Summary
정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
초파리 melanogaster 의 날개 개발 조직 수준에서 morphogenesis 공부에 대 한 이상적인 모델입니다. 이러한 부속 라는 날개 imaginal 디스크 배아 발달 동안에 형성 하는 세포의 그룹에서 개발. 애벌레 단계에서 imaginal 디스크 성장, 세포의 수를 증가 하 고 monolayered 상피 구조를 형성. 번데기의 경우, 내부 imaginal 디스크 밖으로 새싹 되는 날개의 앞 여백 선 따라 bilayers에 접어. 이 과정 동안, 경도 primodia 정 맥 정 맥 셀 날개의 장래 등 쪽과 복 부 표면에 시작 됩니다. 번데기 단계에서 각 표면의 정 맥 세포의 줄무늬 꽉 튜브;를 생성 하기 위해 의사 소통 동시에 간 정 맥 그들의 형성을 시작합니다.
적절 한 분자 마커의 도움으로 개발 하는 동안 날개를 구성 하는 주요 요소를 식별 가능 하다. 이러한 이유로 정확 하 게이 구조에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍요로 움과 날개의 개발 프로세스에 관련 된 지역화를 공부 하 고 중요 합니다.
절차는 여기 조작 번데기 날개, 날개를 해 부하는 번데기 단계에서 하는 방법에 자세한 지침을 제공에 초점을 맞추고 설명 합니다. 번데기 조직의 해 부 3 탈피 애벌레에 있는 그들의 대조 물 보다 수행 하기 위해 더 어렵습니다. 이 때문에이 이렇게 신속 하 고 효율적인 고품질 샘플을 얻기 위해, 개발 되었다. Immunostain 및 마운트 하는 방법의 세부 사항은 단백질 또는 세포 구성 요소, 시각화 수 있도록 이러한 날개 샘플 프로토콜에서 제공 됩니다. 작은 전문 그것 시간의 짧은 금액에 8-10 고품질 번데기 날개를 수집 가능 하다.
Introduction
초파리 날개 날개 imaginal 디스크에서 개발 된다. 이러한 날개 디스크의 원시 배아 상피에서 invaginate는 20-30 imaginal 셀의 작은 그룹으로 배아 개발 하는 동안 옆으로 배치 됩니다. 유 충 탈피 세 번째 단계로 성장 하는 동안 유사 분열에서에서 발생 합니다 imaginal 셀에 특정 특성의 숫자 (약 50000 셀)을 제기 하 고 날개를 형성 디스크1,2,3, 4. 셀 확산, 그들은 패션 관 상피, 자동 접이식 소형 나선 결과. Pupation, 동안 디스크 상피 형태 2 층 날개 밖으로 망원경 그리고 경도 정 맥 시작 그들 사이 격차는 날개 발달5,6동안 두 번 발생 합니다.
항상 혈관의 배치는 동일한 패턴; 쉽게 모든 변경 내에서 혈관 형성을 식별 하는 기능 돌연변이 매우 표시 (예: 누락 되거나 추가 정 맥, 정 맥의 위치, 등등에서 변화.) 합니다. 흥미롭게도, 표현 형 변이 일반적으로 신호 경로 날개 개발와 관련 된 알려진 또는 소설 구성에 돌연변이의 증거. 경로 위치를 결정 하 고 정 맥 및 intervein 영토를 유지 하는 역할을 수행 중 이다 Hedgehog (Hh) 통로6,,78.
모델 시스템으로 번데기 날개의 중요성을 감안할 때, 그것은 함께 작동 하도록 좋은 품질 샘플을 얻기 위해 중요 한 됩니다. 과거에는, 날개 초파리 해 부 프로토콜 게시 과학자 하지 실행할 수 있는 샘플을 달성 하기 위해 적절 한 가이드를 주었을 합니다. 연구원의 지도 없이 하나 명확 하 게 과정을 시각화 수 없습니다. 이러한 대체 해 접근 번데기 2, 조직 주위에서 날개 분리 분할 이며 반복적으로 파편을 제거 하기 위하여 세척. 이런이 종류의 자유로운 날개를 두고 접근 주장의 오염 하지만 이전 경험 때문에 프로세스는 느린 고 연약한 날개9의 구조를 손상의 더 높은 기회가 있다.
여기에 설명 된 절차를 특정 단백질 또는 사본 immunodetection 프로토콜 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 분석 실험을 사용 하 여 적합 한 번데기 날개 샘플 받는 신속 하 고 효율적인 방법을 찾을 수 수요에 의해 개발 되었다. 이 표현과 패치 (Ptc 또는 Hh 통로의 정식 수용 체)의 지역화를 설명 하기 위해 번데기 날개 샘플을 성공적으로 수행 완료 관련 세부 정보를 포함 하는 프로토콜을 제공에서 발견 되 절차입니다.
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Protocol
주 1
1. 수집 및 경작 번데기입니다.
- Puparium 대형 (APF) 또는 교양된 튜브에서 젖은 페인트 브러시를 사용 하 여 prepupae 후 0 h를 제거 하 고 거의 완전 한 개발 기간에 새로운 튜브에 넣어 (2.1 및 2.2 참조).
참고: 파리의 건강 한 인구 표준 자란 프로토콜을 사용 하 여 유지 되어야 합니다. 3 또는 4 일 후 달걀 누워 있다, 성인 개인의 최적의 개발 있도록 튜브에서 제거할 수 있습니다. 그들은 세 번째 탈피 애벌레 pupation 시작 될 때까지 일정 한 온도에서 유지 관리 됩니다. 애벌레/번데기 전환 0 h APF를 간주 하는 prepupa의 형성에 의해 표시 됩니다. prepupa 앞쪽 spiracles 튀어나온 모양 둥근 된 직사각형을 움직이지 흰 애벌레입니다.
주 2
2입니다. 양도, 해 부 및 고정입니다.
- 칠하기 붓에 번데기 (2 h 개발 시간이 되기 전에 완료) 전송 더블 양면 테이프와 현미경 슬라이드를 준수. 등 쪽 측 및 두 부와 행 끝 같은 방향으로 향하게 하는 형태로 pupae를 놓습니다.
- 일정 한 온도를 현미경 슬라이드를 반환 하 고 (즉, 24-30 h APF) 적절 한 개발 시간을 완료 하는 데 번데기를 허용.
참고: 이중 양면 테이프와 현미경 슬라이드 번데기 케이스 (아래 참조)를 제거 하는 일시적인 절 개 플랫폼 될 것입니다. (유리병) 밖에 서 현미경 슬라이드에 시간 경과 집게와 쉽게 깨뜨릴 만들기 번데기 경우 건조에 도움이 됩니다. - operculum 집게를 사용 하 여 번데기 케이스에서 제거 합니다.
- (비디오에서와 같이) 집게 경우 휴식 그것의 꼬리 끝에는 번데기의 측면을 따라 라인을 만들기. 적절 한 조명 분명 번데기 날개의 바로 위에 경첩 공간 만들기 번데기의 내부 형태를 검출 하기 위하여 가능 하다. 이 공간 번데기를 손상 없이 여 수행 하는 가이드 역할을 합니다.
- 케이스, 열린된 국경에 의해 그들을 데리 고 이중 면 테이프 그들을 막을 것 이다 반대 측에 그들의 부분을 제거 합니다. 해 부의 끝에 번데기는 거의 "누드", 케이스의 단지 작은 조각을 후부 팁을 덮고 있을 것 이다 있을 것 이다.
참고: 위 꼬리 끝에는 작은 양의 경우의 목적은 이중 양면 테이프와 함께 슬라이드에 사건에서 부드러운 릴리스 되도록. 이 작업 뒤에 이유는 때문에 너무 많이 제거 하면 경우의 수는 크게 번데기 손상 위험. 다른 한편으로 너무 작고, 제거 하면 번데기 쉽게 오지 않을 경우 무료. - 아래로 밀어 (겸 자)와 케이스의 나머지. 이 운동은 머리와 흉부 준수 하 고 다음 단계에서 전송 우선 위치에 번데기의 앞쪽 끝을 올릴 것 이다.
- 더블 양면 테이프와 새 슬라이드 하 고 번데기 또는 pupae 행에 반전. 번데기의 파손을 방지 하기 위해 stereomicroscope의 도움으로 움직임을 관찰 하 여이 방법을 수행 하는 것이 좋습니다.
- 약간 pupae 테이프에 충실 하 고 부드럽게 슬라이드의 경우 나머지에서 번데기를 제거 하려면 활강을 누릅니다. 현미경 슬라이드 반전: 번데기 수준 그들의 머리의 등 쪽에 붙어 있을 것입니다 / 가슴 지역.
- 4 %paraformaldehyde 모든 벌 거 벗은 pupae를 커버 하 고 10 분을 기다립니다. 우리의 경험에는 정착 제와 시간이 경과 표 피 회사, 덜 끈 적 하 고 취급 하 게 쉬운 그것을 만들기의 일관성을 변경 수 있습니다.
참고: Ribonucleic 산 (RNA) 추출을 수행 하려면 RNase와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 대 한 대체 paraformaldehyde 물 무료 하 고 만드는 각 돌출부의 힌지 지점 근처 (가 위 만으로도) 컷 번데기 날개를 제거 합니다. Guanidinium 안산 및 페 놀 시 약의 1 mL microcentrifuge 튜브에 번데기 날개를 전송 집게를 사용 하 여. 50-80 날개의 총 수집 후 RNA 추출10,11수행까지-80 ° C에서 microcentrifuge 튜브를 저장 합니다. - 작은 절 개를 경첩 지역에서 날개의 또는 근처를 확인 합니다. 정착 액 날개 상피에 도달 하실 수 있습니다. 날개에는 피 펫 (p200) 플러시 통을 사용 하 여. 홍 조 대체 하는 경우는 오염 된 흥분 시키는 새로운. 홍 조, 후 5 분 동안 정착 액에 날개를 유지.
참고: 이 책략 오염 직물의 대다수를 멀리 맑게 하는 데 도움이, 비록 일부 hemocytes와 지방 방울 남아 있을 수 있다 날개의 등 쪽과 복 부 상피 층 사이 덫 ( 그림 1A참조). - (비디오에서와 같이) 표 피 테두리에서 집게로 눈물 구멍을 확대 하 고 표 피 sac에서 날개 상피의 릴리스를 사용. 일단 날개 조직 발표, 고정 30 분 완료 paraformaldehyde 솔루션에 둡니다.
- 것을 PBST 4 던 플라스틱 접시 가득 고정된 날개를 전송 (Triton X-100 0.05%). 4 ° c.에 게 하룻밤
3 일
3. 1 차적인 항 체 외피입니다.
- PBST에서 번데기 날개 잠복기 조직 permeabilize (Triton X-100 0.2%) 부드러운 액체 중간 움직임을 촉진 하기 위하여 락 플랫폼을 사용 하 여 15 분.
참고: 샘플을 설치까지 단계 락 플랫폼을 사용 하 여 수행 한다. - PBSTA를 사용 하 여 샘플을 차단 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 1 시간에 대 한.
- 동일한 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 (마우스 항-Ptc, 1: 100)를 희석 하 여 4 ° c.에 하룻밤 번데기 날개를 품 어
4 일
4. 이차 항 체 외피입니다.
- 워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)
- 이차 항 체 (예, 반대로 마우스에 형광 색소 활용 된)와 함께 품 어 PBSTA에 적절 한 농도를 희석 (BSA 3%, Triton X-100 0.1%) 2 시간에 대 한 어둠 속에서 실내 온도에.
참고: 적절 한 경우 조직 counterstain를 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 phalloidin을 사용 합니다. 이차 항 체의 신호의 중복을 방지 하기 위해 형광 방출 파장을 고려와 함께이 프로브를 추가 합니다. - 워시 샘플 4 x 10 분 각 PBST와 (Triton X-100 0.05%)
5입니다. 장착
- 마치 그들은 사각형의 꼭지점 현미경 슬라이드에 투명 한 매니큐어의 4 점 들을 배치 하 여 샘플 슬라이드를 준비 합니다.
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Representative Results
프로토콜에는 날개의 익숙한 형태를 유지 하는 번데기 날개 샘플을 얻기 위해 간단한 방법을 제공 합니다. 이 준비에서 2 차원 또는 3 차원 분포 및 날개의 분화 중 단백질의 농축 조사로 예상 될 수 있는 이미지의 더미를 얻을 수 있다. 유사한 프로토콜 수집 보완 deoxyribonucleic acid (cDNA), PCR 반응에 사용 된 서식 파일을 합성 하는 데 필요한 큰 번데기 날개 샘플 (관련 된 50-80 번데기 날개)를 사용할 수 있습니다 (2.9에 참고 참조).
그림 1 :에서 hedgehog 통로 유전자 초파리 번데기 날개
(A) 패치, Hedgehog 통로의 정식 수용 체에서 24-30 h APF 가시화 했다 마우스 안티-를 사용 하 여 Ptc 핵 했다 counterstained DAPI와 반면 걸 필 라 멘 트 그린 형광 phalloidin를 사용 하 여 시각화 됩니다. 말라 배포 지역화 날개 정 맥 및 패치 식과의 관계에 도움이 됩니다. 동시에 phalloidin 얼룩 일부 hemocytes 및 조직의 오염으로 지방 방울 (큰 원)의 존재를 보여준다. 20 배 확대, 앞쪽입니다. 바, 100 µ m (B) 규모 Amplicons 걸 을 (레인 1, 280 혈압) 및 ptc (레인 2, 236 bp) 메신저 RNA (mRNA) 날개 샘플 비슷한 해 부 프로토콜에 의해 생성 된 cDNA synthetized를 사용 하 여 얻은 했다. Mw로, 분자량입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 비디오에서 설명 하는 해 부의 방법은 다양 한 기법에 대 한 다른 개발 단계에서 초파리 번데기 날개의 높은 품질의 샘플을 준비 사용할 수 있습니다 (예를 들어, 면역 형광 검사, PCR 분석 실험, cDNA 합성 생체 외에서 개발 날개). 이 방법의 관점에서 관련 된 과학자 24-30 h APF를 사용 했습니다. 그러나 젊은 이상 번데기의 해 부에 필수적인 단계 내에서 아무런 장애물이 있어야 한다. 변화는 작은 무대 번데기를 수용 하 여야 할 수 있습니다.
프로토콜 한 번데기 또는 여러 pupae 동시에 해 부를 수행 수 있습니다. 쉽게 해 부 날개의 많은 수를 도달 하는 절차를 가속 수 있습니다. 이 경우 동시에 4-5 pupae의 행을 제거 하는 옵션이입니다. 함께 번데기를 제거 하거나 불가능, 계속 동일한 슬라이드에 개별적으로 제거할 수 있습니다 (III 비디오의 섹션을 참조 하십시오: "여러 pupae 해 부"). 에서 제거 하려면 알몸 번데기 열린된 경우, 후부 끝은 충분히 작은 중요 하다. 그것은 완전히; 경우 제거할 수 전송 더 빨리 만들 것 이라고, 비록 전체 케이스의 제거 도전 그리고 번데기 손상의 큰 위험이 있다.
경험을 고려 하는 중요 한 책략은 (규정 개발 시간을 완료 하는 마지막 2 h) 지시 번데기 인큐베이터 안에 있지만 유리병 밖에 서 현미경 슬라이드에 연결 된. 시간이 경과 경우 휴식을 쉽게 건조에 도움이 됩니다. 전체 날개 표면에 항 체에 대 한 액세스를 부여 함으로써 날개 상피를 포함 하는 표 피를 벗기다 immunohistochemistry, 대 한 해 부 동안 또 다른 중요 한 단계가입니다. 이 단계는 몇 분 (적어도 힌지 지점에서 절 개 후 5 분) 동안 고정 후 이루어져야 한다는 정착 제는 조직 안정화 때문에 표 피 일관성을 변경, 쉽게 껍질.
모든 immunohistochemistry 단계를 수행 하는 동안 날개 (락 플랫폼) 지속적인 운동에는 반드시.입니다 운동 교환 및 세척 및 외피는 솔루션의 침투를 향상 시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 부드럽게이 깨지기 쉬운 구조 (즉, 그것은 충분 한 플랫폼의 진동 약간 액체 매체 포함 된 이동의 형태에서 원치 않는 왜곡의 발생을 방지 하는 그들을 수행 하는 것이 중요 하다 샘플)입니다.
이 절차에서는 번데기 윙 절 개에 대 한 이미 게시 된 방법에 대 한 대체 및 보완 접근 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 CSIC confocal 현미경 검사 법;와 그녀의 기술 지원에 대 한 마리 디 Doménico를이 프로젝트에 주어진 재정 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 그의 원고 교정;에 대 한 호세 레오나르도 Báez를 루치아노 코레아 비디오;의 창조에 그의 헌신을 비디오에 대 한 그녀의 목소리와 블루밍턴 초파리 재고 센터 제공 하는이 연구에 사용 하는 주식에 대 한 대출에 대 한 나탈리 아 Rosano 하. 이사벨 게레로 의해 단일 클로 널 항-Ptc 개발 Apa1에서는 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)는 NICHD의 후원을 얻은 고 아이오와의 대학, 생물학 학과, 52242 아이오와 시, IA에 의해 유지.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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