Summary
La capacité de détecter avec précision les relevés de notes ou de protéines dans les tissus de la drosophile est critique pour étudier leur abondance et leur localisation liées au processus de développement. Voici la description d’une procédure simple pour disséquer les ailes pupes. Ces ailes peuvent être utilisées comme échantillons dans plusieurs techniques (immunohistochimie, PCR assay, etc.).
Abstract
Développement d’aile chez Drosophila melanogaster est un modèle idéal pour l’étude de la morphogénèse au niveau des tissus. Ces appendices se développent à partir un groupe de cellules nommées disques imaginaux aile formées pendant le développement embryonnaire. Dans les stades larvaires les disques imaginaux croître, augmentant son nombre de cellules et formant des structures épithéliales examen. À l’intérieur de la pupe, les disques imaginaux IUN dehors et incorporer des bicouches le long d’une ligne qui devient la future marge de l’aile. Au cours de ce processus, les veines longitudinales primodia proviennent de cellules sur la surface dorsale et ventrale prospective de l’aile. Durant le stade pupal les rayures des cellules de la veine de chaque surface communiquent afin de générer des tubes serrés ; dans le même temps, les croix-veines commencent leur formation.
Avec l’aide de marqueurs moléculaires appropriées, il est possible d’identifier les principaux éléments composant l’aile durant son développement. Pour cette raison, la capacité de détecter avec précision les transcriptions ou protéines dans cette structure est essentielle pour l’étude de leur abondance et la localisation liées au processus de développement de l’aile.
La procédure décrite ici se concentre sur la manipulation des ailes pupes, donnant des instructions détaillées sur la manière de disséquer l’aile pendant le stade pupal. La dissection des tissus nymphal est plus difficile à réaliser que leurs homologues au troisième stade larvaire. C’est pourquoi cette approche a été développée, pour prélever des échantillons de qualité rapide et efficace. Comment réagissent et monter ces échantillons d’aile, afin de permettre la visualisation des protéines ou des composants de la cellule, sont indiquées dans le protocole. Avec peu d’expertise, il est possible de collecter des ailes pupal de 8-10 de haute qualité dans un court laps de temps.
Introduction
Ailes de drosophile sont élaborés selon les disques imaginaux de l’aile. Primordial de ces disques alaires sont mis de côté durant le développement embryonnaire en petits groupes de 20 à 30 cellules imaginal qui invaginent de l’épithélium embryonnaire. Tandis que la larve se développe à la troisième phase de stade larvaire, la mitose se produit dans les cellules imaginal à des moments précis caractéristiques augmenter ses effectifs (environ 50000 cellules) et formant l’aile disque1,2,3, 4. Comme les cellules prolifèrent, ils mode un épithélium tubulaire, résultant en une spirale automatique pliage compacte. Au cours de la nymphose, l’épithélium disque télescopes sur aile forme les deux couches et les nervures longitudinales commencent comme lacunes entre eux, qui se produit deux fois au cours de l’aile du développement5,6.
L’arrangement des veines toujours présente un motif identique ; la capacité de facilement identifier chaque altération dans la formation de veines rend extrêmement visible des mutations (p. ex. manquant ou défectueux veines, changements dans la veine des postes, etc..). Fait intéressant, les variations de phénotype sont généralement la preuve des mutations dans les éléments connus ou nouveaux de la signalisation des voies qui sont pertinentes pour le développement de l’aile. Une des voies qui joue un rôle dans la détermination de la position et de maintenir la veine et territoires intervein est le Hedgehog (Hh) voie6,7,8.
Compte tenu de l’importance de l’aile de nymphe comme système modèle, il sera important d’obtenir des échantillons de bonne qualité pour travailler avec. Dans le passé, les scientifiques qui ont publié les protocoles pour disséquer Drosophila ailes n’ont pas donné un guide approprié pour atteindre échantillons réalisables. Sans l’aide d’un chercheur, on ne peut pas visualiser clairement le processus. Dans ces autres approches dissection la pupe est scindée en deux, séparant l’aile du tissu environnant et lavée à plusieurs reprises pour enlever les débris. Ce genre d’approche des revendications de quitter l’aile libre de contaminants, mais en raison de l’expérience précédente, le processus est lent et il n’y a plus de chances de compromettre la structure des ailes fragiles9.
La procédure décrite ici a été développée par l’exigence de trouver une méthode rapide et efficace d’obtenir des échantillons de pupes aile adaptés détecter les protéines spécifiques ou relevés de notes à l’aide de protocoles immunodétection ou polymerase chain reaction (PCR) essais. Pour illustrer ceci, l’expression et la localisation de Patched (Ptc ou le récepteur canonique de la voie de Hh) est détecté dans des échantillons d’ailes pupal, fournir un protocole qui inclut des détails pertinents pour mener à bien la complète mode opératoire.
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Protocol
Jour 1
1. collecte et mise en culture de pupes.
- Enlever 0 h après formation puparium (APF) ou prénymphes avec un pinceau humide de flacons de culture et placez-les dans des flacons de nouveau à presque totale de la période de développement (voir 2.1 et 2.2).
Remarque : Une population saine de mouches devrait être maintenue à l’aide de protocoles standard de la culture. Après trois ou quatre jours où les oeufs sont pondus, les adultes peuvent être supprimés de flacons pour permettre un développement optimal des individus. Ils sont maintenus à une température constante, jusqu'à ce que le troisième stade larvaire initier la pupaison. La larves/nymphale transition est marquée par la formation de la prépupale a examiné la 0 h CSA. Le prépupale est une larve blanche immobile qui a une forme oblongue, forme avec stigmates antérieurs en saillie ronde.
Jour 2
2. transfert, dissection et fixation.
- Transférer les pupes (2 h avant le temps de développement complets) avec un pinceau, à la lame de microscope avec du ruban adhésif double-face respectée. Positionner les chrysalides pour former qu'une ligne avec côtés dorsales haut et céphaliques termine dans la même direction.
- Retourner la lame de microscope à température constante et permettre la pupe compléter la durée du développement appropriée (c.-à-d. 24-30 h CSA).
Remarque : La lame de microscope avec du Scotch double-face sera une plateforme de dissection transitoire pour enlever la pupe (voir ci-dessous). Le laps de temps sur la lame de microscope (à l’extérieur de la cuvette) contribue à sécher la pupe rendant facilement cassable avec une pince. - Retirer l’opercule de la pupe à l’aide de pinces.
- Casser le boîtier avec une pince (comme montré dans la vidéo) faisant une ligne le long du côté de la pupe à l’extrémité caudale de celui-ci. Avec l’éclairage approprié, il est possible de détecter la forme intérieure de la pupe rendre évident un espace juste au-dessus de la charnière de l’aile de pupe. Cet espace sert de guide pour effectuer l’ouverture sans endommager la chrysalide.
- Supprimer des parties de l’affaire, les ramasser par la frontière ouverte et de leur transport vers le côté opposé où le ruban double-face tiendra à eux. À la fin de la dissection, la pupe sera presque « nue », que seulement un petit morceau de l’affaire recouvrira la pointe postérieure.
Remarque : Le but de laisser une petite quantité de cas sur l’extrémité caudale supérieure doit assurer une libération lisse de l’affaire sur la lame avec du Scotch double-face. Raisonnement qui sous-tend cette action est parce que si vous retirez trop de l’affaire, vous risquez fortement endommager la chrysalide. En revanche si vous retirez trop peu, la nymphe facilement ne viendra pas libre de l’affaire. - Poussez vers le bas (avec une pince) le reste de l’affaire. Ce mouvement déclenche l’extrémité antérieure de la pupe, permettant à la tête et le thorax de rester dans une position préférentielle de respecter et d’être transférés à l’étape ultérieure.
- Prenez une nouvelle diapositive avec du ruban adhésif double-face et inverser sur la chrysalide ou la ligne de pupes. Nous recommandons de procéder à cette démarche en observant les mouvements à l’aide de la stéréomicroscope afin d’éviter la rupture de la pupe.
- Enfoncer légèrement pour faire les nymphes s’en tenir à la bande et glissent doucement la lame afin d’éliminer les nymphes du reste des cas. Inverser la lame de microscope : la pupe sera collée sur la face dorsale au niveau de la tête / zone du thorax.
- Couvrir tous les nymphes nues avec 4 % de paraformaldéhyde et attendre 10 min. Dans notre expérience, ce laps de temps avec le fixateur contribue à changer la consistance de la cuticule, ce qui en fait plus ferme, moins collante et facile à manipuler.
Remarque : Pour effectuer l’extraction de l’acide ribonucléique (ARN), paraformaldéhyde substitut, pour une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), faite avec de la RNase sans eau et retirer les ailes pupes, faire une coupe (à l’aide de ciseaux) près du point d’articulation de chaque appendice. À l’aide de pinces, transférer l’aile pupe dans un tube de microcentrifuge avec 1 mL de réactif de guanidinium thiocyanate et phénol. Après avoir recueilli un total de 50-80 ailes, conserver le tube de microcentrifuge à-80 ° C jusqu'à l’exécutant le RNA extraction10,11. - Faire une petite incision dans la région de l’articulation de l’aile ou à proximité. Permettre le fixateur atteindre l’épithélium de l’aile. À l’aide d’une pipette (p200) RAS fixateur au-dessus de l’aile. Lors du rinçage de remplacer les contaminés se focaliser avec les nouveaux. Après le rinçage, n’aile fixateur pendant 5 min.
Remarque : Bien que cette manœuvre permet de dégager la majorité du tissu contaminante, quelques hémocytes et gouttelettes graisseuses peuvent rester pris au piège entre les couches épithéliales ventrales et dorsales de l’aile (voir Figure 1 a). - Arracher avec une pince des frontières de la cuticule (comme montré dans la vidéo) élargir le trou et en permettant la libération de l’épithélium de l’aile par le sac de la cuticule. Une fois le tissu de l’aile est libéré, laissez-le dans la solution de paraformaldéhyde à toutes les 30 min de fixation.
- Transférer les ailes fixes à un plat en plastique 4-sourdait rempli de PBST (Triton X-100 0,05 %). Magasin pendant la nuit à 4 ° C.
Jour 3
3. l’incubation des anticorps primaire.
- Permeabilize le tissu en incubant les ailes pupes dans du PBST (Triton X-100 0,2 %) pendant 15 min en utilisant une plate-forme bascule pour faciliter une circulation moyenne liquide douce.
Remarque : Jusqu’au montage des échantillons, les étapes devraient être effectuées à l’aide d’une plateforme à bascule. - Bloquer les échantillons à l’aide de PBSTA (BSA 3 %, Triton X-100 0,1 %) pendant 1 h.
- Utiliser le même tampon pour diluer l’anticorps primaire (souris anti-Ptc, 1/100) et incuber les ailes pupes durant la nuit à 4 ° C.
Jour 4
4 l’incubation des anticorps secondaire.
- Lavage des échantillons 4 x 10 min chacun avec PBST (Triton X-100 0,05 %)
- Incubation avec l’anticorps secondaire (p. ex., anti-souris conjugués au fluorochrome) diluée à une concentration appropriée dans PBSTA (BSA 3 %, Triton X-100 0,1 %) dans l’obscurité, pendant 2 h à température ambiante.
Remarque : Si il y a lieu, utiliser 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et/ou la phalloïdine pour contre-coloration le tissu. Ajouter ces sondes avec l’anticorps secondaire compte tenu de la longueur d’onde d’émission les fluorochromes afin d’éviter le chevauchement des signaux. - Lavage des échantillons 4 x 10 min chacun avec PBST (Triton X-100 0,05 %)
5. montage
- Préparer une lame d’échantillon en plaçant 4 points de vernis à ongles transparent sur la lame de microscope, comme s’ils étaient les sommets d’un carré.
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Representative Results
Le protocole propose une méthode simple pour obtenir des échantillons de pupes aile qui conservent la morphologie familier de l’aile. De ces préparations, il est possible d’obtenir des piles d’images qui pourraient être projetés en 2D ou en 3D, pour étudier la distribution ou l’enrichissement des protéines au cours de la différenciation de l’aile. Un protocole similaire (voir la note à 2.9) peut être utilisé pour recueillir l’échantillon de grande aile pupe (ailes de pupes de 50-80 impliquant) nécessaire pour synthétiser l’acide désoxyribonucléique complémentaire (ADNc), le modèle utilisé dans les réactions de PCR.
Figure 1 : Gène de voie de hérisson dans Drosophila ailes pupes
(A) patché, le récepteur canonique de voie de hérisson, a été visualisée à 24-30 h CSA à l’aide de souris anti - Ptc. noyaux étaient Eosine au DAPI, tandis que les filaments d’actine sont visualisées à l’aide d’une vert fluorescent phalloïdine. Distribution d’actine permet de localiser les veines de l’aile et sa relation avec l’expression patché . Dans le même temps, la phalloïdine tache révèle la présence de quelques hémocytes et gouttelettes graisseuses (grands cercles) comme la contamination des tissus. grossissement de 20 x, antérieur est en place. Balance bar, 100 µm (B) Amplicons d’actine (lane 1, 280 bp) et ptc (piste 2, 236 bp) ont été obtenus à l’aide de cDNA synthétisé de l’ARN messager (ARNm) aile échantillon généré par un protocole de dissection similaire. MW, poids moléculaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode de dissection décrite dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer des échantillons de haute qualité des ailes pupes drosophile de stades de développement différents pour de nombreux types de techniques (p. ex., immunofluorescence, synthèse de cDNA de tests de PCR, in vitro développement d’aile). En ce qui concerne cette méthode, les scientifiques impliqués ont utilisé 24-30 h CSA. Il ne faut cependant aucun obstacle dans les étapes essentielles dans la dissection de la pupe plus jeune ou plus âgé. Changements peuvent avoir à être faits pour accommoder plus petite nymphe étape.
Le protocole pourrait être effectué pour disséquer une nymphe ou chrysalide plusieurs en même temps. Cela permet d’accélérer la procédure, ce qui en fait plus facile d’atteindre un grand nombre d’ailes disséqué. Dans ce cas, il y a la possibilité de supprimer une rangée de 4-5 nymphes en même temps. Vous pouvez supprimer les pupes ensemble ou s’il n’est pas possible, continuer à supprimer individuellement sur la même lame (voir la section III de la vidéo : « Dissection de pupes Multiple »). Pour supprimer la nymphe nue de l’affaire ouverte, il est important que l’extrémité postérieure est assez petite. Il est possible de retirer l’affaire entièrement ; Bien qu’il rendrait le transfert plus rapide, la suppression de toute l’affaire est difficile et il y a un plus grand risque d’endommager la chrysalide.
L’expérience veut qu’une manœuvre importante à considérer est de laisser (les dernier 2 h pour terminer le temps de développement prévu) la nymphe attachée à la lame de microscope à l’intérieur de l’incubateur, mais à l’extérieur de la cuvette. Ce laps de temps permet de sécher le cas rend plus facile à briser. Une autre étape critique au cours de la dissection pour l’immunohistochimie, doit décoller de la cuticule qui recouvre l’épithélium de l’aile, permettant ainsi l’accès de l’anticorps à la surface de l’aile entière. Cette étape doit se faire après la fixation pendant plusieurs minutes (au moins 5 min après avoir fait l’incision au point charnière) parce que le fixateur stabilise les tissus et modifie la consistance de la cuticule, rendant plus facile à éplucher.
Lors de l’exécution de toutes les étapes de l’immunohistochimie, veillez à ce que les ailes sont en perpétuel mouvement (plateforme à bascule). Le mouvement permet d’améliorer l’échange et la pénétration des solutions lors des lavages et des incubations. Néanmoins, il est important de les effectuer doucement en évitant l’apparition de distorsions indésirables dans la morphologie de cette structure fragile (c.-à-d., il suffit que les oscillations de la plate-forme de déplacent légèrement le liquide contenant de la moyenne les échantillons).
Cette procédure fournit une approche alternative et complémentaire aux méthodes déjà publiés pour la dissection des ailes pupal.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier la SCCI pour le soutien financier accordé à ce projet, Mariana Di Doménico pour son aide technique à la microscopie confocale ; pour José Leonardo Báez pour ses corrections du manuscrit ; à Luciano Correa pour son dévouement à la création de la vidéo ; pour Natalia Rosano pour prêter sa voix pour la vidéo et la drosophile Bloomington Stock Center pour fournir les stocks utilisés dans cette étude. Le Apa1 anticorps monoclonal anti-Ptc développé par Isabel Guerrero a été obtenu de la Banque du développement de hybridome études (DSHB) sous les auspices de la NICHD et maintenu par le Department of Biological Sciences, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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