Summary
De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).
Abstract
Vleugel ontwikkeling bij Drosophila melanogaster is een ideaal model voor het bestuderen van de morfogenese weefsel niveau. Deze aanhangsels ontwikkelen uit een groep van cellen met de naam imaginaire schijven vleugel gevormd tijdens de embryonale ontwikkeling. In de larvale stadia groeien de imaginaire schijven, verhoging van het aantal cellen en de vorming van monolayered epitheliale structuren. In de pop behuizing, de imaginaire schijven bud uit en vouw in bilayers langs een lijn die de toekomstige marge van de vleugel wordt. Tijdens dit proces zijn de longitudinale primodia aderen afkomstig ader cellen op de potentiële dorsale en ventrale oppervlak van de vleugel. Tijdens het popstadium communiceren de strepen van ader cellen van elk oppervlak om het genereren van strakke buizen; op hetzelfde moment beginnen de Kruis-aders hun vorming.
Met behulp van passende moleculaire merkers is het mogelijk om de belangrijke elementen samenstellen van de vleugel tijdens zijn ontwikkeling te identificeren. Om deze reden is de mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in deze structuur cruciaal voor het bestuderen van hun overvloed en localisatie verbonden met het ontwikkelingsproces van de vleugel.
De procedure beschreven hier richt zich op het manipuleren van pop vleugels, het verstrekken van gedetailleerde instructies over hoe om te ontleden de vleugel tijdens het popstadium. De dissectie van pop weefsel is moeilijker uit te voeren dan hun tegenhangers in derde instar-larven. Dit is de reden waarom deze aanpak werd ontwikkeld, om snelle en efficiënte hoge kwaliteit monsters krijgen. Details over het immunokleuring en mount deze vleugel monsters, dat de visualisatie van proteïnen of celbestanddelen, vindt u in het protocol. Met weinig deskundigheid is het mogelijk om te verzamelen van 8-10 hoge kwaliteit pop vleugels in een korte hoeveelheid tijd.
Introduction
Drosophila vleugels zijn ontwikkeld op basis van de vleugel imaginaire schijven. De primordiale van deze vleugel schijven zijn opzij zetten tijdens de embryonale ontwikkeling als kleine groepen van 20-30 imaginaire cellen die van de embryonale epitheel invaginate. Terwijl de larve naar de derde fase van de instar groeit, optreden mitose in de imaginaire cellen op specifieke karakteristiek tijden het verhogen van de nummers (ongeveer 50000 cellen) en de vorming van de vleugel disc1,2,3, 4. Als de cellen verspreiden, mode ze een tubulaire epitheel, resulterend in een zelf vouwen compacte spiraal. Tijdens verpopt, de schijf epitheel telescopen uit aan de twee-gelaagde vorm wing en de longitudinale aders beginnen als lacunes tussen hen, die tweemaal tijdens vleugel developmental5,6optreedt.
De rangschikking van de aderen altijd heeft een identieke patroon; de mogelijkheid om gemakkelijk identificeren dat bij iedere wijziging in de aderen vorming maakt mutaties uiterst zichtbaar (bijvoorbeeld ontbrekende of extra aderen, veranderingen in de ader posities, enz.). Interessant is dat zijn het fenotype variaties meestal het bewijs van mutaties in bekende of nieuwe onderdelen van signalering van trajecten die relevant voor de ontwikkeling van de vleugel zijn. Een van de trajecten die speelt een rol bij het bepalen van de positie en onderhouden ader en intervein gebieden is de egel (Hh) traject6,7,8.
Gezien het belang van de pop vleugel als een modelsysteem, is het belangrijk om goede kwaliteit te werken met monsters. In het verleden, hebben de wetenschappers die protocollen voor het ontleden van Drosophila vleugels hebben gepubliceerd een passende gids voor het bereiken van werkbare monsters niet gegeven. Zonder begeleiding van een onderzoeker kan niet een duidelijk visualiseren van het proces. In deze alternatieve ontleden benaderingen is de verpopping gesplitst in twee, het scheiden van de vleugel van het omliggende weefsel en herhaaldelijk gewassen om te verwijderen van het puin. Dit soort benadering vorderingen te verlaten de vleugel gratis verontreinigt maar als gevolg van eerdere ervaring het proces is langzamer en is er een hogere kans van de structuur van de breekbare vleugels9in gevaar te brengen.
De hier beschreven procedure werd ontwikkeld door de vraag te vinden van een snelle en efficiënte werkwijze te halen pop vleugel monsters geschikt specifieke proteïnen of afschriften met behulp van immunodetection protocollen of polymerase kettingreactie (PCR) tests op te sporen. Om te illustreren de expressie en de lokalisatie van Patched (Ptc of de canonieke receptor van het leertraject Hh) wordt aangetroffen in pop vleugel monsters, bieden een protocol waarin de relevante details met succes uit te voeren voor de volledige procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. verzamelen en kweken van poppen.
- Verwijderen 0 h na de vorming van de puparium (APF) of prepupae met behulp van een natte penseel uit gekweekte flesjes en plaats ze in nieuwe flesjes om bijna volledige periode van de ontwikkeling (zie 2.1 en 2.2).
Opmerking: Een gezonde bevolking van vliegen, moet worden gehandhaafd met kweken standaardprotocollen. Na drie of vier dagen waarin de eieren worden gelegd, kunnen de volwassenen uit flesjes om een optimale ontwikkeling van de personen worden verwijderd. Ze worden bijgehouden op een constante temperatuur, totdat de derde instar-larven verpopt initiëren. De larvale/pop overgang wordt gekenmerkt door de vorming van de prepupa beschouwd als de 0 h APF. De prepupa is een immobiele witte larve, die een langwerpig heeft, ronde vorm met uitstekende anterior spiracles.
Dag 2
2. overbrenging, dissectie en fixatie.
- De poppen (2 h voordat de ontwikkelingstijd is compleet) Pipetteer met behulp van een penseel, tot het microscoopglaasje met dubbelzijdige tape aan gehouden. Plaats de poppen aan formulier die een rij met dorsale zijden omhoog en cephalic eindigt geconfronteerd met dezelfde richting.
- Het microscoopglaasje terugkomen met constante temperatuur en laat de poppen te voltooien de ontwikkelingstoxiciteit tijdig (dat wil zeggen 24-30 h APF).
Opmerking: Het microscoopglaasje met de dubbelzijdige tape is een voorbijgaande dissectie platform te verwijderen van het pop geval (zie hieronder). Het verstrijken van de tijd op het microscoopglaasje (buiten de flacon) helpt bij het drogen van de pop zaak waardoor het gemakkelijk breekbaar met een tang. - Verwijder de operculum uit de pop zaak met pincet.
- Het geval breken met pincet (zoals weergegeven in de video) maken van een lijn langs de kant van de verpopping naar het caudal einde van het. Met de juiste verlichting is het mogelijk om te ontdekken de interne vorm van de verpopping een ruimte net boven het scharnier voor de pop vleugel duidelijk maken. Deze ruimte dient als een gids voor het uitvoeren van de opening zonder beschadiging van de verpopping.
- Gedeelten van het geval, ze opgepakt door de geopende grens en uitvoering daarvan naar de tegenovergestelde zijde waar de dubbelzijdige tape ze houden zal worden verwijderd. Aan het einde van de dissectie zullen de poppen bijna "naakt", dat slechts een klein stukje van de zaak zal met betrekking tot het achterste uiteinde.
Opmerking: Het doel van het verlaten van een kleine hoeveelheid van de zaak op de bovenkant van de caudal is om ervoor te zorgen een soepele release uit de zaak op de dia met de dubbelzijdige tape. Redeneren achter deze actie is omdat als u teveel verwijderen voor het geval u aanzienlijk het risico de verpopping beschadigen. Aan de andere kant als u te weinig verwijdert, komt de verpopping gemakkelijk niet vrij van de zaak. - Duw omlaag (met een tang) de rest van de zaak. Deze beweging zal het verhogen van het anterieure einde van de verpopping, waardoor zowel de kop en de thorax verblijven in een bevoorrechte positie te houden en te dragen in de volgende stap.
- Neem een nieuwe dia met dubbelzijdige tape en het omkeren van de verpopping of poppen rij. Het is raadzaam voor het uitvoeren van deze aanpak door het observeren van de bewegingen met de steun van de stereomicroscoop om te voorkomen dat de breuk van de poppen.
- Druk op een iets te maken van de poppen vasthouden aan de tape en zachtjes de dia te glijden om het verwijderen van de poppen van de rest van de gevallen. Het microscoopglaasje omkeren: de poppen zal worden geplakt op de dorsale zijde op het niveau van hun hoofd / thorax gebied.
- Dekking van alle de naakte poppen met 4% paraformaldehyde en wacht 10 minuten. In onze ervaring helpt deze verstrijken van de tijd met de fixatief om te veranderen van de consistentie van de cuticle bestaat waardoor het stevige, minder plakkerig en gemakkelijk te hanteren.
Opmerking: Voor het uitvoeren van de extractie van RNA acid (RNA), plaatsvervanger paraformaldehyde voor fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gemaakt met RNase gratis water en verwijder de pop vleugels waardoor een snede (met de hulp van schaar) in de buurt van het scharnier punt van elke aanhangsel. Met behulp van Tang, overbrengen in de pop vleugel een microcentrifuge buis met 1 mL kaliumthiocyanaat en fenol reagens van de guanidinium. Na het verzamelen van een totaal van 50-80 vleugels, slaan de microcentrifuge buis bij-80 ° C tot het uitvoeren van het RNA extractie10,11. - Maken een kleine snede in de regio van de scharnier van de vleugel of in de buurt van het. Laat de fixeerspray te bereiken van het epitheel van de vleugel. Met behulp van een precisiepipet (p200) flush kleefpoeders boven de vleugel. Wanneer spoelen vervangen fixeren de verontreinigde met nieuwe. Na het spoelen, vleugel in fixeerspray voor 5 min te houden.
Opmerking: Hoewel deze manoeuvre helpt om duidelijke weg de meerderheid van de besmettende weefsel, sommige hemocytes en dikke druppels kunnen blijven opgesloten tussen de dorsale en ventrale epitheliale lagen van de vleugel (Zie figuur 1A). - Scheur met een tang uit de cuticula grenzen (zoals in de video) uitbreiding van het gat en het inschakelen van de release van het epitheel van de vleugel van de cuticula sac. Zodra de vleugel weefsel wordt vrijgegeven, laat het in de paraformaldehyde-oplossing om uit te voeren op 30 minuten van fixatie.
- De vaste vleugels overbrengen in een 4-welled kunststof schotel gevuld met PBST (Triton X-100 0,05%). Winkel 's nachts bij 4 ° C.
Dag 3
3. primair antilichaam-incubatie.
- Permeabilize van het weefsel aan het broeden de pop vleugels in PBST (Triton X-100 0,2%) gedurende 15 minuten met behulp van een rockende platform een zacht vloeibaar medium verkeer te vergemakkelijken.
Opmerking: Tot de montage van de monsters, moeten de stappen worden uitgevoerd met behulp van een rockende platform. - Blokkeren van de monsters met behulp van PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) gedurende 1 uur.
- Gebruik van de dezelfde buffer te verdunnen het primaire antilichaam (muis anti-Ptc, 1:100) en broeden de pop vleugels 's nachts bij 4 ° C.
Dag 4
4. secundair antilichaam-incubatie.
- Wash monsters 4 x 10 minuten, elk met PBST (Triton X-100 0,05%)
- Incubeer met secundair antilichaam (bijvoorbeeldanti-muis geconjugeerd met fluorescerende) verdund tot een geschikte concentratie in PBSTA (BSA 3%, Triton X-100 0,1%) bij kamertemperatuur in het donker, gedurende 2 uur.
Opmerking: Als er passende, gebruik 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en/of phalloidin aan de counterstain van het weefsel. Voeg deze sondes met het secundaire antilichaam, rekening houdend met de golflengte van de emissie van de fluorochromes om te voorkomen dat de overlapping van de signalen. - Wash monsters 4 x 10 minuten, elk met PBST (Triton X-100 0,05%)
5. montage
- Bereiden een voorbeelddia door het plaatsen van 4 stippen van doorzichtige nagellak op het microscoopglaasje alsof ze de hoekpunten van een vierkant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol biedt een eenvoudige methode voor het verkrijgen van pop vleugel monsters met behoud van de vertrouwde morfologie van de vleugel. Vanaf deze preparaten is het mogelijk om stapels van beelden die geprojecteerd kunnen worden als 2D- of 3D, te onderzoeken van de distributie en/of de verrijking van proteïnen bij de differentiatie van de vleugel. Een vergelijkbaar protocol kan (Zie de opmerking in 2.9) worden gebruikt voor het verzamelen van het monster van de grote pop vleugel (waarbij 50-80 pop wings) nodig voor het synthetiseren van complementaire deoxyribonucleic acid (cDNA), de sjabloon gebruikt in PCR reacties.
Figuur 1 : Egel traject gen in Drosophila pop vleugels
(A) Patched, het canonieke receptor van Hedgehog leertraject, werd gevisualiseerd op 24-30 h APF met muis anti - Ptc. kernen werden counterstained met DAPI overwegende dat door samensmelting van filamenten actine worden gevisualiseerd met behulp van een groen-fluorescerende phalloidin. Actin distributie helpt bij het lokaliseren vleugel aderen en haar relatie met gepatched expressie. Op hetzelfde moment blijkt phalloidin vlek de aanwezigheid van sommige hemocytes en dikke druppels (grote cirkels) als verontreiniging van weefsel. 20 x vergroting, anterior is. Schaal bar, 100 µm (B) waarbij aan actine (lane 1, 280 bp) en ptc (lane 2, 236 bp) werden verkregen met behulp van cDNA synthetized uit messenger RNA (mRNA) vleugel monster gegenereerd door een soortgelijke dissectie-protocol. MW, moleculair gewicht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode van dissectie beschreven in deze video kan worden gebruikt om hoge kwaliteit monsters van Drosophila pop vleugels uit verschillende ontwikkelingsstadia voor vele soorten technieken (bijvoorbeeld, immunofluorescentie, cDNA synthese voor PCR bepalingen, in vitro vleugel ontwikkeling). In termen van deze methode hebben de betrokken wetenschapper 24-30 h APF gebruikt. Echter er moet niet worden gehinderd in de essentiële stappen in dissectie van jonger of ouder Verpopping. Veranderingen kunnen worden gemaakt voor kleinere fase Verpopping hebben.
Het protocol kan worden uitgevoerd om het ontleden van een Verpopping of meerdere poppen op hetzelfde moment. Dit helpt bij het versnellen van de procedure, waardoor het makkelijker te bereiken van een groot aantal vleugels ontleed. In dit geval is er de optie voor het verwijderen van een rij van 4-5 poppen op hetzelfde moment. U kunt verwijderen van de poppen samen of als het is niet mogelijk, verdergaat met het verwijderen individueel op de dezelfde dia (zie afdeling III van de video: "Meerdere poppen dissectie"). Als u wilt verwijderen de naakte Verpopping uit de geopende zaak, is het belangrijk dat het achterste uiteinde klein genoeg is. Het is mogelijk om te verwijderen het geval volledig; Hoewel de overdracht sneller te maken zou, het verwijderen van de hele zaak is een uitdaging en er is een groter risico van beschadiging van de verpopping.
Ervaring dicteert dat een belangrijk manoeuvre te overwegen is om te vertrekken (de laatste 2 h Voltooi de ontwikkeltijd bepaald) de verpopping aangesloten op het microscoopglaasje binnen de incubator maar buiten de flacon. Deze verstrijken van de tijd helpt te drogen het geval gemakkelijker te breken. Een andere kritische stap tijdens dissectie voor immunohistochemistry, is afschilferen van de cuticle dat betrekking heeft op de vleugel epitheel, waardoor de toegang van het antilichaam aan de oppervlakte van de gehele vleugel. Deze stap moet gebeuren na de vaststelling van enkele minuten (minstens 5 min na het maken van de incisie op het scharnier punt) omdat de fixeerspray de weefsels stabiliseert en de cuticula consistentie verandert, waardoor het gemakkelijker te pellen.
Tijdens het uitvoeren van alle stappen van immunohistochemistry, zorg dat de vleugels in constante beweging zijn (schommelen platform). De beweging helpt bij het verbeteren van de uitwisseling en de penetratie van de oplossingen tijdens wasbeurten en incubations. Het is echter belangrijk om te voeren ze zachtjes het vermijden van het voorkomen van ongewenste verstoringen in de morfologie van deze kwetsbare structuur (dat wil zeggen, het is voldoende dat de trillingen van het platform iets de vloeibare middellange bevat bewegen de monsters).
Deze procedure biedt een alternatieve en complementaire aanpak voor de reeds gepubliceerde methoden voor pop vleugel dissectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken CSIC voor de financiële steun aan dit project, Mariana Di Doménico voor haar technische bijstand met confocale microscopie; naar José Leonardo Báez voor zijn manuscript correcties; naar Luciano Correa voor zijn toewijding aan de oprichting van de video; voor Natalia Rosano voor leningen van haar stem voor de video en de Bloomington Drosophila voorraad Center voor het verstrekken van de voorraden in deze studie gebruikt. De Apa1 monoklonaal anti-Ptc ontwikkeld door Isabel Guerrero was verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, afdeling biologische wetenschappen, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
