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Neuroscience

Um protocolo para medição de reatividade de Cue em um modelo do rato do transtorno de uso de cocaína

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/55864
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1,6, 1,6, 1,6, 1,6, 1,3,4
1Center for Addiction Research, University of Texas Medical Branch, 2Institute for Translational Sciences, University of Texas Medical Branch, 3Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, University of Texas Medical Branch, 4Department of Neurology, University of Texas Medical Branch, 5Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 6Department of Pharmacology and Toxicology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Reatividade de sinalização é conceituada como sensibilidade para pistas ligadas com experiências de drogas que contribuem a ânsia e recaída em humanos abstinentes. Reatividade de sinalização é modelada em ratos por medição orientação atenção para pistas de drogas associadas que resulta em comportamento de abordagem repetido em um teste de reactividade deixa seguir auto-administração e forçado a abstinência.

Abstract

Transtorno de uso de cocaína (CUD) segue uma trajetória de auto-administração repetitiva durante o qual anteriormente estímulos neutros ganham valor de incentivo. Reatividade de sinalização, a sensibilidade para as sugestões anteriormente ligados com a experiência de drogas, desempenha um papel proeminente no desejo humano durante a abstinência. Sugestão de reatividade pode ser avaliada como a orientação da atenção para pistas associadas a drogas que é mensurável como comportamento de abordagem repetido nos estudos pré-clínicos e humanos. Neste documento descreve uma avaliação da reatividade de sinalização em ratos treinados para auto-administrar cocaína. Auto-administração de cocaína está emparelhada com a apresentação de sinais discretos que atuam como reinforcers condicionados (i.e., casa, estímulo luz de sons de bomba de infusão). Após um período de abstinência, prensas de alavanca no contexto de auto-administração de cocaína acompanhado as pistas discretas previamente emparelhadas com infusão de cocaína são medidas como reatividade de sinalização. Este modelo é útil para explorar mecanismos neurobiológicos subjacentes deixa processos de reatividade, bem como para avaliar farmacoterapias para suprimir a reatividade de sinalização e, portanto, modificar a vulnerabilidade de recaída. Vantagens do modelo incluem sua relevância translacional e seu rosto e validades preditivas. A principal limitação do modelo é que a tarefa de reatividade de sinalização só pode ser realizada com pouca frequência e só deve ser usada em curta duração (ex., 1 hora), caso contrário ratos começará a extinguir o emparelhamento do sinais discretos com o estímulo de cocaína. O modelo é extensível a qualquer estímulo positivamente reforço emparelhado com sinais discretos; Embora particularmente aplicável às drogas de abuso, este modelo pode segurar aplicações futuras nos campos tais como a obesidade, onde alimentos palatáveis recompensas podem atuar como reforçar positivamente a estímulos.

Introduction

Transtorno de uso de cocaína (CUD) segue uma trajetória de auto-administração repetitiva durante o qual anteriormente estímulos neutros ganham incentivo valor1. Reatividade de sinalização é a sensibilidade para as sugestões anteriormente ligados com a experiência de drogas, e que desempenha um papel proeminente no desejo humano2,3,4,5. O risco de progressão para CUD, bem como recaída durante a abstinência, é pensado para ser mais elevado para os indivíduos que expressam a alta sensibilidade a drogas associadas pistas6,7. Ambos os contextos ambientais (por exemplo, pessoas, prédios, gêneros musicais) e discretos associada a drogas estímulos (por exemplo, parafernália) tornar-se associado com a recompensa de cocaína; a exposição a estes tacos pode provocar alterações na fisiologia periférica (por exemplo, frequência cardíaca, temperatura da pele e resistência da pele), plasticidade cerebral e cérebro conectividade funcional2,8,9 ,10. Em outras palavras, re-exposição à cocaína associada sugestões ativa o sistema límbico ritmicidade circuitos para evocar condicionadas respostas fisiológicas e subjetivas que impulsionam repetido abordagem (droga-procurando) comportamento11,12 ,13,14,15.

Reatividade de sinalização medida com cérebro funcional, análise de imagem é preditiva de vulnerabilidade de recaída em indivíduos com RUMINA16. Medições de reatividade de sinalização em modelos de roedores servem como uma medida de substituto para o risco de recaída e pode ser explorado para estudos translacionais. Assim, uma farmacoterapia que diminui a reatividade de sinalização em roedores pode ser transportadas para a frente como um tratamento de prevenção de recaída em testes clínicos em humanos. Modelos pré-clínicos com o necessário mérito translacional e validade preditiva são especialmente importantes, uma vez que existem atualmente não farmacoterapias aprovado pela FDA para CUD17.

O procedimento de auto-administração roedor é o padrão-ouro, modelo de translação com validade preditiva para humano drogas18 e criticamente importante para a compreensão molecular e fisiológicas processos CUD subjacente. Resposta - entregaindependente dos resultados de cocaína em distintos efeitos comportamentais, neuroquímicos e moleculares em relação à resposta - exposiçãodependentes de cocaína; ex., entrega de cocaína resposta -independente evoca significativamente maior mortalidade19. Além disso, as consequências neuroquímicas da abstinência de resposta -dependentes cocaína auto-administração são distintas daqueles desencadeada pela abstinência de resposta -independente cocaína entrega20, 21. assim, modelos CUD baseados na resposta - entregadependentes de cocaína são modelos de translação superiores ao avaliar a reatividade de sinalização e associado a mecanismos de ação.

O protocolo descrito abaixo, cocaína é entregue por via intravenosa através de um cateter permanente intra na jugular. No entanto, foram desenvolvidos métodos alternativos para auto-administrar drogas via oral e inalação de rotas. Importante, roedores controlam a entrega da droga, humanos análogos, através de respostas operante. Portanto, há alta concordância entre drogas auto administradas por roedores e humanos22. O procedimento de auto-administração de drogas pré-clínicos abaixo emprega alavanca pressionando, reforçado pela entrega da droga, para motivar as taxas de resposta mais elevadas do que o controle do veículo. Comportamento de busca de drogas é treinado por emparelhamento pistas originalmente "neutras" (por exemplo, uma luz de estímulo ou Tom e o ambiente contextual em cocaína auto-administração ocorre) com infusão de cocaína; Estes tacos tornar-se condicionado reinforcers (para revisão: Cunningham & Anastasio, 2014,23). Posterior re-exposição à cocaína associada pistas desencadeia comportamento droga-procurando em roedores (i.e., tenta entregar cocaína através de pressionando a alavanca anteriormente-ativo), bem como a ânsia e a recaída no CUD assuntos24, 25 , 26 , 27.

Normalmente, os estudos pré-clínicos de roedores de comportamento droga-procurando seguir a auto-administração de cocaína utilizam reintegração de formação e/ou drogas de extinção conduzida dentro do ambiente associada a drogas28,29, 30 , 31 , 32. pressiona a alavanca de ativos anteriormente, na ausência de entrega de drogas e/ou sugestão, normalmente constituem a medida de reintegração após extinção33,34,35. Pelo contrário, comportamento de busca de drogas deixa reatividade é avaliada seguinte abstinência forçada sem prévia extinção formação28,36,37,38,39 .

Desfechos e variáveis experimentais foram cuidadosamente escolhidas e validadas para dissecar os diferentes aspectos da neurobiologia do comportamento de busca de drogas e recaída-como, e é bem estabelecido que o neuroadaptations diferentes entre modelos com e sem extinção formação 40,41,42,43. Além disso, numa perspectiva de translação, formação de roedores extinção não é espelhada em ambientes clínicos para CUD desde as sugestões relacionadas com a droga incluem Estados de humor, lugares e pessoas,44; a exclusiva combinação destes tacos são provavelmente não está disponível em um ambiente clínico45,46,47. Assim, o modelo de roedor aqui descrito atua como um melhor paralelo à condição humana do que muitos dos modelos atualmente disponíveis.

A seguir descreve um treinamento de auto-administração de cocaína validado, abstinência forçada e reatividade de sinalização teste protocolo para ratos. Brevemente, ratos são implantados com cateteres intra jugular, treinados para auto-administrar cocaína ou solução salina via imprensa alavanca 'ativo', e a recepção do estímulo cocaína ou soro fisiológico é emparelhada com discretos sinais de luz e som que servem como reinforcers condicionados. Após 14 dias de auto-administração de cocaína, ratos são submetidos a 30 dias de abstinência forçada e um teste de reactividade subsequentes 60-min deixa no qual alavanca é medida urgente. O teste de reatividade de sinalização é uma medida de substituto para a vulnerabilidade de recaída de cocaína em humanos.

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Protocol

Todas as manipulações de animais são realizadas de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (2011) e com a aprovação do Comité de uso e cuidado institucional do Animal.

1. os animais

  1. ACCLIMATE ratos Sprague Dawley masculinos aproximadamente 8-9 semanas de idade (250-260 g) durante um período mínimo de sete dias em uma sala de colônia, mantida em 21-23 ° C e 45-50% de umidade em um ciclo claro-escuro de 12 h (luzes em 06:00-18:00 h).
  2. Ratos, dois de casa / gaiola e manipular diariamente ao longo do estudo. Providenciar comida e água ad libitum na gaiola em casa em todas as fases do estudo.
    Nota: Restrição alimentar aumenta o saliency do cocaína recompensa48, potencializa a atividade locomotora induzida por cocaína,49e age como um fator de estresse para o restabelecimento de50 e, portanto, pode também reatividade de sinalização de impacto.
  3. Atribua aleatoriamente ratos de solução salina ou cocaína grupos de tratamento.

2. cirurgia

  1. Coloque o rato sob anestesia, usando um coquetel contendo 8,6 mg/kg de xilazina, 1,5 mg/kg de acepromazina e 43 mg/kg de cetamina suspendida em solução salina bacteriostática. Confirme que o rato é suficientemente anestesiado por beliscar seu dedo do pé e monitorar a respiração e os reflexos de motor. Aplica a pomada oftálmica diretamente aos olhos para evitar ressecamento do olho.
    Nota: Se o rato não é suficientemente anestesiados vai expor uma resposta motora para o aperto de dedo do pé, e pode aumentar rapidamente a taxa de respiração do rato.
    1. Utilizando técnica asséptica, enquanto o rato está sob anestesia, implante de um cateter intravenoso na veia jugular, conectada a um monte de volta com uma cânula. Após a implantação cirúrgica, permitem que ratos recuperar por 5-7 dias 28,36,37,51.
      Nota: A via venosa de auto-administração de cocaína em humanos resulta em rápidos aumentos no cérebro cocaína níveis52,53. Assim, em uma de suas variantes mais comuns de pré-clínicos, ratos são treinados para auto-administrar cocaína através de um cateter intra na jugular.
  2. Manter a patência do cateter com liberações diárias usando uma solução de 0,1 mL de solução salina bacteriostática contendo heparina de sódio (10 U/mL), estreptoquinase (0,67 mg/mL) e ticarcillin dissódico (66,67 mg/mL). Começar o cateter rubor no dia após a cirurgia e continuar cada dia seguinte sessões de auto-administração.
    1. Encher uma seringa com a solução e conectar-se a montagem volta à seringa através de tubos de polietileno para lavar.
    2. Verificar o cateter adequado função periodicamente durante todo o experimento por administração intravenosa de 10 mg/kg de sódio methohexital.
      Nota: Esta é uma dose suficiente para anestesiar brevemente o animal apenas quando administrado por via intravenosa.

3. autoadministração

  1. Use o software de programação para gerar 4 programas separados, conforme descrito abaixo.
    1. Código dois programas para auto-administração em uma proporção fixa (FR) 1 agenda, i. e., onde uma imprensa de alavanca ativo resulta em uma infusão. Para o programa #1, código a alavanca esquerda como a alavanca ativa; para o programa #2, código a alavanca direita como a alavanca ativa. Construa dois programas para ser 180-min em comprimento e entregar o estímulo de cocaína e discreta cue complexo da seguinte maneira:
      1. Tem uma alavanca ativa pressione causa iluminação simultânea de ambos a casa e a luz estímulo acima a alavanca ativa.
      2. Após um atraso de 1-s, tem a bomba de infusão entregar 0,1 mL da solução ao longo de 6 s.
      3. Ter o estímulo luz desligar após 7-s (Inactive ao mesmo tempo como a bomba de infusão).
      4. Tem a luz de casa desligar após 27-s, com a última 20-s indica um período de tempo limite, durante o qual alavanca ativo prensas não têm agendadas consequências e, no entanto, estes ainda são registrados.
      5. Para saída de dados, colete infusões, alavanca ativo prensas, prensas de alavanca inativos e latência para pressionar alavanca ativo.
    2. Código de mais dois programas para auto-administração em um FR5 agendar, i. e., onde cinco alavanca prensas resultado em uma infusão. Novamente, fazer um programa com a alavanca activa como a esquerda e um programa com a alavanca de ativa como direito. Faça os dois programas 180-min em comprimento e entregar o reforçador e discreta cue complexo da seguinte maneira:
      1. Tenho cinco alavanca ativo prensas causa iluminação simultânea de ambos a luz da casa e o estímulo de luz acima da alavanca ativa.
      2. Repita as etapas 3.1.1.2 através de 3.1.1.5.
  2. Formação de auto-administração
    1. Preparar a solução de cocaína diariamente em estéril 0,9% NaCl para uma dose de 0,75 mL de mg/kg/0.1.
      Nota: Ao longo da duração de cada sessão de auto-administração de 180 min, ratos administram cerca de 4-5 mL de solução de cocaína, assim, para preparar-se em excesso, antecipar aproximadamente 8 mL/rato diariamente.
    2. Encha a seringa do cateter (10 mL) pelo menos 8 mL de solução salina ou cocaína. Depois de se assegurar que a solução salina/cocaína está fluindo, inserir as seringas para a bomba de infusão e conectar a tubulação de polietileno envolvida por uma trela de mola de metal no início de cada sessão de auto-administração. Ajuste cuidadosamente a seringa em cada bomba de infusão tal que a solução é uniformemente e completou distribuídos na tubulação antes de anexar a cada cateter de polietileno.
    3. Lugar de ratos nos aposentos do respectivo padrão operante condicionado alojados em compartimentos ventilados, som-atenuação com fãs. Consistentemente Coloque cada rato na mesma Câmara operante e mantenha a alavanca ativa do mesmo lado ao longo de todas as experiências. Contrabalançar a atribuição de ratos entre esquerda e direita ativas alavancas.
      Nota: Cada câmara está equipada com um recipiente de pelota ladeado por duas alavancas de resposta retrátil, uma luz de estímulo acima cada alavanca de resposta e uma casa de luz em frente as alavancas. Seringas de cocaína/solução salina são conectadas a um 23G agulha (arquivada para evitar picar tubulação) anexado à tubagem de polietileno envolvida dentro uma trela de mola de metal que se conecta ao cateter de cada rato e é operada em um giro líquido. Seringas são colocadas em bombas de infusão localizadas adjacentes ao cubículo.
    4. Ratos de trem para alavanca Pressione para infusões de cocaína (0,75 mg/kg/0.1 infusão de mL) ou infusões de soro fisiológico (0,1 mL) durante sessões diárias de 180-min usando estabeleceram métodos28,36,37,51.
      Nota: Esta formação é realizada simplesmente, colocando o rato na câmara operante e permitindo a imprensa de alavanca; pressionando a alavanca ativa resultará na recepção do sinal discreto complexo e infusão de cocaína, enquanto pressionando a alavanca inativa carrega sem consequências programadas.
      1. Agendar as conclusões sobre o resultado de alavanca ativo na entrega de cocaína ou infusão de solução salina durante um período de 6-s emparelhado simultaneamente com a iluminação da casa luz e luz acima a alavanca ativa de estímulo e ativação da bomba de infusão (isto é a discreta sinalização complexo emparelhado com entrega de cocaína); Prensas de alavanca inativo produzem sem consequências programadas. Após o parto de reforçador (cocaína), a luz de estímulo, bem como a bomba de infusão é inativada; a luz da casa permanece em por um adicional de 20-s indicar um período de tempo limite, durante o qual alavanca prensas não têm agendadas consequências.
        Nota: Uma descrição de como configurá-lo encontra-se em passos 3.1.1.1-3.1.1.4
    5. Após a conclusão da sessão 180-min, retire cada rato da sua câmara de condicionamento operante e irrigue o cateter (passo 2.2). Limpe cuidadosamente as câmaras entre sessões, limpar cada superfície com uma solução de etanol 70%.
      Nota: Ratos que receberam cocaína durante a sessão de auto-administração podem ser difíceis de remover da câmara e são mais propensos a ser agressivo. Use movimentos lentos, cuidadosos para desconectar seu baraço cada rato.
    6. Treinar ratos um FR1 horário de reforço e progresso para uma programação FR5 depois de atingir um critério de sete infusões/h com menos de 10% a variabilidade do número total de infusões por sessão por três dias consecutivos. Continue as sessões de auto-administração até ratos chegaram a um total de 14 dias de treinamento de auto-administração.
      Nota: Esta é uma variante da aprendizagem operante; alguns protocolos preferem ter ratos permanecem no FR1 em toda a totalidade da experiência. Alterações no cronograma de proporção fixa de FR1 a FR5 não afetam o número de infusões, um animal self-administers54,,55. No entanto, aumentar o tamanho de proporção fixa ajuda a garantir a estabilidade de responder em ratos e pode aumentar o saliency a recompensa56. Além disso, se for desejado um tratamento durante a abstinência forçada, ratos devem ser pseudo aleatoriamente para os grupos de tratamento em cima de alcançar a estabilidade (menos do que a variabilidade de 10% do número total de infusões por sessão para um mínimo de 3 dias consecutivos) no o horário de FR5. Além disso, ratos salinos não progredirá do FR1 para FR5, como o saliency de soro não é suficiente para atingir a estabilidade necessária para progredir de FR1 para FR5.

4. forçada abstinência

  1. Coloque os ratos em abstinência forçada por 30 dias; ou seja, não fornecem ratos com a oportunidade para auto-administrar cocaína ou soro fisiológico para uma duração de 30 dias. Importante, durante esse período não retorne ratos para as câmaras operante (o contexto anterior de auto-administração). No entanto, remova ratos de casa gaiolas para manipulação diária e pesagem, como medida de saúde geral.
    Nota: A duração da abstinência forçada pode ser alterada, mas é importante escolher uma duração suficiente evitar efeitos de teto e piso. Fatores de ser cônscio ao escolher a duração do período de abstinência forçada incluem roedor estirpe, idade, comprimento de sessão de auto-administração e duração, drogas, duração de dose e infusão de drogas e o sexo do animal.

5. cocaína Cue reatividade

  1. Código de dois programas de software para a tarefa de reatividade de sinalização em uma programação FR1; um programa com a alavanca esquerda como a alavanca ativa e com a alavanca direita como a alavanca ativa. Construção de cada programa para recolher alavanca pressionar dados para 60-min e entregar o sinal discreto complexo conforme descrito abaixo.
    1. Repita os passos 3.1.1.1-3.1.1.4
    2. Para saída de dados, colete apresentações de sinalização (anteriormente conhecidas como infusões), alavanca anteriormente ativo prensas, prensas de alavanca inativos e latência para pressionar alavanca.
  2. Sessão de testes de reactividade de Cue de cocaína
    1. Avalie a reatividade de sinalização no dia 30 de abstinência forçada em uma sessão de teste operante de 60 min. Escalone as horas de início de ratos para facilitar a rápida decapitação e colheita de cérebro. Importante, para o teste de reatividade do taco, não coloque a seringa na bomba de infusão para que o som da bomba de infusão serve como um sinal auditivo mas nenhum reforço de cocaína é entregue.
      Nota: Reatividade Cue pode ser avaliada em dias excepto dia 30 de abstinência forçada, no entanto, o fato de que a capacidade de resposta às sugestões de cocaína-emparelhado varia ao longo do tempo34 deve ser mantido em mente ao escolher a data para o teste de reatividade de sinalização.
    2. Colocar cada rato na câmara de auto-administração em que ele foi treinado e amarrar a sua cânula como durante as sessões diárias de auto-administração. Pressiona a alavanca que previamente entregue a cocaína ou solução salina é agora apenas reforçada pela entrega do complexo sinalização discreta (i. e., o estímulo luz e casa são iluminados e a bomba de infusão é ativada) em um cronograma FR1 (i.e., um complexo de sinalização discreta é apresentado por imprensa alavanca ativo); contar as apresentações de sinalização e prensas de alavanca anteriormente ativo durante uma sessão de 60 min e também gravar o número de prensas de alavanca inativo. No entanto, como com auto-administração, prensas de alavanca inativo produzem sem consequências programadas.
      Nota: Uma opção de controle adicional é gravar prensas alavanca anteriormente-ativos e inativos na ausência de consequências programadas (i. e., nenhum reforçador complexo sinalização discreta).
    3. Após a conclusão da reatividade do taco sessão de teste, imediatamente eutanásia em ratos para capturar os efeitos bioquímicos da re-exposição para a câmara de condicionamento operante e discreta cue complexo.

6. análise, organização e coleta de dados

  1. Quebrar dados em três categorias convencionais: saúde geral, auto-administração e reatividade de sinalização.
    1. Monitorar o estado geral de saúde (ex., animal de peso, pele condição) durante todo o experimento e fornecer animais com veterinária conta, se necessário, ou remova o estudo se pressionar alavanca parece afetada pela saúde.
    2. Colete dados de auto-administração durante os 14 dias de auto-administração. Use um teste t pareado, bicaudal para determinar diferenças estatísticas entre cocaína e grupos de auto-administração salina para número total de infusões, alavanca ativo prensas, prensas de alavanca inativos e latência para pressionar alavanca ativo.
      Nota: Auto-administração dados precisam ser analisados antes de forçado a abstinência se um deseja estudar o efeito de um tratamento durante abstinência forçada na reatividade de sinalização (de modo que os grupos podem ter um número médio igual de infusões, bem como ativo e inativo Prensas de alavanca). Se um projeto de dois-por-dois é escolhido (cocaína ± tratamento, ± salina), uma ANOVA de duas vias com análise post hoc apropriado deve ser usada para analisar estes dados.
    3. Para dados de reatividade de sinalização coletar e analisar para o número total de apresentações de sinalização, alavanca anteriormente ativo prensas, prensas de alavanca inativo e latência para pressionar alavanca. Também analise esses dados com um teste t pareado, bicaudal para determinar diferenças entre animais auto administrar cocaína e aqueles auto administração de solução salina.
      Nota: Novamente, se um projeto de dois-por-dois é escolhido (cocaína ± tratamento, ± salina), uma ANOVA de duas vias com análise post hoc apropriado deve ser usada para analisar estes dados.

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Representative Results

Resultados de um experimento de auto-administração e abstinência de cocaína seguido por um teste de reatividade de sugestão de um estudo anteriormente publicado57 são mostrados na Figura 1. O cronograma de estudo é representado na figura 1A.

Ratos individualmente a transição do FR1 para FR5 conforme a critérios. Como condicionamento operante prossegue no grupo de administração de cocaína, ratos, gradualmente, aumentar o número de infusões até atingir um platô (figura 1B). Prensas de alavanca inativo permanecem consistentemente baixas em ambos os grupos de cocaína-gestão e administração de soro fisiológico; diferenças em prensas de alavanca inativo sugerem mudanças na motivação ou saúde. Salina auto-administração serve como um controle em que o soro fisiológico não é reforço; assim, prensas de alavanca e infusões não escalar de dia 1 a dia 14 (não ilustrado). Se ativo alavanca pressiona no grupo Administração de cocaína declínio entre dia 1 e dia 14, o cateter provavelmente perdeu a patência (também evidenciada pelo método descrito na etapa 2.2.2), e este animal deve ser removido do estudo. Animais que são estatísticos valores atípicos (como calculado usando Q teste um Dixon) também devem ser retirados do estudo.

Várias medidas de saída estão reunidas desde o teste de reatividade de sinalização de cocaína. Por exemplo, a Figura 1 representa o número de alavanca pressiona a alavanca de ativos anteriormente. Ratos que anteriormente auto administrada cocaína devem pressionar a alavanca de anteriormente ativo muito mais do que ratos que auto administrado soro fisiológico. E, se um tratamento é eficaz em atenuantes reatividade de sinalização de cocaína, também deve haver uma redução significativa do número de ativos anteriormente alavanca prensas em ratos que receberam o tratamento comparado com ratos que receberam cocaína e cocaína e o veículo (não ilustrado).

Outras medidas incluem latência a primeira imprensa alavanca (Figura 1), número de prensas de alavanca inativos e número de apresentações de sinalização. Podem ser observadas alterações na latência para pressionar alavanca; uma latência maior para pressionar alavanca pode sugerir que o animal é fisicamente doente, ou que há diminuição da motivação para cocaína. Apropriado de controles para comportamento locomotor, tais como as tarefas Rotarod ou campo aberto, deve ser empregado para diferenciar entre doença física e alterações em motivação.

Embora um pode presumir que o número de apresentação de sinalização deve reflectir-se no número de prensas de alavanca ativo anteriormente, isto não é frequentemente o caso. Muitas vezes anteriormente ativo alavanca prensas são muito maiores do que apresentações de sinalização. Ratos, muitas vezes mostram pressionando perseverative alavanca anteriormente ativo durante o período de tempo limite, ostensivamente em resposta a uma falha para receber o estímulo esperado cocaína.

Figure 1
Figura 1. Linha do tempo experimental e resultados representativos de reatividade auto-administração e cue. Esta figura foi modificada de Miller et al., 201657. (A) cronograma Experimental como descrito nas seções de protocolo 3, 4,5. (B) média diárias prensas de alavanca ativo, inativo alavanca prensas e infusões ± SEM para formação de auto-administração; sessões de auto-administração eram 180-min cada dia por 14 dias consecutivos. Cocaína foi inicialmente entregues em uma agenda de FR1 de reforço até critério de reunião, em seguida, foi introduzido um cronograma FR5. (C) média alavanca pressiona a alavanca anteriormente-ativa imprensa ± SEM para o teste de reatividade de 60-min deixa; um teste t pareado, bicaudal mostra uma diferença significativa entre cocaína e solução salina auto administrar ratos (t(30) = 14,82, * * p < 0,0001). Teste de latência média (D) a primeira alavanca imprensa ± SEM para a reatividade de 60-min deixa; um teste t pareado, bicaudal não mostra nenhuma diferença significativa entre cocaína e solução salina auto administrar ratos (t(29) = 0.2758, p = 0.7847). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Exposição a drogas-emparelhado sugestões e alterações fisiológicas em resposta a estas pistas16 estão associados a recaída,11,16 e o teste de reatividade de sinalização cocaína empregado acima contingentemente apresenta sugestões de cocaína-pareado na ausência de drogas; assim, o comportamento droga-procurando na forma de ativos anteriormente alavanca prensas serve como uma medida de vulnerabilidade de recaída. O protocolo de reatividade de sinalização aqui descrito é um meio de pré-clínicos pelo qual farmacoterapias modificando a recaída podem ser testadas, e fatores genéticos e ambientais que contribuem para o risco de recaída podem ser investigados. Esta é uma tarefa operante para o comportamento de busca de drogas que alinha com muitas propriedades de drogas humanas e recaída, e muitas publicações têm otimizado parâmetros de chave droga dose e entrega, bem como adotado controlos adequados para estabelecer a validade de rosto e poder preditivo translacional28,36,37,39,51. Este modelo foi publicado recentemente em um estudo por Miller et al. investigando o uso de uma gama de receptor proliferator-ativado de Peroxissoma (agonista PPARγ como um farmacoterapêutico para atenuar a cocaína deixa reatividade57. Este estudo mostrou que a pioglitazona (um agonista do PPARγ) diminuição da capacidade de resposta às sugestões de cocaína-emparelhado seguindo forçada abstinência de auto-administração de cocaína. Desde que a pioglitazona é aprovado pela FDA, o Miller et al. estudo solicitado um ensaio clínico piloto dois-braço duplo-cego, randomizado, placebo-controlado para examinar a eficácia da genealogia PPARγ em suprimir a reatividade de sinalização de cocaína, impulsividade e a tomada de decisões arriscada. O mérito de translação e validade preditiva do modelo roedor é suportado pela Schmitz et al. Publicação58 sobre este estudo piloto em que indivíduos dependentes de cocaína tratados com pioglitazona exibiram um tratamento x interação do tempo para o desejo de auto-relato reduzida, medido pela escala breve de ânsia de substância e uma escala analógica Visual para desejo de58. Desta forma, pioglitazona mostra promessa como um tratamento de prevenção de recaída de CUD, consistente com o Miller et al. dados pré-clínicos.

Este teste de reatividade rato cocaína deixa durante abstinência recapitula a crônica humana cocaína auto-administração com curto intermitente (por exemplo, 21 horas) e tempo (por exemplo, dia 30) períodos de abstinência, fornecendo a capacidade de criar paralelas conjuntos de dados entre os humanos e modelos de roedores. No entanto, este protocolo difere do modelo de extinção-reintegração mais penetrante, que mede o tempo para drogas ou - buscando seguir um processo de extinção e (normalmente) uma abstinência período33,34,35 ,59. Embora o modelo de extinção-reintegração possui validade preditiva33, também tem limitações notáveis. Em primeiro lugar, o processo de extinção prossegue com re-expor o soro fisiológico e cocaína auto administrar grupos ao contexto na ausência de auto-administração de drogas reforço60 que raramente é recapitulada em seres humanos desde as sugestões relacionadas com a droga incluem Estados de humor, lugares e pessoas44— pistas que não podem ser facilmente copiadas em um ambiente clínico45,46,47. Em segundo lugar, durante o processo de reintegração, ratos apresentam níveis baixos de responder criando um efeito de piso que suprime a capacidade de detectar os efeitos das intervenções para reduzir o comportamento de busca de drogas33— um problema que é resolvido através da remoção de extinção, uma vez que diminui a formação de extinção respondendo. Alguns podem argumentar que a sessão de testes de reatividade de 60-min deixa descrita acima poderia servir como uma sessão de extinção. No entanto, o fato de que o protocolo inclui reforço sem drogas, a sessão de teste não é repetido, e ratos mantêm motivação para auto-administração subsequente após testes de reatividade de sinalização sugerem que este projeto de teste não induz extinção 36.

Um problema adicional é que se o comprimento de sessão de auto-administração relativamente curto empregado (180 min) é suficiente para reforçar a auto-administração subsequente. No entanto, a literatura mostra que esse regime consistentemente resulta em um padrão estável de rato cocaína auto-administração37,39,,51,57,61, proporcionando menor variabilidade entre os animais que permite que o experimentador classificar os sujeitos em grupos de tratamento pós-autoadministração, se desejado28,39,,51,57. No entanto, note-se que a curta duração e curta sessão procedimento de comprimento não recapitular inteiramente humana auto-administração, onde normalmente os padrões de compulsão, como surgem em indivíduos dependentes de cocaína62. No entanto, se a auto-administração contínua é permitida em modelos de roedores, mortalidade são extremamente alta de63.

Adicionais variáveis a considerar são a taxa de dose e infusão de cocaína desde que estes influenciam a sensibilização da resposta subjetiva de recompensa. Velocidades de infusão aumentam a sensibilização para os efeitos de reforçados de cocaína, enquanto velocidades mais lentas diminuem-lo64. Desde que a curva de dose-dependência para auto-administração de cocaína é uma forma de U invertida e dose influencia o número de infusões por hora55; o protocolo acima usa uma dose que cai perto do pico da curva de dose-resposta em acesso a curto prazo e a longo prazo de procedimentos de acesso61 a fim de detectar mudanças no número de infusões. Contrabalançar as alavancas é outro controle importante para garantir que os ratos não mostrar preferência por uma alavanca sobre o outro.

Os resultados representativos da Figura 1 mostram dados de ratos Sprague Dawley masculinos. Historicamente, estes estudos têm foi restringidos aos ratos masculinos devido aos efeitos do ciclo estral na aquisição de cocaína auto-administração65 e extinção/reintegração66. Desde o sexo como uma variável biológica é agora obrigatória para estudos financiados pelo NIH, tornou-se imperativo para monitorar a fase estral e teste para diferenças de sexo no misto de sexo estudos e, como tal, deve considerar-se poder estatístico para grupos experimentais de tudo. Em outra nota, o uso de uma cepa de ratos outbred, tais como Sprague Dawley, é benéfico em que proporciona variação genética mais comparável com a população humana — embora nem outbreds cepas roedores não podem recapitular totalmente o pensamento de diversas influências genéticas a fundamentam comportamentos viciantes, como em seres humanos67. Finalmente, a idade de exposição inicial de cocaína é uma consideração importante. Em ratos, a exposição à cocaína durante resultados de adolescência em uma preferência de lugar condicionado que requer um maior número de tentativas de extinção para extinguir68, sugerindo que o adolescente rato demonstra maior persistência de cocaína-buscando comportamento. Assim, exposição pós-natal de pré-natal e no início a cocaína provavelmente irá alterar a reatividade de sinalização de cocaína.

Porque a extinção não é o objetivo da reatividade de sugestão de teste, uma limitação é que não é possível avaliar a tarefa repetidamente ou sobre durações de tempo, ou então o animal apaga-se o emparelhamento do reforçador de cocaína (primária) com o (complexo de sinalização discreta condicionado reinforcers). Assim, deve ter cuidado ao projetar o experimento para garantir que essa extinção não ocorre. No entanto, uma vantagem desta tarefa é que as alterações bioquímicas precisas induzidas pela exposição à cocaína-emparelhado pistas podem ser elucidadas usando este procedimento. Uma segunda limitação para a tarefa é que só funciona com reinforcers positivas, embora esta é uma limitação comum a muitos modelos para drogas de abuso. Passos críticos no protocolo incluem a manutenção da permeabilidade do cateter (passo 2.2), aquisição de auto-administração (passo 3.2), adequada distribuição de ratos em grupos de tratamento, se desejado, que são estatisticamente equivalentes para infusões e número de Prensas de alavanca (etapa 3.2.6) e software adequado ao longo de programação para garantir que os sinais discretos são apresentados e emparelhados com o estímulo de cocaína durante o treinamento de auto-administração e o teste de reatividade de sinalização (medidas 3.1, 5.1). Como com outros modelos de vulnerabilidade de recaída, é imperativo para atingir um tamanho razoável de abstinência para evitar o piso e teto efeitos sobre responder durante o taco reatividade teste33,34 (passo 4). The Most provavelmente complicações para encontro com este procedimento são 1) perda de desobstrução de cateter, impedindo a aquisição de auto-administração, 2) inadequada distribuição de roedores em grupos de tratamento após a formação de auto-administração e antes da sinalização teste de reatividade causando um erro tipo 1 ou tipo 2 e 3) abstinência insuficiente para determinar diferenças entre os grupos para responder. Estes podem ser resolvidos pela avaliação diária do desempenho de auto-administração, cateter regular flushes, atribuição de grupos de análise post hoc após balanceamento para desempenho de auto-administração e ensaios piloto determinar o apropriado abstinência duração de estirpe roedor, idade, comprimento de sessão de auto-administração e duração, droga, dose da droga, duração de infusão de drogas e sexo.

Este procedimento é extensível para muitas cepas de roedores, incluindo ratos,69e qualquer modelo que envolve o emparelhamento de um reforçador primário gratificante com sinais discretos (reinforcers condicionados). Alternativas reinforcers preliminares incluem outras classes de drogas, alta gordura alimentar e outras recompensas palatável69,70. Finalmente, translação relevância deste modelo tem sido demonstrada por levar adiante uma intervenção aprovado pela FDA, testada em ratos cobaias humanas RUMINA, que resultou na ânsia de cocaína reduzido. Assim, o cocaína deixa reatividade teste seguindo cocaína auto-administração e abstinência mantém promessa como um modelo de roedor translacional.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Todos os testes comportamentais foi realizada na Universidade do Texas Medical Branch (UTMB) roedores In Vivo avaliação (RIVA) Core, dirigido pelo Dr. Kelly Dineley e alojado no interior do centro para pesquisa de vício, dirigido pelo Dr. Kathryn Cunningham. Suporte para este trabalho veio de Peter F. McManus Charitable Trust, Instituto Nacional de centro de Ciências de saúde ambiental para toxicologia ambiental no UTMB (T32ES007254), Instituto de Ciências translacionais UTMB (UL1TR001439), Centro de Mitchell para doenças neurodegenerativas e centro de pesquisa do vício no UTMB (DA007287, DA070087 e estudo piloto fundos).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Catheter Tubing: 0.50mm ID x 0.94mm OD x 0.2mm width Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 11-189-15A 1/experiment
Cue Light Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-229M 2/operant chamber
Guide Cannulae (22 gauge, pedestal size-8mm, cut length 11 mm, 5 mm above the pedestal) Plastics One, Roanoke, VA, USA 8IC313G5UPXC 1/rat
House Light Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-227M 1/operant chamber
Infusion Pump Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA PHM-100 1/operant chamber
Levers Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-110M 2/operant chamber
Liquid Swivels Instech, Plymouth Meeting, PA, USA 375/22 1/operant chamber
MED-PC Package with Infusion Pump Software Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA SOF-735 (infusions software SOF-700RA-10 version 1.04) 1
Metal Spring Leash Plastics One, Roanoke, VA, USA C313CS/SPC 1/operant chamber
Needle (23g, 1 in) Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 305193 1/operant chamber
Nitex Mesh (6/6 woven mesh sheet, 12"x12", 500 microns thick, 38% Open Area) Amazon, Seattle, WA, USA CMN-0500-C, B000FMUNE6 ~1 sheet/100 rats
PCI Interface Package Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA DIG-700P2-R2, MED-SYST-16 1/16 operant chambers
Power Supply for Interface Modules Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA SG-6510D 1/16 operant chambers
Sound-attenuating Cubicle Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-018V 1/operant chamber
Syringes, 10 mL Luer-Lok™ tip Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 14-827-52 1 case/experiment (1/operant chamber)
Tygon Tubing for flushes: 0.51mmID x 1.52mm OD 0.51mm width x 152.4m length Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 14-170-15B 1/experiment
Chemicals
Acepromazine (10mg/mL) Henry Schein (Animal Health), Melville, NY, USA 003845 ~0.5mg/rat*
Acraweld Repair Resin Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 1013959 1/experiment
Altalube (ophthalmic ointment) Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 6050059 1/experiment
Cocaine NIDA North Bethesda, MD, USA N/A ~350mgs/rat for whole experiment*; requires DEA License
Heparin (10,000 USP units/10 mL) Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA NDC 25021-400-10 1/experiment (~21 units/rat*)
Jet Liquid Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 1256401 1/experiment
Ketamine (100mg/mL, 10mL) Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 1049007 ~15mg/rat*; requieres DEA license
Methohexital Sodium (Brevital®, 500 mg/50 mL) Patterson Dental, Saint Paul, MN, USA 043-5461 1/experiment; requires DEA License
Saline (0.9%, USP) Baxter, Deerfield, IL, USA 2B1307 1 case/experiment
Streptokinase from β-hemolytic Streptococcus (Lancefield Group C) ≥3,000 units/mg Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA S3134-250KU 1 vial/experiment (~1.5mg/rat/experiment*)
Ticarcillin Disodium Salt Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 50-213-695 ~4 vials/exeriment or purchase the 25g vial cat.# 50-489-093 (~150mg/rat/experiment*)
Xylazine (100mg/mL) Henry Schein (Animal Health), Melville, NY, USA 033198 ~3mg/rat*
*Assumes rat age is that described in the protocol, rats self-administer for 14 days, and flushes occur for 21 days.

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Neurociência edição 136 cocaína uso de substâncias desordem auto-administração reatividade de Cue ratos abstinência Cue recaída operante condicionamento drogas remédios translação
Um protocolo para medição de reatividade de Cue em um modelo do rato do transtorno de uso de cocaína
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Dimet, A. L., Cisneros, I. E., Fox,… More

Dimet, A. L., Cisneros, I. E., Fox, R. G., Stutz, S. J., Anastasio, N. C., Cunningham, K. A., Dineley, K. T. A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder. J. Vis. Exp. (136), e55864, doi:10.3791/55864 (2018).

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