אנו מציגים שלוש שיטות חדשות כדי ללמוד קידוד gustatory . בעזרת חיית מחמד פשוטה, המנדוקה סוקה ( Manduca ) , אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, השימוש tetrodes תאיים להקליט את הפעילות של נוירונים קולטן רב גוסטורי, ומערכת לאספקת ומעקב פולסים תזמון מדויק של טעימות.
חוש הטעם מאפשר לבעלי חיים לזהות חומרים כימיים בסביבה, מה שמביא להתנהגויות חיוניות להישרדות. כאשר נוירונים קולטן גוסטורי (GRNs) לזהות מולקולות טסטנט, הם לקודד מידע על הזהות ואת הריכוז של הטעם כמו דפוסי הפעילות החשמלית כי אז להפיץ נוירונים עוקבים במוח. דפוסים אלה מהווים ייצוגים פנימיים של הטעם, אשר לאחר מכן לאפשר החיה לבחור פעולות לזכרונות. השימוש במודלים של בעלי חיים פשוטים יחסית היה כלי רב עוצמה ללימוד עקרונות בסיסיים בקוד החושי. כאן, אנו מציעים שלוש שיטות חדשות ללמוד קידוד gustatory באמצעות mextuca mextuca sexta . ראשית, אנו מציגים הליך לנתיחה לחשיפת עצבים מקסימילריים אזור תת אזורית (SEZ), המאפשר הקלטה של הפעילות של GRNs מן האקסונים שלהם. שנית, אנו מתארים את השימוש של אלקטרודות תאיים כדי להקליט את הפעילות של GRNs מרובים על ידי הצבת teTrode חוטים ישירות לתוך העצב Maxillary. שלישית, אנו מציגים מערכת חדשה לאספקת ניטור, עם דיוק גבוהה בזמן, פולסים של טסטנטים שונים. שיטות אלה מאפשרים אפיון של תגובות העצבית vivo ישירות GRNs לפני, במהלך ואחרי הטעמים מועברים. אנו מספקים דוגמאות של עקבות מתח שנרשמו מ GRNs מרובים, ולהציג דוגמה כיצד טכניקה מיון ספייק ניתן ליישם את הנתונים כדי לזהות את התגובות של נוירונים בודדים. לבסוף, כדי לאמת את הגישה שלנו הקלטה, אנו משווים הקלטות תאיים המתקבל GRNs עם tetrodes הקלטות תאיים שהושגו עם אלקטרודות זכוכית חדה.
מערכות המעי הגס וחוש הריח מייצרות ייצוגים פנימיים של כימיקלים בסביבה, מה שמביא לתפיסות של טעמים וריחות, בהתאמה. החושים הכימיים האלה חיוניים להפקת התנהגויות רבות חיוניות להישרדות האורגניזם, החל מציאת בני זוג וארוחות, כדי למנוע טורפים ורעלים. התהליך מתחיל כאשר כימיקלים סביבתיים אינטראקציה עם קולטנים הממוקם בקרום פלזמה של תאים קולטניים סנסוריים; תאים אלה, ישירות או באמצעות אינטראקציות עם נוירונים, transduce מידע על הזהות והריכוז של כימיקלים לתוך אותות חשמליים. אותות אלה מועברים לנוירונים מסדר גבוה יותר ומבני מוח אחרים. ככל שצעדים אלה מתקדמים, האות המקורי עובר תמיד שינויים המקדמים את יכולתו של האורגניזם לזהות, להפלות, לסווג, להשוות ולאחסן את המידע החושי, ולבחור בפעולה המתאימה. הבנת איך החזייהב transforms מידע על כימיקלים סביבתיים כדי לבצע מגוון רחב של משימות היא שאלה בסיסית בתחום מדעי המוח.
קידוד גוסטורי נחשב כפשוט יחסית: תפיסה הרווחת גורסת כי כל מולקולה כימית שמקבלת טעם ("טסטנט") שייכת באופן טבעי לאחת מחמש תכונות הטעם הבסיסיות ( כלומר , מתוק, מריר, חמוץ) , מלוח ואומאמי) 1 . בתפיסת "הטעם הבסיסי" הזה, תפקידה של מערכת התסכול הוא לקבוע אילו טעמים בסיסיים אלה קיימים. יתר על כן, המנגנונים העצביים המונחים ביסוד הטעם הבסיסי במערכת העצבים אינם ברורים, והם נחשבים להיות נשלט על ידי "קו מסומן" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 או "על פני דפוס סיבים" 7 </suP> , 8 קוד. בקוד קו מסומן, כל תא חושי וכל אחד מחסידיו העצביים מגיבים לאיכות טעם אחת ויוצרים ערוץ ישיר ועצמאי למרכזי עיבוד גבוהים יותר במערכת העצבים המרכזית המוקדשים לטעם. לעומת זאת, בקוד דפוס סיבי, כל תא חושי יכול להגיב לאיכויות הטעם המרובות, כך שהמידע על הטעם מיוצג על ידי התגובה הכוללת של אוכלוסיית הנוירונים הסנסוריים. בין אם מידע גוסטיווי מיוצג על ידי טעמים בסיסיים, באמצעות קווים מסומנים, או באמצעות מנגנון אחר, אינו ברור והוא מוקד החקירה האחרונה 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . העבודה שלנו לאחרונה עולה כי מערכת gustatory משתמש קוד האוכלוסייה spatiotemporal ליצורייצוגים של טסטנטים בודדים ולא בקטגוריות טעם בסיסיות 10 .
כאן אנו מציעים 3 כלים חדשים כדי לסייע במחקר של קידוד gustatory. ראשית, אנו מציעים את השימוש של סנדקה hawkmoth מאנדוקה כמו אורגניזם מודל פשוט יחסית הנלמד מחקר אלקטרופיזיולוגי של טעם לתאר הליך לנתיחה. שנית, אנו מציעים את השימוש "tetrodes" תאיים להקליט את הפעילות של GRNs הפרט. ושלישית, אנו מציעים מנגנון חדש לאספקת ניטור מדויק של פעימות מתוזמן של טסטנט אל החיה. כלים אלה הותאמו טכניקות המעבדה שלנו ואחרים השתמשו כדי ללמוד את מערכת חוש הריח.
חרקים כמו זבוב הפירות תסיסנית melanogaster , ארבה Schistocerca אמריקה , כמו גם עש סנדקה עש , יש עשרות שנים סיפק משאבים רבי עוצמה כדי להבין עקרונות בסיסיים על nerVOS, כולל קידוד סנסורי ( למשל, olfaction 13 ). אצל יונקים, קולטני הטעם הם תאים מיוחדים שמתקשרים עם נוירונים דרך מסלולים מורכבים של מסיר שני, 1 , 14 . זה פשוט יותר חרקים: קולטני הטעם שלהם הם נוירונים. יתר על כן, מסלולי הטעם של יונקים ליד הפריפריה הם מורכבים יחסית, שמציעות מסלולים עצביים מרובים מקבילים, ורכיבים חשובים הם מאתגרים לגישה, הכלולים במבנים גרמיים קטנים 15 . חרקים טעם חרקים נראה פשוט יותר. ב חרקים, GRNs כלולים מבנים מיוחדים המכונה סנסילה, הממוקם באנטנה, mouthparts, כנפיים ורגליים 16 , 17 . את GRNs ישירות לפרויקט לאזור תת תת קרקעי (SEZ), מבנה שתפקידו נחשב להיות בעיקר gustatory 17 , ואשר מכיל סדר שנינוירונים גוסטיים 10 . משם המידע מגיע לגוף כדי להניע רפלקסים, ולאזורים מוחיים גבוהים יותר להיות משולבים, מאוחסנים, ובסופו של דבר לנהוג בחירות התנהגותיות 16 .
יש צורך לאפיין תגובות הטעם הפריפריה כדי להבין כיצד מידע הטעם הוא מופץ והשתנה מנקודה לנקודה לאורך מערכת העצבים. השיטה הנפוצה ביותר כדי לפקח ישירות על הפעילות העצבית של GRNs חרקים היא טכניקת ההקלטה קצה 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . זה כרוך הצבת אלקטרודה ישירות על סנסילום, שרבים מהם קל יחסית לגשת. הטעם כלול בתוך האלקטרודה, המאפשר אחד להפעיל ו extגזעני למדוד תגובות עצביות של GRNs ב sensillum. אבל, בגלל הטעם הוא הכיל את האלקטרודה, לא ניתן למדוד את פעילות GRN לפני הטעם נמסר או לאחר הסרתו, או להחליף טעימות מבלי להחליף את האלקטרודה 20 . שיטה נוספת, "הקיר בצד" טכניקה הקלטה, יש גם שימשו להקליט פעילות GRNs. כאן, אלקטרודה ההקלטה מוכנס לתוך הבסיס של טעם sensillum 24 , וטעמים מועברים דרך זכוכית נפרדת נימי על קצה הסנסילום. שתי הטכניקות להגביל את ההקלטה מ GRNs כדי sensillum מסוים. כאן, אנו מציעים טכניקה חדשה: הקלטה מתוך אקסון GRN שנבחרו אקראית מ sensilla שונים, תוך מתן בנפרד רצפים של טסטנטים כדי חוטם. הקלטות האקסון מושגות על ידי הנחת או אלקטרודות זכוכית חדה או צרורות אלקטרודה תאיים (tetrodes) לתוך העצב שנושאת אקסונים מGRNs ב חוטם 10 SEZ. במנדוצ'ה , האקסונים האלה חוצים את העצב המקסימלי, הידוע כבעל אופי גרידא, המאפשר הקלטה חד-משמעית של תגובות חושיות 25 . שיטה זו של הקלטה מ אקסונים, מאפשר, במשך יותר משעתיים, מדידה יציבה של תגובות GRN לפני, במהלך ואחרי סדרה של מצגות טעימות.
כאן, אנו מתארים הליך לנתיחה לחשיפת העצבים מקסימילרי יחד עם SEZ, אשר יכול לאפשר אחד להקליט בו זמנית את התגובות של GRNs מרובים נוירונים ב 10 SEZ. כמו כן, אנו מתארים את השימוש של הקלטות תאיים של GRNs באמצעות Custom-made 4 ערוצים tetrode מעוותת אשר, בשילוב עם שיטת מיון ספייק, מאפשר ניתוח של מספר (בידיים שלנו, עד שש) GRNs בו זמנית. אנחנו עוד להשוות הקלטות שנעשו עם tetrodes הקלטות שנעשו עם תאיים חדאלקטרודות. לבסוף, אנו מתארים מנגנון חדש עבור מתן גירויים טעים. הציוד החדש שלנו, המתבסס על הציוד ששימש זמן רב על ידי חוקרים רבים כדי לספק חומרי ריח בחקר האולפונים, מציע יתרונות לחקר הלמידה: שיפור במערכת ההולכה הרב-שנתית הקודמת, כמו אלה שפותחו על ידי סטורקוב ועמיתים (ראה הפניות 26 , 27 ), המנגנון שלנו משיג דיוק שליטה על העיתוי של משלוח טסטנט תוך מתן readout המתח של העיתוי הזה; וזה מאפשר משלוח מהיר, רציף של גירויים טעימות מרובים 10 . המכשיר מנגב את חוטם הזרימה בזרימה מתמדת של מים נקיים, שאליהם ניתן להעביר פולסים מבוקרים של טסטנט. כל דופק טעים עובר מעל חוטם ואז נשטף משם. טסטנטים מכילים כמות קטנה של צבעי מזון חסרי טעם, המאפשרים חיישן צבע לפקח, עם תזמון מדויק, את המעבר של ov טעיםאה חוטם.
השיטות המתוארות כאן מתירות בהקלטות vivo מחיה פשוטה יחסית, Manduca sexta , כדי לאפיין את פעילותם של מספר רב של GRNs שנבחרו באקראי על פני משכים ארוכים (במשך יותר מ -2 שעות), לפני, במהלך ואחרי משלוח טסטנט. שיטות אלה מאפשרות גם את המסירה המהירה והרצופה של מספר רב של גירויי טסטנט עם שליטה טמפורלית מדויקת, יתרונות שימושיים ללימוד מנגנונים עצביים המונחים ביסוד טסטנט. פרוטוקול זה שימש כדי ללמוד כיצד התגובות של GRNs כדי tastants הם שינו כאשר הם מועברים נוירונים היעד postsynaptic שלהם ( למשל, ב SEZ) על ידי ניטור GRNs בו זמנית עם interneurons מחובר monosynaptically 10 . בנוסף, שיטות אלה ניתן להתאים את הצרכים של הנסיין, המאפשר ביצוע של פרדיגמות מורכבות ללמוד היבטים בסיסיים של קידוד גס.
כאשר מתחיליםG המחקר שלנו, בעיה טכנית אחת היינו לפעמים כדי לפתור את חוסר היכולת לזהות אותות spiking מן העצב Maxillary עם חוטי tetrode. סיבות אפשריות לכך הן מגוונות, כמו פרוטוקול לנתיחה הוא מאתגר, וכמה תרגול הוא הכרחי כדי להשיג הכנה טובה. ראשית, במהלך לנתיחה עש את העצבים מקסימיליים קל נזק, במיוחד במהלך הסרת נדן סביב הרקמה העצבית. שנית, אם הנדן אינו מוסר באופן מלא, חוטי tetrode לא יוכלו לגשת לעצב. בשני המקרים, החל הכנה חדשה היא לעתים קרובות הדרך הקלה ביותר לפתור בעיות אלה. שלישית, ייתכן שיש בעיה עם חוטי tetrode. זה יכול להיבדק על ידי מדידת עכבה של חוטים אשר צריך להיות ~ 270 kΩ ב 1kHz. אם הערך עכבה מעל ~ 300 kΩ, electroplate החוטים עם זהב כדי להשיג את העכבה הרצויה (ראה התייחסות 30 ). רביעית, חתיכת ציוד עשוי להיות מקושריםאו התנהגות לא הולמת.
בעיה נוספת אפשרית היא כי אותות spiking נרשמות אבל הנוירונים (ים) מופיעים להגיב על הטעמים. זה יכול להיות בגלל הנוירונים שהוקלטו הם רגישים למערכת של טעימות נמסר. כמו כן, חשוב לזכור כי בנוסף אקסונים של GRNs, העצב maxillary גם נושאת סיבים מכאנסנסורי. לכן, ניתן להקליט נוירונים mechanosensory במקום, או בנוסף, GRNs. עם זאת, מערכת משלוח טסטנט נועד לספק קלט מכני קבוע לאורך הניסוי מה שעושה את זה סביר כי התגובות טסטנט יהיה מבולבל על ידי תגובות הרכיב המכני של המסירה שלה. נוירונים המגיבים על כמה טעימות אחרות אבל לא, או בדרכים שונות טעימות שונות, ניתן לסווג באופן חד משמעי כמו GRNs. אנו ממליצים להשתמש בטעמים מדולל טרי כדי למנוע וריאציות ריכוז טסטנט או הרכב בשל השפלה או התייבשות מתחםשל הממס. אנו ממליצים גם לנקות את המערכת באופן קבוע כדי למנוע זיהום צינורות ו / או חסימות.
בעיה טכנית אפשרית נוספת היא יחס אות לרעש חלש. בעיה זו יכולה לעתים קרובות להיפתר על ידי rechloriding או התאמת המיקום של האלקטרודה הקרקע אמבטיה. פתרונות אחרים עשויים לדרוש מיגון ומזעור אורך של כל חיבור חשמלי במנגנון.
לבסוף, חשוב לציין כי ניתוח נכון של נתונים שהושגו באמצעות הקלטות tetrode דורש מיון ספייק זהיר. מצאנו כי שיטות אוטומטיות לחלוטין הם בדרך כלל לקוי. אנו ממליצים להכיר את הספייק מיון מיון לפני ניתוח tetrode נתונים 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .
חלופות פרו לנתיחה שלנוTocol ניתן להשתמש. כאן, תיארנו דיסקציה דרך החלק הגחון של ראש העש, מתן גישה העצבים מקסימילרי SEZ, אבל אפשר גם לגשת מבנים אלה על ידי לנתח את הצד הגבי. מצאנו כי הכנת הצד הגבי אינה אופטימלית להכנת הקלטות מהמבנים המבעבעים הללו בשל מיקומם העמוק, אך הכנה זו מציעה את היתרון של הפעלת הקלטות ממבנים מסדר גבוה יותר, כגון גוף הפטרייה, אזור שקשור לרבים – אינטגרציה חושית, למידה אסוציאטיבית ועיבוד זיכרון 34 . התמקדנו בשימוש של אלקטרודות tetrode כדי להקליט מן העצב maxillary, אבל, כפי שאנו באיור, אלקטרודות חד תאיים סטנדרטיים יכול לשמש גם למטרה זו. בנוסף, שתי הטכניקות ניתן לשלב לבצע הקלטות בו זמנית מאזורים מרובים במוח 10 . ספרות המוח מציעה דוגמאות רבות של iמודלים של חוליות אשר הוכיחו להיות כלים רבי עוצמה לחשיפת העקרונות הבסיסיים של עיבוד חושי, כגון קידוד הריח, החלים על חרקים ועל חוליות 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . אנו מקווים שהשיטות שלנו יובילו לתובנות חדשות יסודיות על קידוד מתסכל.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק פנימי בין NIH-NICHD ל- MS אנו מודים G. Dold ו T. טלבוט של NIH-NIMH מכשור מתקן הליבה לעזרה עם עיצוב מערכת משלוח טסטנט.
Dissection and specimen preparation | |||
Polypropylene tube, 15 ml -Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2" | MONOJET | 888200144 | For aplying air to remove the hair from the moth. |
Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
Petri dish-100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
Pipette tip (1-200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
Electric waxer | Almore International | 66000 | |
Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non nervous tissue. |
Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non nervous tissue. |
Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervious tissue. |
Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
Epoxy | Permatex | 84101 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline perfusion system | |||
Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tastant delivery system | |||
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories. |
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor . |
Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Electrophysiology Equipment | |||
D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode . |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tastants | |||
KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |