我们提出三种新的方法来研究味觉编码。我们使用简单的动物Manduca sexta( Manduca )描述了一种解剖方案,使用细胞外tetrodes来记录多种味觉受体神经元的活性,以及用于递送和监测精确定时的滋味脉冲的系统。
味觉让动物能够检测环境中的化学物质,从而产生对生存至关重要的行为。当味觉受体神经元(GRN)检测到滋养分子时,它们将关于促进剂的身份和浓度的信息作为电活动的模式编码,然后传播到脑中的跟随神经元。这些模式构成了味觉的内在表征,然后允许动物选择动作并形成记忆。使用相对简单的动物模型一直是研究感官编码中基本原理的有力工具。在这里,我们提出了三种新的方法来研究使用飞蛾Manduca sexta的味觉编码。首先,我们提出了一个解剖程序,用于暴露上颌神经和亚食管区(SEZ),从而记录来自其轴突的GRN的活动。其次,我们描述了使用细胞外电极记录多个GRN的活动电线直接进入上颌神经。第三,我们提出了一个新的系统,以高时间精度传送和监测不同口味的脉冲。这些方法允许在递送前,之前和之后直接从GRNs 体内表征神经元反应。我们提供从多个GRN记录的电压迹线的示例,并提供了如何将尖峰分类技术应用于数据以识别个体神经元的响应的示例。最后,为了验证我们的记录方法,我们将从GRNs获得的细胞外记录与四极杆比较,用锐利的玻璃电极获得的细胞内记录。
味觉和嗅觉系统在环境中产生化学物质的内部表征,分别引起口味和气味的看法。这些化学感觉对于引发许多对生物存活至关重要的行为至关重要,从寻找伴侣和膳食到避免捕食者和毒素。当环境化学物质与感官受体细胞质膜中的受体相互作用时,该过程开始;这些细胞直接或通过与神经元的相互作用,将关于化学物质的身份和浓度的信息转化为电信号。然后将这些信号传输到高阶神经元和其他脑结构。随着这些步骤的进行,原始信号总是发生变化,促进生物体检测,区分,分类,比较和存储感官信息的能力,并选择适当的动作。了解胸罩如何在转化关于环境化学品的信息以最佳地执行各种任务是神经科学的一个基本问题。
风味编码被认为是相对简单的:广泛观点认为,引起味道的每种化学分子(“促味剂”)自然属于大约五种基本味道之一( 即甜,苦,酸) ,咸和鲜) 1 。在这种“基本品味”观点中,味觉系统的工作是确定哪些基本口味是存在的。此外,神经系统中基本味觉表现的神经机制尚不清楚,并被认为是由“标记线” 2,3,4,5,6或“跨纤维图案” 7 </sup> , 8代码。在标记的线代码中,每个感觉细胞及其每个神经追随者对单一味道质量进行响应,共同形成了专门用于该味道的中枢神经系统中较高处理中心的直接和独立的通道。相比之下,在跨纤维图案代码中,每个感觉细胞可以响应多种味道品质,使得关于滋味剂的信息由感觉神经元群体的总体反应表示。味觉信息是通过基本口味,通过标签线还是通过其他机制来表达,目前尚不清楚,是近期调查的焦点3,8,9,10,11,12 。我们自己最近的工作表明,味觉系统使用时空人口代码来产生个人口味的代表,而不是基本的口味类别10 。
在这里,我们提供3种新工具来协助味觉编码的研究。首先,我们建议使用hawkmoth Manduca sexta作为一种相对简单的模型生物,适合电生理学研究的味道,并描述一种解剖程序。第二,我们建议使用细胞外“tetrodes”来记录个体GRN的活动。第三,我们建议一种新的设备,用于交付和监测精确定时的动物脉搏。这些工具根据我们实验室和其他人用来研究嗅觉系统的技术进行了改编。
昆虫如果蝇果蝇 , 美洲蝗虫蝗虫以及蛾蛾属性,已经为数十年提供了强大的资源来了解关于神经的基本原理vous系统,包括感觉编码( 例如,嗅觉13 )。在哺乳动物中,味觉受体是通过复杂的第二信使途径1,4通过神经元通信的特殊细胞。它在昆虫中更简单:它们的味觉受体是神经元。此外,靠近周边的哺乳动物味道相对复杂,具有多个平行的神经路线,重要的组成部分具有挑战性,容纳在小骨骼结构15中 。昆虫味道似乎更简单。在昆虫中,GRN被包含在称为感觉器的专门结构中,位于天线,口器,翼和腿16,17中 。 GRN直接投放到食管区(SEZ),这个结构的作用被认为主要是味觉17 ,其中包含二次味觉神经元10 。从那里,信息传播到身体来驱动反射,并且到更高的脑区被整合,存储,并最终推动行为选择16 。
有必要表征外部味道反应,以了解品味信息如何在整个神经系统中从点到点传播和转化。直接监测昆虫GRNs神经活动的最常用的方法是尖端记录技术12,18,19,20,21,22,23。这包括将电极直接放置在感官上,其中许多是相对容易进入的。滋味剂包含在电极内,允许一个激活和分开测量GRNs在感觉中的神经元反应。但是,因为滋味剂被包含在电极中,所以不可能在促进剂被递送之前或之后除去之前测量GRN活性,或者不更换电极20来交换促味剂。另一种方法,即“侧壁”记录技术,也被用来记录GRNs的活动。这里,将记录电极插入感官敏感剂24的基底中,并且通过感觉尖端上的分离的玻璃毛细管递送促味剂。两种技术都限制从GRN到特定感官的记录。在这里,我们建议一种新技术:从随机选择的来自不同感官的GRN轴突记录,同时分别将味觉提供给长鼻子。轴突记录是通过将锋利的玻璃电极或细胞外电极束(tetrodes)放入神经中实现的,该神经带有轴突长颈鹿的GRNs经济特区10 。在Manduca ,这些轴突穿过已知是纯粹传入的上颌神经,允许明确记录感觉反应25 。这种从轴突记录的方法允许在两个以上的时间内稳定测量GRN反应之前,之后和之后的一系列促销发表。
在这里,我们描述了一种将上颌神经与SEZ一起暴露的解剖程序,这可以允许在SEZ 10中同时记录多个GRN和神经元的反应。我们还描述了使用定制的4通道扭绞线四极杆对GRN的细胞外记录的使用,当与尖峰分选方法组合时,可以同时分析多个(在我们手中,最多六个)GRN。我们进一步比较用tetrodes制作的记录与用细胞内的细胞制成的记录电极。最后,我们描述一种用于提供滋味刺激的新设备。改良了许多研究人员在嗅觉研究中长期使用的设备,以提供嗅觉研究中的气味,我们的新仪器提供了研究气味的优势:改进了以前的多通道传送系统,如Stürckow及其同事开发的(参见参考文献26,27 ),我们的设备实现了精确在提供该定时的电压读数的同时控制促味剂递送的定时;并且它允许快速,顺序地递送多个滋补刺激10 。该设备以恒定的清洁水流将吸鼻涕浸入其中可以输送滋味的受控脉冲。每个滋味脉冲通过长鼻子,然后洗去。滋味剂含有少量无味的食物着色,允许颜色传感器以准确的时间监测滋味卵的通过呃长鼻
这里描述的方法允许来自相对简单的动物,人类性别的体内记录,以在促进递送之前,期间和之后的长时间(超过2小时)表征多个随机选择的GRN的活性。这些方法还允许用精确的时间控制快速,顺序递送多种滋味刺激,这些优点可用于研究基于滋味表现的神经机制。该协议已经被用于研究当通过与单神经元连接的中间神经元10同时监测GRN时,它们在传播给突触后靶向神经元( 例如,在经济特区)中时,GRNs对滋味物的反应如何变换。此外,这些方法可以适应实验者的需求,允许执行复杂的范例来研究味觉编码的基本方面。
开始时我们的研究,我们有时必须解决的一个技术问题是无法用四极线检测上颌神经的尖峰信号。可能的原因是多样的,因为解剖方案是具有挑战性的,一些做法是必要的,以获得良好的准备。首先,在飞蛾解剖期间,上颌神经容易损伤,特别是在去除围绕神经组织的鞘时。第二,如果护套没有完全去除,四极线可能无法进入神经。在这两种情况下,开始新的准备工作通常是解决这些问题的最简单的方法。第三,四极线可能有问题。这可以通过测量在1kHz时应为〜270kΩ的电线的阻抗来检查。如果阻抗值高于〜300kΩ,请用金电镀电线以达到所需的阻抗(参见参考文献30 )。第四,一件设备可能被误连接或行为不端。
另一个可能的问题是记录尖峰信号,但是神经元似乎对这些促味剂没有反应。这可能是因为记录的神经元对递送的一组滋味不敏感。同样重要的是要记住,除了GRNs的轴突之外,上颌神经还带有机械感觉纤维。因此,可以从机械感觉神经元记录,而不是或除了GRN之外。然而,味觉递送系统被设计为在整个实验中提供恒定的机械输入,使得不太可能通过对其递送的机械部件的响应来混淆对促味剂的反应。响应某些但不是其他美味的神经元,或以不同的方式对不同的美味食物进行反应,可以明确地分类为GRNs。我们建议使用新鲜稀释的滋味剂,以避免由于化合物降解或蒸发引起的滋味浓度或成分的变化的溶剂。我们还建议定期清洁系统,以避免管道污染和/或障碍物。
另一个可能的技术问题是不利的信噪比。这个问题通常可以通过重新洗涤或调整浴接地电极的位置来解决。其他解决方案可能需要屏蔽并最小化设备中每个电气连接的长度。
最后,重要的是要注意,使用四极记录获得的数据的正确分析需要仔细的尖峰分选。我们发现全自动化方法一般不足。我们建议在分析四极数据10,29,31,32,33之前熟悉穗分类文献。
我们解剖专业的替代品可以使用tocol。在这里,我们通过蛾头的腹侧部分描述了一个解剖,提供进入上颌神经和经济特区,但也可以通过背侧解剖来访问这些结构。我们发现背面制剂由于其位置较深而不适合从这些味觉结构进行记录,但是这种制剂确实具有使得能够从高级结构记录的优点,例如蘑菇体,已经与多个相关联的区域感知整合,关联学习和记忆处理34 。我们专注于使用四极电极从上颌神经记录,但是,正如我们所示,标准的细胞内尖锐电极也可以用于此目的。此外,两种技术可以组合以执行来自多个脑区域10的同时记录。神经科学文献提供了许多例子已经被证明是用于揭示感觉处理的基本原理(例如嗅觉编码)的有力工具,其适用于昆虫和脊椎动物35,36,37,38,39 。我们希望我们的方法将引导关于味觉编码的基本新见解。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH-NICHD向MS的校内资助。我们感谢NIH-NIMH仪器核心设施的G.Dold和T. Talbot,协助设计了促销系统。
Dissection and specimen preparation | |||
Polypropylene tube, 15 ml -Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
Needle, Short bevel, 19G x 1-1/2" | MONOJET | 888200144 | For aplying air to remove the hair from the moth. |
Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
Petri dish-100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
Pipette tip (1-200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
Electric waxer | Almore International | 66000 | |
Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non nervous tissue. |
Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non nervous tissue. |
Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervious tissue. |
Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
Epoxy | Permatex | 84101 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline perfusion system | |||
Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tastant delivery system | |||
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controler and fitting accesories. |
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor . |
Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moths proboscis into the proboscis hole from the rigid tube. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Electrophysiology Equipment | |||
D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precicely insert the tetrodes into the animals brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode . |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tastants | |||
KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |