Summary
Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.
Abstract
Drosophila melanogaster kanat geliştirme morfogenez doku düzeyinde eğitim için ideal bir modeldir. Kanat Imaginal diskler embriyonik gelişim sırasında oluşan adlandırılmış hücreler bir grup bu ekleri geliştirmek. Larva aşamasında Imaginal diskler, onun hücre sayısı artan ve monolayered epitel yapıları oluşturan büyümek. Pupa çantasının içinde Imaginal diskler dışarı ahbap ve bilayers kanat gelecekteki marjı olur bir çizgi boyunca içine katlayın. Bu işlem sırasında boyuna primodia damar damar hücreleri kanat potansiyel dorsal ve ventral yüzeylerinde kaynaklanır. Pupa aşamasında damar hücreleri her yüzey çizgili sıkı tüpler oluşturmak için iletişim kurma; aynı zamanda, çapraz-damarlar onların oluşumu başlar.
Uygun moleküler işaretleyiciler yardımıyla, kanat gelişimi sırasında beste büyük öğeleri tanımlamak mümkündür. Bu nedenle, doğru bir şekilde transkript veya proteinler bu yapısında algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme kanat geliştirme süreciyle ilgili eğitim için önemlidir.
Yordamı pupa kanat kanat pupa aşamasında incelemek konusunda ayrıntılı yönergeler sağlama, manipüle üzerinde odaklanır burada açıklanan. Pupa doku diseksiyon üçüncü INSTAR larva meslektaşlarına gerçekleştirmek daha zordur. Bu yüzden bu yaklaşım hızlı ve verimli kaliteli örneklerini almak için geliştirilmiştir. Nasıl immunostain ve mount ayrıntılarını iletişim kuralında proteinler veya hücre bileşenleri, görselleştirme izin vermek için bu kanat örnekleri sağlanır. Küçük uzmanlığı ile 8-10 kaliteli pupa kanatları kısa bir miktarda toplamak mümkündür.
Introduction
Drosophila kanat kanat Imaginal disklerinden geliştirilir. Bu kanat diskler ilkel konur bir kenara embriyonik epitel invaginate 20-30 Imaginal hücre küçük gruplar olarak embriyonik gelişim sırasında. Larva üçüncü INSTAR Sahne Alanı'na büyüyor sırasında mitoz Imaginal hücrelerde, numaraları (yaklaşık 50000 hücreleri) yükselterek ve kanat oluşturan1,2,3disk belirli karakteristik zamanlarda oluşur, 4. Hücrelerin prolifere olarak, onlar kendi kendine katlanır bir kompakt spiral kaynaklanan bir borulu epitel moda. Pupation sırasında disk epitel dışarı formu iki katmanlı kanat teleskoplar ve boyuna damarlar lacunae aralarında, olarak iki kez kanat gelişimsel5,6sırasında oluştuğu başlar.
Damarlar düzenlenmesi her zaman özdeş bir deseni vardır; kolayca her değişiklik damar oluşumu içinde tanımlama yeteneği mutasyonlar son derece görünür (örneğin eksik veya fazla damarlar, değişiklikler ven pozisyonlar, vb.) yapar. İlginçtir, fenotip çeşitleri genellikle kanat geliştirme için uygun olan yollar sinyal, bilinen ya da roman bileşenleri mutasyonların kanıtı vardır. Bir konumu belirleme ve ven ve intervein bölgeleri korumak bir rol oynar yollar kirpi (Hh) yolu6,7,8' dir.
Pupa kanat önemi bir modeli sistem olarak göz önüne alındığında, çalışmak için kaliteli örneklerini almak önemli olacaktır. Geçmişte, protokolleri kopyalayabilmek Drosophila kanatlar için yayımlamış bilim adamları uygulanabilir örnekleri ulaşmak için uygun bir rehber vermedin. Bir araştırmacı rehberlik bir açıkça işlemi görselleştirmek olamaz. Bu alternatif diseksiyon yaklaşımlar pupa iki, ayıran kanat doku çevreleyen bölünmüş ve enkaz kaldırmak için tekrar tekrar yıkadım. Bu tür bir yaklaşım talep ücretsiz olarak kanat bırakmak kirlenmektedir ama önceki yılların deneyimi daha yavaş bir süreçtir ve kırılgan kanatları9yapısını ödün bir yüksek şans olduğunu.
Burada açıklanan yordamı pupa kanat örneklerini spesifik proteinlerin veya immunodetection iletişim kuralları veya Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) deneyleri kullanarak transkript algılamaya uygun almak için hızlı ve etkili bir yöntem bulmak için talep tarafından geliştirilmiştir. Bu, ifade ve yerelleştirme yamalı (Ptc veya Hh yolu kurallı reseptör) göstermek için başarıyla tam taşımak için ilgili ayrıntıları içeren bir protokolü sağlayan pupa kanat yapılan tespit yordam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gün 1
1. toplama ve kültür pupa.
- Puparium oluşumu (APF) veya ıslak fırça kültürlü şişeleri kullanarak prepupae sonra 0 h kaldırmak ve neredeyse Geliştirme süresini tamamlamak için yeni şişeleri koyun (bkz: 2,1 ve 2,2).
Not: Sinekler sağlıklı bir nüfusa standart kodlamayla protokolleri kullanarak sağlanmalıdır. Üç ya da dört gün sonra içinde yumurta koyulur yetişkin bireylerin en uygun bir gelişme izin vermek için şişeleri kaldırılabilir. Üçüncü INSTAR larva pupation başlatmak kadar onlar sabit bir sıcaklıkta tutulur. Larva/pupa geçiş 0 h APF kabul prepupa oluşumu ile işaretlenir. Prepupa anterior vızıltısı çıkıntılı şekli yuvarlak bir dikdörtgen vardır hareketsiz bir beyaz larva var.
2. gün
2. Aktarım, diseksiyon ve fiksasyon.
- Pupa (geliştirme zamanı gelmeden 2 s tamamlamak) için bir fırça ile aktarmak için mikroskop slayt çift taraflı bant ile yapıştırılır. Pupa aynı yöne bakarak bir satır yukarı ve Sefalik dorsal yanlarıyla biter forma yerleştirin.
- Sabit sıcaklık için mikroskop slayt dönmek ve pupa uygun gelişim zaman (Yani 24-30 h APF) tamamlamak izin.
Not: Çift taraflı bant ile mikroskop slayt pupa durumu (aşağıya bakın) kaldırmak için bir geçici diseksiyon platform olacak. Zaman atlamalı (şişe dışında) mikroskop slaytta yapım o Forseps ile kolayca kırılabilir pupa durumda kuru için yardımcı olur. - Operculum forseps kullanarak pupa durumundan çıkarın.
- Durum (videoda gösterildiği gibi) Forseps ile kırmak pupa tarafında bir satır Kaudal sonuna kadar yapma. Uygun aydınlatma ile menteşe üstüne sadece bir boşluk pupa kanat belirgin hale pupa iç şeklini tespit etmek mümkündür. Bu alan pupa zarar vermeden açılış gerçekleştirmek için bir rehber olarak hizmet vermektedir.
- Tarafından açılan sınır alacak ve onları nerede çift taraflı bant onları tutacaktır ters tarafına taşıyan dava bölümlerini kaldırın. Diseksiyon sonunda Pupa "neredeyse çıplak" sadece küçük bir parça kasanın arka uç kapsayan olacak, olacak.
Not: durum küçük bir miktar üst Kaudal ucunda bırakarak amacı çift taraflı bant ile slayda davasından pürüzsüz bir yayın sağlamaktır. Bu eylem arkasındaki mantık olduğunu çünkü çok fazla kaldırmak durumunda büyük ölçüde pupa zarar riski. Çok az kaldırırsanız, öte yandan pupa kolayca durumunda ücretsiz gelmeyecek. - (Forseps ile) durumda kalan aşağı doğru itin. Bu hareketin baş ve göğüs uymaları ve sonraki adımda aktarılacak tercihli bir pozisyonda kalmak için izin pupa, ön sonu yükseltin.
- Çift taraflı bant ile yeni bir slayt al ve pupa veya pupa satır tersine çevirin. Pupa kırılma önlemek için stereomicroscope yardımı ile hareketleri gözlemleyerek bu yaklaşım yapmak tavsiye.
- Biraz teybe sopa ve yavaşça pupa servis taleplerini geri kalanından kaldırmak için slayt kayma pupa yapmak için tuşuna basın. Mikroskop slayt Invert: pupa başlarının düzeyinde dorsal tarafta sıkışmış / göğüs alan.
- %4 paraformaldehyde ile çıplak pupa kapak ve 10 dakika bekleyin. Deneyim, sabitleştirici zamanla bu sukut yapım o sağlam, daha az yapışkan ve kolay kütikül tutarlılığını değiştirmek için yardımcı olur.
Not: Ribonükleik asit (RNA) ayıklama gerçekleştirmek için RNase ile yapılan yedek paraformaldehyde fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) için su ücretsiz ve her ek parça menteşe turistik yakınındaki (makas yardımıyla) bir kesim yapmak pupa kanatları kaldırın. Forseps kullanarak, Pupa kanat microcentrifuge tüp guanidinium thiocyanate ve fenol reaktif 1 mL ile aktarın. Toplam 50-80 kanat topladıktan sonra microcentrifuge tüp-80 ° C'de RNA ayıklama10,11performans kadar saklayın. - Küçük bir insizyon attım menteşe bölgesi, kanat veya yakınında olun. Kanat epitel ulaşmak sabitleştirici izin. Bir pipet (p200) floş sabitleştirici kanat üzerinde kullanarak. Ne zaman değiştir kızarma kirlenmiş yeni ile bağlamak. Sonra kızarma, kanat sabitleştirici 5 min için unutmayın.
Not: Her ne kadar bu manevra uzakta bulaşıcı doku çoğunluğu temizlemek için yardımcı olur, bazı hemocytes ve yağ damlacıkları dorsal ve ventral epitel katmanları kanat arasında sıkışıp kalabilir ( şekil 1A' ya bakınız). - (Videoda gösterildiği gibi) gözyaşı kütikül sınırları üzerinden Forseps ile deliği genişleyen ve kütikül sac kanat epitel sürümünden etkinleştirme. Kanat doku yayımlandıktan sonra fiksasyon 30 dk tamamlamak için paraformaldehyde çözüm bırakın.
- Bir plastik tabak 4 benzetti dolu PBST ile sabit kanatlar aktarmak (Triton X-100% 0.05). Mağaza gecede 4 ° C'de
3. gün
3. birincil antikor kuluçka dönemiydi.
- PBST pupa kanatlarda kuluçka doku permeabilize (Triton X-100% 0,2) için nazik bir sıvı orta hareketi kolaylaştırmak için sallanan bir platform kullanarak 15dk.
Not: Örnekleri montaj kadar adımları sallanan bir platform kullanılarak gerçekleştirilmelidir. - PBSTA kullanarak örnekleri engelleme (BSA % 3, Triton X-100% 0.1) 1 h için.
- Birincil antikor (fare anti-Ptc, 1: 100) sulandırmak ve pupa kanatları gecede 4 ° C'de kuluçkaya için aynı arabellek kullanın
4. gün
4. ikincil antikor kuluçka dönemiydi.
- Yıkama örnekleri 4 x 10 dk her PBST ile (Triton X-100% 0.05)
- İkincil antikor (Birleşik fluorochrome içinörneğin, Anti-fare) ile kuluçkaya PBSTA uygun konsantrasyon için seyreltilmiş (BSA % 3, Triton X-100% 0.1) 2 h için karanlık oda sıcaklığında.
Not: Uygun olup olmadığını, doku counterstain için 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve/veya phalloidin kullanın. Bu sonda emisyon dalga boyu sinyalleri çakışma önlemek için fluorochromes dikkate alarak ikincil antikor ile ekleyin. - Yıkama örnekleri 4 x 10 dk her PBST ile (Triton X-100% 0.05)
5. montaj
- Bir örnek slayt onlar köşeleri kare sanki mikroskop slayt üzerinde şeffaf oje 4 nokta koyarak hazırlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol kanat tanıdık Morfoloji korumak pupa kanat örnekleri elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır. Bu hazırlıklar yığınlar olarak 2-B veya 3-b, dağıtım ve/veya proteinler zenginleştirme kanat farklılaşma sırasında araştırmak için öngörülen görüntüleri elde etmek mümkündür. Benzer bir Protokolü (2,9 nota bakın) büyük pupa kanat örnek (içeren 50-80 pupa kanatları) tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA), PCR reaksiyonları içinde kullanılan şablon sentezlemek gerekli toplamak için kullanılabilir.
Resim 1 : Kirpi yolu geni Drosophila pupa kanatları
(A) yamalı, kirpi yolu, kurallı reseptör görselleştirildiği 24-30 h APF aktin filamentleri yeşil-floresan phalloidin kullanarak görüntülenir, ancak fare anti - kullanarak Ptc. çekirdek DAPI ile counterstained. Aktin dağıtım kanat damarlar ve yamalı ifade ile ilişkisi yerelleştirmek için yardımcı olur. Aynı zamanda, bazı hemocytes ve doku kirletici olarak yağ damlacıkları (büyük daireler) varlığı phalloidin leke ortaya koymaktadır. 20 x büyütme, anterior doldu. Ölçek 100 µm (B) bar, aktin Amplicons (lane 1, 280 bp) ve ptc (lane 2, 236 bp) cDNA synthetized benzer bir diseksiyon iletişim kuralı tarafından oluşturulan mesajcı RNA (mRNA) kanat örnekten kullanarak elde edilmiştir. MW, molekül ağırlığı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu videoda açıklanan diseksiyon yöntem teknikleri birçok türleri için farklı geliştirme aşamalarını Drosophila pupa kanat örnekleri kaliteli hazırlamak için kullanılabilir (Örneğin, ayirt, cDNA sentezi için PCR deneyleri, Tüp Bebek kanat geliştirme). Bu yöntem açısından bilim adamı dahil 24-30 h APF kullandık. Ancak genç ya da yaşlı pupa diseksiyon temel adımları içinde hiçbir engel olmalıdır. Değişiklikler daha küçük sahne pupa karşılamak için yapılması gerekebilir.
Protokol bir pupa veya birkaç pupa aynı zamanda incelemek için gerçekleştirilebilir. Bu yordamın disseke kanatları çok sayıda ulaşmak kolaylaşır, hızlandırmak için yardımcı olur. Bu durumda aynı anda 4-5 pupa bir satırı kaldırma seçeneğiniz vardır. Pupa birlikte çıkarın veya mümkün değilse aynı slayt tek tek kaldırmak devam (bkz: III video: "Birden çok pupa diseksiyon"). Çıplak pupa açılan davadan kaldırmak için arka uç kadar küçük olması önemlidir. Bu durumda tamamen kaldırmak mümkündür; transfer hızlandırmak karşın tüm davası kaldırılması zordur ve pupa zarar verme riski daha fazla.
Deneyim düşünmeye önemli bir manevra (son 2 öngörülen Geliştirme süresini tamamlamak için h) bırakmaktır dikte pupa bağlı mikroskop slayta kuluçka makinesi içinde ama şişe dışında. Bu sukut zaman kırmak daha kolay hale durumda kuru için yardımcı olur. Böylece bütün Kanada yüzeye antikor erişim verme kanat epitel kaplar kütikül akasındaki immünhistokimya, diseksiyon sırasında başka bir kritik adım var. Bu adım birkaç dakika (en az 5 belgili tanımlık kesme menteşe noktada yaptıktan sonra en az) için sabitleme sonra yapılmalıdır sabitleştirici dokular stabilize ve kütikül tutarlılık değiştirir çünkü, soyma kolaylaşır.
Tüm immünhistokimya adımları yerine getirirken, kanatları (platform sallanan) sürekli hareket içinde olduğundan emin olun. Hareketi Kavşağı ile yıkama ve incubations sırasında çözüm penetrasyon geliştirmeye yardımcı olur. Yine de, bunları yavaşça bu kırılgan yapının (platformu titreşimler biraz sıvı orta içeren taşımak yeterliYani, morfolojisi içinde istenmeyen distorsiyonları oluşumunu önleme gerçekleştirmek önemlidir örnekleri).
Bu yordam bir alternatif ve tamamlayıcı yaklaşım pupa kanat diseksiyon zaten yayımlanmış yöntemler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
CSIC Mariana Di Doménico confocal mikroskobu ile onun teknik yardım almak için bu projeye verilen mali destek için teşekkür etmek istiyorum; onun el yazması düzeltmeler için José Leonardo Báez için; Luciano Correa video kurulması için yaptığı özveri için için; Rosano sesini video için ve bu çalışmada kullanılan hisse senetleri sağlamak için Bloomington Drosophila stok merkezi borç verme için Natalia için. Monoklonal anti-Ptc geliştirilen Apa1 Isabel Guerrero tarafından gelen gelişim çalışmaları Hibridoma banka (DSHB)'da NICHD elde edilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 tarafından yapılmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
