.
      Anmärkning: Kortikala neuron lösning kan också läggas 1-2 dagar efter bunt bildandet, utför steg 3.2.4 efter noggrant bort kultur media från petriskål med en mikropipett.
   5. Efter inkubering period, noggrant fylla i petriskålar innehållande de guldpläterade mikro-kolumnerna med 3 eller 6 mL Co Odlingsmedier för 35 eller 60 mm petriskålar, respektive. Upprätthålla guldpläterade mikro-kolumnerna i kultur vid 37 ° C och 5% CO₂ att främja den självmontering av de justerade astrocytic buntar, som bör bilda en medföljande kabel-liknande struktur efter 6-10 h.
3. Stabilisering av Astrocyten kabel arkitektur
   Obs: Efter bildandet av buntar, cirka 6-12 h i odling konstruktioner, utför följande steg för att förhindra en kollaps av de astrocytic ställningar justerad struktur.
   1. I en steril mikrocentrifug rör, Förbered en 3 mg/mL rat tail kollagen jag lösning i samtidig kulturmassmedia. Justera pH-värdet i lösningen på 7,2-7,4 enligt det förfarande som beskrivs i steg 3.1.2. Upprätthålla kollagen lager och samtidig kultur media på is när inte i använda och placera beredd kollagen lösningen på isen hela tiden.
   2. Ta bort mediet från de petriskålar som innehåller de astrocytic ställningar med en mikropipett, lämnar vissa medier på sidorna av skålen till skapa en luftfuktighet diskbänk som säkerställer hydratisering av mikro-kolumnerna. Placera skålen under ett stereoskop till stöd i visualisering.
   3. Med en mikropipett, ta 2-3 µL av kollagen lösning och ansvarsfrihet till vardera änden av mikro-kolumnerna, använder stereoskop för visuell vägledning. Se till att skålen har tillräckligt många media runt sidorna att agera som en luftfuktighet diskbänk runt kanterna av skålen. Inkubera i petriskålar med mikro-kolumner under 30 minuter vid 37 ° C och 5% CO₂ i en fuktad inkubator att främja gelation av nytillkomna kollagen.
   4. Tillsätt långsamt 3 eller 6 mL Co kulturmassmedia (för 35 eller 60 mm Petri rätter, respektive) till Petri rätter med en pipett, och kultur rätterna i en fuktad inkubator på 37 ^oC och 5% CO₂.

4. utvinning av Astrocytic buntarna från Hydrogel interiör

1. Sterilisera i autoklav coverslips på glas. Bered en 20 µg/mL av poly-L-lysin (PLL) i steril cell kultur grade vatten.
2. Inuti en biosäkerhet skåp, manuellt överföra steriliserade glas coverslips till en steril 10 cm petriskål och lägga tillräcklig PLL lösning för att täcka coverslips.
3. Inkubera i coverslips, täckt med PLL lösningen, under 30 minuter vid 37 ° C att belägga ytan. Ta bort PLL lösningen med en Pasteur-pipett efter 30 min. Skölj tre gånger genom att lägga till cell kultur grade vatten till täckglaset och ta bort det med en Pasteur-pipett.
4. Efter bildandet av den justerade gliaceller bunten, överföra mikro-kolumnen försiktigt till en steril petriskål med steril fin pincett, och lägga till en liten pool av 10 µL av samtidig kulturmassmedia med en mikropipett för att förhindra uttorkning och säkerställa bunt hälsa. Extrahera astrocytic bunten från hydrogel mikro-kolumnen genom att försiktigt dra från ena änden med sterila kirurgiska pincetter, med ett stereoskop för visuell vägledning.
5. Håller astrocytic bunten med pincett, montera den på en PLL-belagd täckglas. Fixa och fläckar med protokollet nedan.

5. immuncytokemi för In Vitro studier

Obs: För denna studie var de primära antikropparna kanin anti-gliaceller sura fibrillary protein (Fredsgenomförande) (1: 500), mus anti-β-tubulin III (1: 500), kanin anti kollagen I (1: 500), musen anti-nestin (1: 200) och kanin anti-vimentin (1: 100). Sekundära antikroppar var åsnan antimus 568, åsna anti-kanin 568, åsna anti-kanin 488 och åsna antimus 568 (1: 500 för alla). Lägga till tillräckligt med volym för varje lösning att helt täcka mikro-kolumnerna i alla fall.

1. Förbereda en 4% volym/volym (v/v) formaldehydlösning i 1 x DPBS inuti en kemisk spiskåpa.
   FÖRSIKTIGHET: formaldehyd är ett giftigt förening kända för att vara cancerframkallande, och måste avfallshanteras i en separat behållare. Alltid manipulera denna förening inuti kemiska spiskåpa och använda personlig skyddsutrustning (PPE) som labbrock, skyddsglasögon och handskar.
2. När det gäller mikro-kolumnerna, kassera kultur media från de petriskålar som innehåller konstruktioner med en Pasteur-pipett utan av misstag sugning hydrogel cylindrarna. Lägg till tillräcklig formaldehydlösning för att täcka mikro-kolumnerna eller de monterade coverslips (vilka båda är kvar på Petriskålarna) och inkubera i 35 min på 18-24 ° C.
3. Extrahera den 4,0% formaldehydlösning från fasta mikro-kolumnerna eller coverslips med serologiska pipett. Skölj fast micro-kolumnerna tre gånger med PBS genom snabbt lägga till och ta bort PBS två gånger och sedan låta dem suga för 10 min en tredje gång.
4. Lös upp normal häst serum (NHS) i PBS för en koncentration av 4% v / v. Förbered en lösning med icke-joniskt rengöringsmedel vid en koncentration på 0,3% v/v med NHS lösningen som lösningsmedel.
5. Ta bort PBS från de petriskålar som innehåller mikro-kolumnerna eller coverslips med en pipett. Lägg till tillräcklig 0,3% rengöringslösning för att täcka de mikro-kolumner/coverslips för 60 min vid 18-24 ° C till permeabilize cellerna.
6. Ta ut rengöringslösning och skölj snabbt två gånger med PBS och tre gånger genom blötläggning i 5 min. beräkna volym krävs 4% NHS och var och en av de primära antikropparna att förbereda en lösning med en önskad antikropp koncentrationen.
7. Ta bort PBS från Petriskålarna och tillsätt tillräckligt primär antikropp (utspädd i 4% NHS-DPBS) lösning att täcka mikro-kolumnerna eller extraherade astrocytic buntarna. Inkubera över natten (12-16 h) vid 4 ° C.
8. Ta ut den primära antikropp lösningen och snabbt skölja två gånger med PBS och tre gånger genom blötläggning i 5 min varje. Bered den sekundära antikroppar, i mörkret, med varje antikropp som är närvarande vid en spädningsgrad av 1: 500 i 4,0% NHS lösning.
9. Inkubera cellerna med sekundär antikropp lösningen för 2 h vid 18-24 ° C. Hela hela tiden inkubation, täcka de petriskålar som innehåller mikro-kolumnerna med aluminiumfolie att undvika exponering för ljus.
10. Ta bort sekundär antikropp lösningen och Lägg Hoechst lösning (1:10 000) under 10 minuter vid 18-24 ° C att färga atomkärnor.
    Varning: Hoechst är en känd mutagen som bör behandlas som ett cancerframkallande ämne. Därför, det måste slängas i en separat behållare och personlig skyddsutrustning ska användas vid alla tillfällen när manipulera denna agent.
11. Skölj med PBS fem gånger, varje gång för 5-10 min. efteråt, lagra färgade mikro-kolumnerna vid 4 ° C i PBS och täck med aluminiumfolie. När det gäller monterade astrocytic buntarna, Lägg en droppe av vattenhaltigt monteringsmedium till bunten, placera en annan täckglas över fast bunten och försegla både coverslips med nagellack för långsiktig lagring och efterföljande imaging.

6. bärkraft Assay med Live-döda (Calcein-AM/etidiumbromid Homodimer) färgningen

1. Förbereda reagenslösningen genom att lägga 5 μl calcein AM (4 mM i vattenfri dimetyl sulfoxid (DMSO)) och 20 μl etidiumbromid homodimer-1 (EthD-1) (2 mM i DMSO/H₂O 1:4 v/v) till 10 mL av 1 x DPBS. Täcka lösningen med aluminiumfolie eller förvaras mörkt att skydda den från ljus.
2. Aspirera media från petriskål som innehåller de guldpläterade mikro-kolumnerna med en Pasteur-pipett och tillsätt tillräckligt lösning (beredd enligt ovan) att täcka konstruktioner. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C och 5% CO₂, att hålla petriskål omfattas för att skydda lösningen från ljuset.
3. Ta bort lösningen med en mikropipett eller Pasteur-pipett. Skölj 2 - 3 gånger med DPBS som förklaras i steg 5.3. Översvämning i petriskålar med DPBS beroende på storleken på skålen. Bildcellerna med omedelbart efteråt epifluorescence eller confocal imaging.
   Obs: Omvandlingen av den membran-permeable calcein AM till calcein av metaboliskt aktiva celler ger den gröna fluorescensen av calcein. Döda celler markeras som membran-äventyras celler, som medger EthD-1 inträde i cellen och dess bindning till nukleinsyror, orsakar röd fluorescens.

Representative Results

Inledningsvis, fas-kontrast mikroskopi användes för att övervaka utvecklingen av Astrocyten vidhäftning och bunt bildandet och den övergripande stabiliteten i cytoarchitecture som en funktion av tiden. På 1 h efter plätering hittades astrocyter i hela lumen micro-kolumner med en sfäriska morfologi (figur 2A). På 5 h, astrocyter började utvidga processer och upphandlande, medan av 8 h celler uppvisade en komplett process-bärande morfologi och bildade kabel-liknande strukturer orienterade längs den längsgående axeln av mikro-kolumnen (figur 2A). Noterbart jämfört med initialt spridda närvaron av celler i mikro-kolumnerna, astrocyterna verkade har uppdraget att bilda ett nätverk av täta buntar längs inre (figur 2B). Efter den inledande celljusteringen, astrocyt nätverken ofta drog ihop längs den längsgående axeln, som påminner om en dragkedja stängning, för att bilda en tät bunt i mitten av mikro-kolumnen (figur 2 c). Bildandet av denna medföljande arkitektur berodde på en självmontering process, delvis dikteras av valet av mikro-kolumn-ID och cell densiteten. Astrocyter linje och förvärvade en bipolär morfologi när seedade i mikro-kolumner med ett ID som är mindre än 350 µm (figur 3B, övre och mellersta, och 3D-3F)⁴⁹. Tvärtom, dessa celler visade slumpmässiga riktverkan när ID 1 mm utnyttjades (figur 3B, botten), som är lik utseendet av 2D Astrocyten kulturer utsatt serum-Free, Co kultur medium (figur 3A, höger). Dessutom även om astrocyter visas fortfarande justering vid låga sådd tätheter (2,0-3,0 x 10⁵ celler/mL eller 2,0-3,0 x 10² celler/mm³) (figur 3 c), täta nätverk bildas endast vid de höga tätheterna (9,0-12,0 x 10⁵ celler/mL eller 9.0-12,0 x 10² celler/mm³) inom cylindriska mikro-kolumner av liknande dimensioner (ses i figur 3B, överst), som föreslås i de protokoll⁴⁹. Livskraft i astrocytic buntarna kvantifierades, med live/dead-analys, som förhållandet av ett område med celler som fluorescerar i grönt (calcein AM) i förhållande till den totala arealen av celler som fluorescerar i grönt (calcein AM) och rött (EthD-1). Lönsamheten för astrocytic buntarna var 97,4%, som är liknande till 98,2% livskraft 2D Astrocyten kultur kontroller (figur 4A-4B) bevisar att miljön inom mikro-kolumnerna är lämplig för Astrocyten vitalitet ( Figur 4E). De 3D rekonstruktionerna av levande och döda celler i de astrocytic ställningar även demonstrera övergripande celljusteringen inom konstruktioner (figur 4 c-4 D). Dessutom utvecklades Ultralång astrocytic mikro-kolumner för att undersöka stabiliteten i Astrocyten buntarna med betydande längd. Även vid extraordinära avstånd 3,5 cm, cytoarchitecture av arrangera i rak linje, tät och kontrakterade astrocytic buntar inröstades konsekvent hela längd av mikro-kolumnen (figur 5A), så tydligt i Regionkommittén zooma in av de Micro-kolumner (figur 5B-5 C).

När bildat, buntarna var fixeras och färgas av immuncytokemi tekniker för mellanliggande glödtråden proteiner karakteristiska av gliaceller, såsom Fredsgenomförande, nestin och vimentin. De confocal bilderna bekräfta processen räntebärande morfologi av astrocyter och längsgående justering av processer (figur 6 och figur 7). Uttryck för de mellanliggande glödtråd proteinerna kan ses i både 2D Astrocyten kulturer (figur 7A) samt Astrocyten buntarna inom mikro-kolumnen (figur 6, figur 7B-7 D). Dessutom bekräftade kollagen färgning förekomsten av detta ECM protein i mikro-kolumnerna. Astrocyterna inte bildar en kontinuerlig struktur med kollagen när odlade i en 2D-miljö (figur 8A), medan astrocyterna verkade följa och omskapa kollagen inom lumen när odlade i mikro-kolumnerna, så att för paket och kontraktion cellbildande (figur 8B). Överlagring av de Fredsgenomförande och kollagen kanalerna visade att Astrocyten kablarna bestod av tätt associerade processer med längsgående kollagenfibrer (figur 8B). Därför, förutom att erbjuda anchorage, kollagen fibriller kan också ha lämnat ytterligare riktad ledtrådar för astrocyterna bildar täta buntar efter sammandragning. I vissa fall kvarstod Astrocyten-kollagen kontraktion, resulterande i en kollaps av den justerade bunten över 12-24 h efter bildandet (figur 9A). För att stabilisera kabel-liknande Astrocyten arkitekturen inom hydrogel mikro-kolumnerna, lades ytterligare kollagenmatrisen till ändarna av en fullt bildade bunt att förhindra ytterligare sammandragning och kollapsa. Detta förstärkning teknik möjliggjorde överlevnad av önskad kabel arkitektur för minst 4 dagar, med ett längre fönster stabilitet väntat (bild 9B). Dessutom var representativa astrocytic buntar utvinns ur hydrogel mikro-kolumnen, monterad, och fast med 4% formaldehyd på glas coverslips att bedöma deras robusthet när utsatt för spänningar styrkor och för den yttre miljön. Även efter extraktion och fysisk manipulation i olika former (figur 10A, 10B), astrocytic somata och processer underhålls ett anpassat, stuvat mikroskala morfologi (figur 10C), belyser den elasticitet i själv arrangera i rak linje astrocytic schavotten, en gång bildats, även om strukturella stöd av hydrogel mikro-kolumnen är frånvarande.

Primära kortikala nervceller odlades också samarbete med astrocyter inuti micro-kolumnerna för att undersöka om Astrocyten buntarna var kapabla att underblåsa neuronala vidhäftning och neurite utväxt. Förpliktelserna och proteinet mikrotubulära β-tubulin III var används som specifika markörer för astrocyter och nervceller, respektive. Figur 11A visar att astrocyterna Co ympats med kortikala nervceller kunde också uppvisar processer och bildar linje buntar. Nervceller föreföll har följt prioriterat Astrocyten buntarna, sedan alla positiva β-tubulin III färgning Co lokaliserade med Fredsgenomförande (överlägg i figur 11B-11 C). För att demonstrera de regenerativa egenskaperna av astrocytic konstruktioner, kortikala nervceller (figur 12B) var klädd inom hydrogel mikro-kolumnen 2 dagar efter astrocyter var klädd (figur 12A). Nervceller fäst i Astrocyten bunten och extended neuriter direkt längs de astrocytic skrifter. Ytterligare inspektion visade neurite utväxt orienterade i riktning mot astrocytic kabeln, medan i regioner där den astrocyt tarmkanalen inte var närvarande, neuriter sågs växer på ett oorganiserat sätt (figur 12 c). Dessa observationer visar att protokollet resulterar i linje, livskraftig och robust astrocytic nätverk som har potential att fungera som implanterbara levande vägar att främja neuron vidhäftning och neurite utväxt.

Figur 2: Brightfield mikroskopi visar bildandet av Astrocyten buntar inom Hydrogel Micro-kolumner med tiden. (A) Astrocyten morfologi som funktion av tiden efter plätering: (1 h) astrocyter är sfärisk form och spridda i hela konstruktionen; (5 h) astrocyter inleda processen förlängning och kontraktion; (8 h) astrocyter har anpassats och kontrakterade. Skala barer = 100 µm. (B) Bundle bildas över tid i en ytterligare representativa byggnadsställning: (1 h) initialt astrocyterna är sfäriska och inte uppvisar processer; (24 h) en tät bunt av astrocytic processer bildas. Skala barer = 300 µm (vänster) och 500 µm (höger). (C) bildade fullt astrocytic bunt 24 h efter plätering, visar en ”zippering” effekt, där ändarna av kabeln fäster olika ändar av väggarna i lumen. Skalstapeln = 1000 µm.

Figur 3: Micro-kolumn innerdiameter och Cell densiteten inflytande den självmontering av justerad buntar av bipolär astrocyter. (A) 2D Astrocyten kulturer med serum-innehållande media (vänster) och serumfritt samtidig kulturmassmedia (höger) Visa en icke-processen och multi process uthärda morfologi, respektive. Skala barer = 100 µm. (B) astrocyter seedade på hög densitet (9,0-12,0 x 10⁵ celler/mL) i micro-kolumner med ID 180 och 350 µm form linje buntar i förhållande till den längsgående axeln, medan ett ID av 1 mm resultat i astrocyterna visar flera, oordnad (unaligned) processer i hela diametern av lumen. Skala barer = 100 µm (toppen, mitten) och 150 µm (nederst). (C) astrocyter seedade i en 350 µm ID mikro-kolumn med låg täthet (2,0-4,0 x 10⁵ celler/mL) är i linje, men inte levereras. Skalstapeln = 100 µm. (D) när klädd i en 350 µm ID mikro-kolonnen med lågt eller medelhögt cell densiteten, astrocyter förvärva en bipolär morfologi. Skala barer = 300 µm. (E) Box i D visar en inzoomning av kedjar av bipolär astrocyter som bildar inuti hydrogel mikro-kolumnerna. Skalstapeln = 300 µm. (F) exempel på en individuell bipolär Astrocyten. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4: astrocyterna förbli lönsamt efter Bundle bildats inom Hydrogel Micro-kolumnen. (A-B), (C-D) 3D confocal rekonstruktioner visar livskraften hos celler i hela planar kulturer och justerad astrocytic buntar, respektive, som analyseras med calcein-AM/etidiumbromid homodimer färgning (grön-live celler; röd-döda celler). (E) kvantifiering av levande och döda celler resulterade i en liknande andel av live/dead astrocyter när odlade på 2D ytor och i mikro-kolumnerna. Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: faskontrast bilden av en representativ Ultralång justerad Astrocytic bunt inom Hydrogel Micro-kolumnen. (A) bunt bildandet i hela hela längden av en 3,5 cm mikro-kolumn. Skalstapeln = 1000 µm. (B-C) högre förstoring zoom-ins visar Astrocyten anpassningen i olika regioner längs helheten av den konstruktionen, motsvarande rutorna i A. Skala barer = 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 6: Immunolabeling av de Astrocytic ställningar visar Longitudinal justeringen av Astrocytic processer. (A) Confocal rekonstruktion av en astrocytic bunt visar färgning för Fredsgenomförande (röd, vänster) och atomkärnor (Hoechst; mitten) och en överlagring av båda kanalerna (höger). (B) högre förstoring zooma in av astrocytic bunt i boxed regionen i A möjliggör visualisering av cytoarchitecture av astrocyterna inom mikro-kolumner. Skala barer = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 7: karakterisering av representativa Astrocytic buntar genom immuncytokemi. (A-B) Astrocyter odlade på 2D ytor och seedad i hydrogel mikro-kolumner uttrycka liknande astrocytic markörer Fredsgenomförande (röd) och vimentin (grön). (A) Confocal rekonstruktion av en 2D planar Astrocyten kultur visar separat och sammanslagna kanaler. Skalstapeln = 100 µm. (B) Confocal bilder av en astrocytic bunt, bekräftar uttryck av markörer och skylta Astrocyten justering. Skalstapeln = 50 µm. (C-D) astrocyter odlade inom mikro-kolumner också uttrycka den mellanliggande glödtråden proteiner nestin (röd) och vimentin (grön). (C) Confocal bilden av en astrocytic bunt. Skalstapeln = 100 µm. (D) högre förstoring zooma in c. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 8: astrocyter i justerad buntarna samverkar intimt med en kontrakterade, längsgående kollagenmatrisen, i motsats till det oregelbundna arrangemanget av kollagen i 2D kulturer. Cellerna var immunolabeled att observera astrocyter (Fredsgenomförande; röd), kärnor (Hoechst; blå) och kollagen (grön). (A) 2D Astrocyten kulturer med kollagen 1 mg/ml Visa rundbordsvridning astrocyter och slumpmässigt distribuerade kollagen. Skalstapeln = 250 µm. (B) kollagen är drog ut från väggarna av mikro-kolumn lumen och är kontrakterade att bilda en linje matris som är en del av astrocytic bunt. Skalstapeln = 150 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 9: ytterligare kollagen kan användas för att stabilisera strukturen av Astrocytic kablarna. (A) buntar bildade ungefär 6 h efter plätering astrocyterna inom kollagen-belagd hydrogel mikro-kolumner. När buntar bildades, har högre koncentration (3 mg/mL) kollagen lagts till i ändarna av mikro-kolumnen till hämmar kontraktion astrocytic kablar. I konstruktioner inte stabiliserad med ytterligare kollagen, astrocytic-kollagen buntarna hade börjat minska med 18 h och Astrocyten kablarna hade helt kollapsat av 24 h. Denna sammandragning observerades inte när buntarna var förstärkt med 3 mg/mL kollagen. Skalstapeln = 1.000 μm. (B) zooma in av kollapsade astrocytic bunt inte förstärkt med 3 mg/mL kollagen. Skalstapeln = 500 μm. (C) zooma in regioner från kollagen-förstärkt mikro-kolumner. Astrocyten bunt morfologi bibehölls under hela helheten av mikro-kolumnen. Skala barer = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 10: utvinning av Astrocytic buntarna från mikro-kolumn och montering på Poly-L-lysin belagt glas Coverslips utvisar robustheten i tekniken. (A) faskontrast bild av flera utvinns astrocytic buntar, manipuleras in i stavning ordet ”Penn”. (B) Confocal återuppbyggnad av samma extraherade buntar målat för astrocytic markör Fredsgenomförande (röd) och cellkärnor (Hoechst; blå). Skalstapeln = 100 µm. (C) förstoring av boxed regionen i B visar att även när manipulerade in i oregelbundna former, de astrocytic ställningar behålla en justerad, bipolär morfologi och en medföljande cytoarchitecture. Skalstapeln = 200 µm. Notera att eventuella strukturella skillnader mellan fas och confocal bilder är sannolikt en artefakt av konstruktioner skiftande på grund av sköljning under förfarandet immuncytokemi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 11: nervceller följer och förlänga neuriter längs linje Astrocyten buntarna i Neuron-Astrocyten Co odlade ställningar. (A) faskontrast bilden av en neuron-seedade astrocytic bunt. Skalstapeln = 300 µm. (B)-(C) nervceller observerades att följa astrocytic buntarna och utvidga neuriter längs riktning av kabeln (Hoechst-blå; Fredsgenomförande-grön; Β-tubulin III-röd). Skala barer = 200 och 100 µm, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 12: Astrocyten kablar fungerar som en lever byggnadsställning för regisserad Neurite utväxt. Confocal rekonstruktioner visar en region i en mikro-kolumn som består av nervceller seedade cirka 2 dagar efter bunt bildandet. (A) Fredsgenomförande-positiv Astrocyten buntar, (B) β-tubulin III-positiv nervceller och (C) sammanfogning av alla kanaler, inklusive HOECHST-färgade kärnor (blå). Observera att nervceller uppvisade neurite justering när anslutit sig till regioner med justerad Astrocyten processer (pilar), medan nervceller inte följs till justerad astrocyterna verkade uppvisar slumpmässiga (dvs mångfasetterat) neurite utväxt (pilspetsar). (D) zooma in i regionen visar riktningen på neurite utväxt. Skala barer = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Jämfört med mer stödjande miljö av PNS, är CNS särskilt begränsade i hantering av de skadliga följderna av neurotrauma och neurodegeneration. Efter en allvarlig förolämpning mot däggdjur CNS bildas ett gliaceller ärr, bestående av en kärna av fibrotiska och inflammatoriska celler omges av en tät meshwork av oorganiserad reaktiva astrocyter som utsöndrar axon utväxt-hämmande proteoglykaner¹⁴. Detta ärr fungerar som en fysiska och biokemiska obstruktion mot förnyelse av axon ändelser¹². Dessutom äger vuxna däggdjur CNS begränsad källor av nya nervceller att återställa förlorade celler efter trauma eller neurodegeneration, eftersom neurogen centra är begränsade till SVZ, Hippocampus dentate gyrus och eventuellt andra vanligtvis inaktiv områden⁵⁴. En perfekt strategi skulle kringgå både aspekter av begränsad rekuperativ funktionerna i CNS, som nuvarande tillvägagångssätten inte adress. Som sådan, har vår forskargrupp utvecklat Astrocyten-baserade ställningar som syftar till att presentera levande vägar för neurala övergång till neuron-brist områden och guidade förlängning av regenererande axon tillväxt kottar. Justerad astrocytic buntar som ingår i kollagen interiören i en agaros mikro-kolumn utgör dessa astrocytic levande ställningar. En avsevärd skillnad från konventionella cell - och biomaterial-baserade strategier som används för CNS reparation och förnyelse är att cytoarchitecture av dessa konstruktioner är helt förformade in vitro för att simulera flera i vivo glia-baserade vägledning och byggnadsställningar arkitekturer. Exempelvis under fosterutvecklingen fungera radiella glia spridningsvägar som levande ställningar för nya nervceller migrerar till hjärnbarken och gliaceller medla riktade förlängning av banbrytande axoner som poserar som mönstrade substrat eller VÄGSTOLPE celler^{35 ,38,39}. Embryonala radiella glia i den subventrikulära zonen också producera astrocyter som bildar längdriktningen justerad gliaceller rör, som neuroblasts migrera postnatalt i en kedjad-formation från SVZ att de OB-⁴¹. Dessutom har det visats i vissa icke-däggdjur som, efter CNS skada, en högre grad av regenerering är möjligt på grund av bildandet av en organiserad, anpassat astrocytic arrangemang⁴⁴. Till exempel vuxna zebrafiskar klarar av regenererande deras ryggmärg efter migreringen av omogna gliaceller till lesion webbplatsen, differentiering in en bipolär morfologi och töjning av gliaceller processer att överbrygga lesionen bildar en sökväg som dirigerar regenererande axoner⁴⁵. Bakåtkompilerade konstruktioner av justerad astrocytic buntar kan kunna går igenom dessa mekanismer och presentera krävs strukturella och lösliga signalerna för glia-medierad neuronala migration och axon regenerering³⁵. Dessutom, på grund av införandet av levande astrocyter, kan dessa konstruktioner aktivt presentera krävs miljömässiga ledtrådar utifrån feedback från värden.

I vår teknik, astrocyt anpassningen är en självmontering bearbeta betingade på fysiska ledtrådar och cell-cell interaktioner främjas av mikro-kolumn innerdiameter, kollagen koncentration och sådd densitet. En annan intressant del av denna metod är dess micron-skala storlek, vilket kan tillåta för minimalinvasiv implantation i skadade områden i CNS. Dessutom Visa resultat som presenteras i detta manuskript att konstruktioner erhålls med protokoll besitter hög lönsamhet och uttrycka den mellanliggande glödtråden proteiner Fredsgenomförande, nestin och vimentin, oavsett Astrocyten ålder som definieras av passagen nummer . Medan både Fredsgenomförande och vimentin uttrycks i omogna och mogna astrocyter, är nestin huvudsakligen begränsad till odifferentierade eller omogna celler, med förfall glia upregulating uttrycket av förpliktelserna och minskande produktion av nestin^{45, 55}. tidigare studier har visat att Astrocyten funktionsförändringar med åldern, men konsekvent uttryck för mellanliggande glödtråden proteiner, samt buntning sågs i en rad passage nummer (4-12 passager)⁵⁶. De astrocytic ställningar också visades att uppnå extremt lång, centimeter-skala längder i vitro, vilket tyder på att denna teknik är anpassningsbar till olika skada längderna och geometrier stött i vivo. Dessutom uppvisar justerad astrocytic buntarna anmärkningsvärt strukturell integritet och stabilitet, eftersom deras kabel-liknande cytoarchitecture bibehålls även efter att utsättas för utvinning från mikro-kolumnerna. Astrocyten-baserade levande ställningar också stöd neuron vidhäftning och neurite utväxt, förstärka denna teknik har potential att främja riktad neuron migration och axon förlängning för CNS reparation.

De justerade astrocytic buntarna finns inom kollagena interiören i en skyddande tubulär hydrogel-fodral. Tillverkning av de astrocytic ställningar inleds med mikro-kolumn församling genom att infoga en akupunktur nål i ett kapillärrör och sugning flytande agaros in i den. Agaros var den valda biomaterial på grund av dess inerta egenskaper, biokompatibilitet och lättkontrollerad mekaniska, fysiska och biokemiska egenskaper⁴⁹. Agaros koncentration i hydrogel kan vara en viktig variabel eftersom celler känsla mekaniska stimuli från deras substrat (t.ex. stelhet) och svara med intracellulära ändringar⁵⁷. Design kriterier för dessa mikro-kolumner innehåller en tillräckligt hög porositet att möjliggöra adekvat masstransporter, men en liten tillräckligt porstorlek att förbjuda laterala processen utväxt; dessa kriterier är uppfyllda av nano-skala öppen-porositeten i agaros på den koncentration som används i detta protokoll. Koncentrationen av agaros i detta protokoll valdes också på grund av dess stabilitet, enkel hantering, och likheten i mekaniska egenskaper till de hjärna miljö⁵⁸. Ett anmärkningsvärt övervägande är centrala placeringen av nålen inom kapillärröret. Ofta, kan nålen vara något sneda eller fördrivna under processen orsakar lumen vara ligger off-center i förhållande till ytterväggarna följande agaros gelation och mikro-kolumn avlägsnande från röret. Undvik detta genom nålen ska vara rak, och kolven-tube-nål församlingen bör bibehållas i vertikal position medan agaros är dras att behålla nålen längs den centrala axeln. Exakt centralisering av lumen skyddar justerad astrocyterna mellan agarosgelelektrofores väggarna; lumen är mer benägna att spricker om belägen proximalt till den yttre kanten av cylindern. Dessutom kan tillräckligt avstånd mellan lumen och ytterväggen erbjuda skyddande fördelar under och efter transplantation (förutsatt astrocytic konstruktioner inte tas bort från mikro-kolumnen föregående implantatet). Detta inledande skede av astrocytic byggnadsställning fabrication är avgörande för framgången av tekniken, eftersom valet av nålen diameter är avgörande för korrekt Astrocyten soma/process justering och kabel självmontering. Vi hittade att Astrocyten justering var omvänt beroende av mikro-kolumnen ID, med en optimal ID-intervallet för celljustering och bildandet av robust Astrocyten buntar som 180 till 350 µm (figur 3). Likaså visades det tidigare att nervceller direkt sin utväxt längs riktningen av minsta substrat krökning minska processen bockning^59,60och liknande mekanismer sannolikt på arbetet att påverka Astrocyten justering i våra system⁴⁹. Utöver krökning som påverkar Astrocyten justering, fann vi att en 180 till 350 µm ID utbud resulterade i astrocyterna förvärva en bipolär morfologi⁴⁹, tvärtemot den stjärnformade, multipolära form observerats med ID 1 mm eller när astrocyter odlades i 2D (figur 3). Det är troligt att dessa djupgående morfologiska förändringar till en bipolär Astrocyten morfologi ändra deras fysiologiska egenskaper samt; exempelvis dessa astrocyter kan uttrycka alternativa secretable faktorer eller cell yta markörer som kan vara fördelaktigt för förnyelse, men detta motiverar ytterligare karakterisering. Våra resultat visar sammantaget att lämpliga val av fysiska ledtrådar, såsom yta krökning, är absolut nödvändigt att efterlikna infödda cytoarchitecture i astrocytic levande ställningar.

Byggandet av de astrocytic ställningar fortsätter med sekventiell införandet av kollagen ECM-lösning och kortikala astrocyter in i ihåliga inre av mikro-kolumnerna. Inre lumen av mikro-kolumnen är belagd med kollagen att stödja Astrocyten överlevnad, fastsättning och justerad bunt bildandet, på grund av agaros oförmåga att självständigt stödja neurite utväxt⁶¹. En kollagen koncentration av 1 mg/mL valdes eftersom tidigare studier visat att lägre och högre koncentrationer resulterade i en bristande friktion och instabilitet i ECM, respektive⁴⁹. Således, som förväntat, kollagen koncentration har dramatiska effekter på effektiviteten av denna teknik. Dessutom består en ECM-lösning av endast typ I kollagen. Jämfört med laminin och Matrigel-coated underlag för 2D astrocytic kulturer, klädd astrocyter på typ I kollagen visat optimal vidhäftning och nätverk bildas⁶². Inkubationstiden för kollagen polymerisation före cellen sådd är också ett viktigt steg i protokollet. Vi hittade tidigare att när nervceller levererades concomitantly med opolymeriserade ECM agaros mikro-kolumnerna, minskad neurite utväxt och axonal fasciculation var sett⁴⁷, och det är möjligt att dessa fynd skulle utsträckas till att astrocyterna liksom. Eftersom kollagen krävs för Astrocyten vidhäftning och bunt bildandet, bör förekomsten av ECM i hela konstruktionen och avsaknad av luftbubblor eller tomma fickor visualiseras och bekräftade med mikroskopiska tekniker.

Protokollet avslutas med Astrocyten plätering, en inkubationsperiod att säkerställa celladhesion till kollagen och kortfristiga kultur för bildandet av de mål cytoarchitecture. Astrocyter mellan passage nummer 4-12 användes, som de utställda robust astrocytic buntning och kollagen reformationen. Dessa astrocyter presenterade också en mogen fenotyp bestående av > 95% rena kulturer^63,64 med liten eller ingen neuronala förorening. I motsats till vanliga Astrocyten kulturer, som sysselsätter serum-innehållande medium (figur 3A, till vänster), vår teknik använder tredjeparts serumfritt medium så att astrocyterna att anta en process-bärande morfologi (figur 3A, höger ) och bildar knippen av justerad somata och processer inom den mikro-kolumner^62,65,66. När det gäller cell sådd koncentration, resulterade högre koncentrationer i intervallet 9.0-12,0 x 10⁵ celler/mL, med ID 350 µm, i bildandet av tätt packade buntar med tillhörande kollagen remodeling, medan astrocyter skingrades mer , men fortfarande linje, när lägre koncentrationer utnyttjades (figur 3 c). Effekten av sådd koncentration på cell-cell interaktioner påverkar således graden av Astrocyten justering och bildandet av de observerade kabel-liknande strukturerna. En injektion av cell lösning i lumen är generellt visualiseras med ett stereoskop för att säkerställa homogen leverans över mikro-kolumnen längd, vilket är avgörande för kontinuerlig bunt bildandet. Efter sådd, är preliminära inkubationstiden före översvämningar med kultur media nödvändigt att säkra ankringen av astrocyter till ECM. Varaktigheten kan ändras om astrocyter fly från konstruktioner, förutsatt att konstruktioner är tillräckligt tilluften för att hindra uttorkning. Faskontrast bilder av de astrocytic ställningar som funktion av tiden visade att ett nätverk av justerad astrocytic buntar av 8 h, var håller på att bildas. Dessutom observerades avskildheten av ECM från lumen väggen, dess påföljande sammandragning och snäva associationen mellan celler och kontrakterade kollagen när konstruktioner var märkt för kollagen och förpliktelserna som visas i figur 8. Detta fenomen är möjligen en följd av astrocytic kontraktila krafter ta loss kollagen från väggar, baserat på tidigare rapporter om fibroblast-liknande kapacitet av gliaceller att generera krafter som snedvrider flexibla substrat och matrix-ombyggnaden förmågan hos astrocyterna i Astrocyten-bara och neuron-Astrocyten kulturer tillsammans^28,49,67,68. Specifikt, är en av konsekvenserna av Astrocyten motilitet och integrin-medierad samspelet med kollagen fibriller generation av krafterna tillräckligt att kontraktera den fibriller^17,69. Sammantaget kommer genomförandet av protokollet beskrivs producerar levande ställningar består av själv monterade nät av tät, anpassat astrocytic kabel-liknande strukturer som recapitulate fysiska substrat närvarande vid flera utvecklingsstadier CNS.

Förutom enskilda frågor som kan uppstå i hela protokollet äger astrocytic byggnadsställning tekniken andra hinder som kan påverka dess förmåga att reparera CNS. Den slutliga framgången för denna teknik är exempelvis beroende av nervsystemet plasticitet och funktionell integrering av astrocytic schavotten med värd kretsarna. Samband med implantation av dessa ställningar är möjligheten till en inflammatorisk reaktion som kan motverka astrocytic buntarna pro-regenerativ attribut. Alla transplantation-baserade tekniker har kapacitet att brista på blod - hjärnbarriären och orsaka infiltration av inflammatoriska celler, på grund av närheten mellan nervceller och kapillärer i vävnad⁴⁷. I det här fallet kan hydrogel mikro-kolumnen eller ett annat fodral system för de astrocytic ställningar utnyttjas som ett medel för den kontrollerad frisättningen av antiinflammatoriska faktorer att minska den inflammatoriska reaktionen. Inledningsvis den arrangera i rak linje astrocytic bunten var inte stabil inuti micro-kolumnen, som de krafter som tvingar celljustering och matrix remodeling ledde slutligen till en kollaps av den önskade cytoarchitecture efter 1-2 dagar i kultur. Dock försvårades ytterligare kontraktion och bunt kollaps genom att tillhandahålla ytterligare förstärkning för buntarna i ändarna av mikro-kolumnen genom att lägga till högre koncentration kollagen för att hålla paketet på plats. En ytterligare taktik kan vara att anställa en sekundär inkapsling, whereby en ny hydrogel-beläggning tillämpas på justerad astrocytic buntarna som de dras från mikro-kolumnerna. Det är troligt att distribution av de justerade astrocyt nätverk i hjärnan också skulle stabilisera konstruktioner på grund av cell-cell sammanväxningar mellan värd och konstruera celler längs hela, även om detta kommer att behöva testas direkt i framtida studier.

Följaktligen framtida insatser kommer att riktas på att utveckla en effektiv transplantation metod som garanterar stabilisering och skydd av astrocytic bunt under och efter in-vivo leverans för att möjliggöra neuronala migration, reparera, och förnyelse i skadade CNS. Vi har tidigare visat lyckad implantation av neuronala/axonal-baserade micro-villkoren, som delar fodral systematik astrocytic konstruktioner, i corticothalamic vägar, vilket resulterar i överlevnad och strukturell integrering med värden vävnaden vid åtminstone tills 1 månad^46,47. Robustheten av kablarna efter extraktion från mikro-kolumnerna kan således utnyttjas. I det här fallet agaros hydrogel skulle tjäna som inledande kultur sängen att inducera självmontering och sedan astrocytic kabeln skulle tas bort från fodral och direkt injiceras in i hjärnan med hjälp av en tunna nål. Astrocyten deformation på grund av mekaniska krafter under utvinning från hydrogel mikro-kolumnen har inte observerats, och förväntas inte. Tidigare arbete studera effekter av mekanisk deformation på Astrocyten reaktivitet föreslår att alla resulterande deformation inte skulle tillämpas tillräckligt snabbt för att inducera astrocytosis eller process töjning^62,70. För att minimera skador på hjärnvävnad och den eventuella inflammatoriska reaktionen, kan buntarna inom hydrogel implanteras med hjälp av nål-mindre teknik utvecklats tidigare för mikro-villkoren. I denna metod, är hydrogel belagd med ett tunt lager av karboximetylcellulosa som möjliggör nål-mindre inträde i hjärnan som kan minska störande och inflammatoriska fotavtryck av implantation⁴⁷. Efteråt, transplantation studier kan utföras för att bedöma förmågan hos dessa ställningar att överleva, integrera med värd vävnaden, och främja neurala migration och axon vägledning. Särskilt, kan dessa konstruktioner implanteras med ena änden som härrör från en neurogen region som SVZ att komma åt dess pool av neurala stamceller och neuroblasts, i direkta härmning av RMS och den andra änden är ansluten till en skadan webbplats att potentiellt köra neurala migration och återbefolka området i en uppmätt mode.

Efter transplantation protokoll optimering, kan tekniken förbättras i andra områden. Micro-kolumnerna kan fabriceras specifikt med omogna astrocyter (e.g. radiella glia, RMS-typ celler) eller mogna fenotyper som är senare dedifferentiated för att öka dessa konstruktioner⁴⁹regenerativ-inducerande kapacitet. I in vitro- modeller av gliaceller ärr, har mogen astrocyter inte hade förmågan att bilda vägar för axon utväxt⁷¹. Däremot har omogna astrocyter visat sig främja neurite utväxt i vitro och axonal förnyelse i vivo när transplanterade samtidigt med chondroitinase ABC för att ta itu med de höga nivåerna av CSPGs i den gliaceller ärr^{71 , 72}. i samband med tillkomsten av personlig medicin, autolog astrocytic mikro-kolumner kan utvecklas genom sådd stamceller från källor såsom inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och mänskliga neurala stamceller (hNSCs). Denna ändring kommer att tillåta dessa ställningar fungerar som transitländer för individualiserad och specifika väg reparation och förnyelse. Dessutom användningen av dessa cell källor kan kringgå möjliga immunogent svar att Astrocyten implantation kan orsaka. Även om immunogenicitet skiljer sig enligt iPSC cellinjer, är dessa celler teoretiskt kunna avvärja eller minskande immunsvar vid transplantation, som föreslagits av frånvaron av skadliga Svaren efter iPSC-derived orgel implantation i möss^73,74. Dessutom förtränga autologa hNSCs och derivat astrocytic allogen immunsvar⁷⁵. Följaktligen, tillverka dessa linje Astrocyten nätverk med autologa stamceller kan vara en kritisk framtid steg i att göra denna teknik mer lättillämpliga kliniskt.

Förutom ansökan som transitländer för CNS reparation och förnyelse, kan astrocytic levande ställningar användas som in vitro- test-sängar, med eller utan den hydrogel fodral baserat på mål för en viss testning paradigm. Exempelvis kan dessa astrocytic konstruktioner användas för att undersöka neurobiologiska fenomen såsom neuron migration och neurite förlängning medieras av astrocyter, utnyttja egenskaperna kontrollerbar och 3D miljö av levande ställningar som modeller för i vivo villkor. Det protokoll som diskuteras i detta manuskript detaljerade tillverkning av själv monterade justerad astrocytic buntar i en kollagen matris inom en hydrogel mikro-kolumn. Går igenom funktioner i hjärnan neuroanatomi, utvecklingsmässiga/regenerativa mekanismer och neuroblast migration vägar, har dessa implanterbara astrocytic ställningar potential att erbjuda stödjande vägar för riktad neurala migration och axon vägledning i annars hämmande miljön av skadade CNS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30x40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon		Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon		Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).