Summary
Förmågan att korrekt upptäcka avskrifter eller proteiner i Drosophila vävnader är kritisk för att studera deras överflöd och lokalisering relaterade till utvecklingsprocessen. Här är beskrivningen av en enkel procedur att dissekera Pupp vingar. Dessa vingar kan användas som prover i flera tekniker (immunohistokemi, PCR-analys, etc.).
Abstract
Påskyndar utvecklingen i Drosophila melanogaster är en idealmodell för att studera morfogenes på vävnaden nivå. Dessa bihang utvecklas från en grupp av celler som heter wing imaginal skivor bildas under fosterutvecklingen. I larval arrangerar växa imaginal skivorna, öka sitt antal celler och bildar monolayered epiteliala strukturer. Inne i det Pupp, imaginal skivorna bud ut och vika in lipidmonolager längs en linje som blir framtida marginalen av vingen. Under den här processen kommer längsgående primodia venerna ven celler på blivande dorsala och ventrala ytor av vingen. Under Pupp scenen kommunicera ränder av ven celler av varje yta för att generera trånga rör; på samma gång börjar cross-venerna sin bildning.
Med hjälp av lämpliga molekylära markörer är det möjligt att identifiera de viktigaste inslagen komponera vingen under dess utveckling. Av denna anledning är förmågan att korrekt upptäcka avskrifter eller proteiner i denna struktur avgörande för att studera deras överflöd och lokalisering relaterade till utvecklingsprocessen av vingen.
Förfarandet beskrivs här fokuserar på att manipulera Pupp vingar, att ge detaljerade instruktioner om hur att dissekera vingen under Pupp scenen. Dissektion av Pupp vävnad är svårare att utföra än deras motsvarigheter i tredje instar larver. Det är därför detta tillvägagångssätt utvecklades, för att få snabb och effektiv hög kvalitet prover. Detaljer om hur man immunostain och montera dessa wing prover, att tillåta visualisering av proteiner eller cell komponenter, finns i protokollet. Med lite expertis är det möjligt att samla in 8-10 hög kvalitet Pupp vingar i en kort tid.
Introduction
Drosophila vingar är utvecklade från wing imaginal skivorna. Primordial av skivorna wing är gallrat under den embryonala utvecklingen som små grupper av 20-30 imaginal celler som invaginate från embryonala epitel. Medan larven växer till den tredje etappen instar, sker Mitos i imaginal cellerna vid särskilda karakteristiska gånger höja dess nummer (cirka 50000 celler) och bildar vingen skiva1,2,3, 4. Som cellerna föröka, mode de en tubulär epitel, vilket resulterade i en egen fällbara compact spiral. Under förpuppningen, skiva epitelet teleskop ut till form i två lager wing och längsgående venerna start som luckor mellan dem, som inträffar två gånger under vingen utvecklingsmässiga5,6.
Arrangemanget av venerna alltid har ett identiskt mönster; möjligheten att enkelt identifiera varje ändring inom vener bildandet gör mutationer extremt synliga (t.ex. saknas eller extra vener, förändringar i ven positioner, etc.). Intressant, är fenotyp variationerna oftast bevis på mutationer i kända eller nya komponenter av signalering vägar som är relevanta för wing utveckling. En av de vägar som spelar en roll i att bestämma position och underhålla ven och intervein territorier är igelkott (Hh) väg6,7,8.
Med tanke på betydelsen av Pupp vingen som modellsystem, blir det viktigt att få bra kvalitet prover att arbeta med. Tidigare har forskare som har publicerade protokoll att dissekera Drosophila vingar inte gett en lämplig guide att uppnå fungerande prover. Utan ledning av en forskare kan inte en tydligt visualisera processen. I dessa alternativa dissekera synsätt är puppan delad i två, separera vingen från omgivande vävnad och tvättas upprepade gånger för att ta bort skräpet. Detta slags tillvägagångssätt påståenden att lämna vingen gratis förorenar men på grund av tidigare erfarenheter processen är långsammare och det finns en större chans att kompromissa strukturen för den sköra vingar9.
Proceduren som beskrivs här utvecklades av efterfrågan för att hitta en snabb och effektiv metod för att erhålla Pupp wing prover lämpliga att upptäcka specifika proteiner eller avskrifter med immunodetection protokoll eller polymeras-kedjereaktion (PCR) analyser. För att illustrera detta, uttryck och lokalisering av Patched (Ptc eller kanoniska receptorn av Hh-vägen) upptäcks i Pupp wing prover, som tillhandahåller ett protokoll som innehåller relevanta detaljer att framgångsrikt genomföra den kompletta förfarandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. insamling och odlingsskålar puppor.
- Ta bort 0 h efter puparium bildandet (APF) eller prepupae med en våt pensel från odlade injektionsflaskor och placera dem i nya flaskor till nästan fullständig utvecklingsperioden (se 2.1 och 2.2).
Obs: En frisk befolkning av flugor bör bibehållas med hjälp av standardprotokoll för odling. Efter tre eller fyra dagar där äggen läggs, kan vuxna avlägsnas från injektionsflaskor så att en optimal utveckling av individerna. De upprätthålls vid en konstant temperatur tills tredje instar larverna initiera förpuppningen. Larval/Pupp övergången markeras av bildandet av den prepupa som anses vara den 0 h APF. Prepupa är en orörlig vit larv som har en avlång, rund form med utskjutande främre trakeer.
Dag 2
2. överföring, dissektion och fixering.
- Överföra de puppor (2 h innan tiden är komplett) med en pensel, till objektglas med dubbelhäftande tejp följt den. Placera puppor att bilda en rad med dorsala sidor upp och cefaliska slutar vänd åt samma håll.
- Återgå till objektglas till konstant temperatur och låt de puppor att slutföra lämpliga utvecklande tiden (dvs 24-30 h APF).
Obs: Objektglas med dubbelsidig tejp kommer vara en övergående dissektion plattform att ta bort Pupp fallet (se nedan). Tidsfördröjning på objektglas (utanför injektionsflaskan) hjälper till att torka Pupp fallet vilket gör det lätt brytbar med pincett. - Ta bort operculum från Pupp fallet med hjälp av tången.
- Bryta fallet med pincett (som visas i videon) att göra en linje längs sidan av puppan till stjärtfenan slutet av den. Med lämplig belysning är det möjligt att upptäcka interna form av puppan gör uppenbart ett utrymme ovanför gångjärnet av Pupp vingen. Detta utrymme fungerar som en guide att utföra öppningen utan att skada puppan.
- Ta bort delar av målet, plocka upp av öppnade gränsen och transporterar dem till den motsatta sidan där den dubbelhäftande tejpen kommer att hålla dem. I slutet av dissektion blir av puppor nästan ”naken”, bara en liten bit av ärendet kommer att täcka den bakre spetsen.
Obs: Syftet för att lämna en liten mängd fall på den övre kaudala delen är att säkerställa en smidig övergång från fodralet på bilden med den dubbelhäftande tejpen. Resonemanget bakom denna åtgärd är eftersom om du tar bort för mycket av fallet du kraftigt riskerar att skada puppa. Däremot om du tar bort för lite, kommer puppan enkelt inte gratis i det enskilda fallet. - Tryck ner (med tången) resten av fallet. Denna rörelse kommer att höja den främre änden av puppan, vilket möjliggör både huvudet och bröstkorgen i en förmånlig ställning att följa och att överföras i efterföljande steg.
- Ta en ny bild med dubbelhäftande tejp och Invertera det på den puppa eller puppor raden. Vi rekommederar detta synsätt genom att observera rörelser med hjälp av stereomikroskopet att förhindra brott på puppor.
- Tryck på något för att göra de puppor stick på band och försiktigt glida bilden för att ta bort puppor från resten av fallen. Invertera objektglas: puppor kommer att fastna på ryggsidan i nivå med deras huvud / thorax område.
- Täcka alla de nakna puppor med 4% PARAFORMALDEHYD och vänta 10 min. Vår erfarenhet hjälper detta tidsförlopp med fixeringsvätskan ändrar du av nagelband gör det fast, mindre klibbiga och lätt att hantera.
Obs: För att utföra ribonukleinsyra (RNA) utvinning, suppleant PARAFORMALDEHYD för fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med RNase gratis vatten och ta bort Pupp vingarna att göra ett snitt (med hjälp av sax) nära gångjärn peka av varje bihang. Använda pincett, överföra Pupp vingen till en mikrocentrifug rör med 1 mL guanidinium kaliumtiocyanat och fenol reagens. Efter att samla sammanlagt 50-80 vingar, lagra mikrocentrifug röret vid-80 ° C tills utför RNA extraktion10,11. - Göra ett litet snitt på gångjärnet regionen av vingen eller nära den. Låt fixeringsvätskan att nå wing epitel. Med pipett (p200) spola fixativ över vingen. När spolning Ersätt fixera orena med nya. Efter spolning, kom vinge fixativ för 5 min.
Obs: Även om denna manöver hjälper till att rensa bort flesta av kontaminerande vävnad, några hemocytes och fett droppar kan fortfarande instängd mellan rygg- och ventrala epiteliala skikten av vingen (se figur 1A). - Slita med pincett från nagelbanden gränser (som visas i videon) utvidga hålet och möjliggör frisläppandet av wing epitel från nagelbanden sac. När vingen vävnaden släpps, lämna den i PARAFORMALDEHYD lösningen att slutföra 30 min av fixering.
- Överföra fast vingarna till en 4-vällde plast skål fylld med PBST (Triton x-100 0,05%). Förvara över natten vid 4 ° C.
Dag 3
3. primär antikropp inkubation.
- Permeabilize vävnaden ruvning Pupp vingarna i PBST (Triton x-100 0,2%) för 15 min med en gungande plattform för att underlätta en mild flytande medium rörelse.
Obs: Till montering av proverna, bör stegen utföras med en gungande plattform. - Blockera de prover som använder PBSTA (BSA 3%, Triton x-100 0,1%) för 1 h.
- Använd samma bufferten att späda ut den primär antikroppen (musen anti-Ptc, 1: 100) och inkubera Pupp vingar över natten vid 4 ° C.
Dag 4
4. sekundär antikropp inkubation.
- Tvätta prover 4 x 10 min varje med PBST (Triton x-100 0,05%)
- Inkubera med sekundär antikropp (t.ex., antimus konjugerat till fluorokrom) utspätt till lämplig koncentration i PBSTA (BSA 3%, Triton x-100 0,1%) vid rumstemperatur i mörkret, för 2 h.
Obs: Om det är lämpligt, använda 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) eller phalloidin till counterstain vävnad. Lägg till dessa sonder med sekundära antikroppen med hänsyn till utsläpp våglängden av de fluorokromer att förhindra överlappning av signaler. - Tvätta prover 4 x 10 min varje med PBST (Triton x-100 0,05%)
5. montering
- Förbereda en prov bild genom att placera 4 prickar av transparent nagellack på objektglas som om de vore hörnen i en kvadrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet erbjuder en enkel metod för att erhålla Pupp wing prover som behåller den välbekanta morfologin av vingen. Från dessa preparat är det möjligt att få högar av bilder som kan projiceras som 2-D eller 3-D, att undersöka distribution eller berikning av proteiner under differentieringen av vingen. Ett liknande protokoll kan (se anmärkning i 2,9) användas för att samla stora Pupp wing provet (som omfattar 50-80 Pupp wings) nödvändiga för att synthesize kompletterande deoxiribonukleinsyra (cDNA), den mall som används i PCR-reaktioner.
Figur 1 : Hedgehog väg gen i Drosophila Pupp vingar
(A) lappat, kanoniska receptorn igelkott utbildningsavsnitt, var visualiserat på 24-30 h APF använder musen anti - Ptc. kärnor var counterstained med DAPI medan aktin filament visualiseras med hjälp av en grön fluorescerande phalloidin. Aktin distribution hjälper till att lokalisera wing vener och dess förhållande med lappat uttryck. Samtidigt avslöjar phalloidin fläcken förekomsten av vissa hemocytes och fett droppar (stora cirklar) som kontaminerande vävnad. 20 x förstoring, främre är upp. Skala bar, 100 µm (B) amplikoner till aktin (lane 1, 280 bp) och ptc (lane 2, 236 bp) erhölls med cDNA synthetized från budbärar-RNA (mRNA) wing prov genereras av ett liknande dissektion protokoll. MW, molekylvikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden av dissektion som beskrivs i denna video kan användas för att förbereda hög kvalitet prover Drosophila Pupp vingar från olika utvecklingsstadier för många typer av tekniker (t.ex. immunofluorescens, cDNA syntes till PCR-analyser, in vitro- wing utveckling). När det gäller denna metod har forskare inblandade använt 24-30 h APF. Men det bör finnas något hinder inom grundläggande stegen i dissekering av yngre eller äldre puppa. Ändringar kan behöva göras för att tillgodose mindre scenen puppa.
Protokollet kan utföras för att dissekera en puppa eller flera puppor på samma gång. Detta hjälper till att påskynda förfarandet, vilket gör det lättare att nå ett stort antal vingar dissekeras. I detta fall finns det möjlighet att ta bort en rad 4-5 puppor på samma gång. Du kan ta bort puppor tillsammans eller om det inte är möjligt, fortsätta att ta bort individuellt på samma bild (se avsnitt III i videon: ”flera puppor dissektion”). Ta bort den nakna puppan från öppnade fallet, är det viktigt att den bakre spetsen är tillräckligt små. Det är möjligt att ta bort fallet helt; även om det skulle göra överföringen snabbare, avlägsnande av hela ärendet är utmanande och det finns en större risk att skada puppa.
Erfarenhet dikterar att en viktig manöver att överväga är att lämna (de sista 2 h för att slutföra utsatt utvecklingstid) puppa bifogas objektglas inuti inkubatorn men utanför flaskan. Detta tidsförlopp hjälper till att torka det fallet gör det lättare att bryta. En annan avgörande steg under dissektion för immunohistokemi, är att skala bort nagelband som täcker wing epitelet, därmed bevilja åtkomst av antikropp till hela wing ytan. Detta steg bör göras efter fastställande för flera minuter (minst 5 min efter att snittet på gångjärn peka) eftersom fixeringsvätskan stabiliserar vävnader och ändrar nagelband konsekvens, vilket gör det lättare att skala.
När du utför alla immunohistokemi steg, vara säker på att vingarna är i ständig rörelse (gunga plattform). Rörelse hjälper till att förbättra interchange och penetration av lösningar under tvättar och inkubationer. Det är dock viktigt att utföra dem varsamt undvika förekomsten av oönskade snedvridningar i morfologi av denna sköra struktur (dvs. det räcker att svängningarna av plattformen något flytta den flytande medium som innehåller proverna).
Detta förfarande ger en alternativa och kompletterande angreppssätt för att de redan publicerade metoderna för Pupp wing dissektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka CSIC för det finansiella stödet till detta projekt, att Mariana Di Doménico för hennes tekniskt bistånd med konfokalmikroskopi; att José Leonardo Báez för hans manuskript korrigeringar; att Luciano Correa för hans hängivenhet till skapandet av video; att Natalia Rosano för utlåning hennes röst för video och Bloomington Drosophila lager Center för att tillhandahålla de lager som används i denna studie. Den Apa1 monoklonala anti-Ptc utvecklat av Isabel Guerrero var erhållits från den utvecklande studier Hybridomteknik Bank (DSHB) under överinseende av NICHD och underhålls av The University of Iowa, Institutionen för biologiska vetenskaper, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
