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Neuroscience

गुस्ताखी कोडिंग अध्ययन करने के लिए नए तरीके

doi: 10.3791/55868 Published: June 29, 2017
* These authors contributed equally

Summary

हम ग्लैस्टर कोडिंग का अध्ययन करने के लिए तीन नए तरीके पेश करते हैं एक सरल पशु, मोंडुका सेफ्टा (मंडुका) की मस्ती का उपयोग करते हुए, हम एक विच्छेदन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो कि स्टेरस्युलुलर टेट्रोड का उपयोग करने के लिए कई ग्लैस्टर रिसेप्टर न्यूरॉन्स की गतिविधि रिकॉर्ड करता है, और तस्करों के ठीक समय पर दालों को वितरित करने और निगरानी करने की एक प्रणाली है।

Abstract

स्वाद की भावना पशुओं को पर्यावरण में रसायनों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, जिससे जीवित रहने के लिए महत्वपूर्ण व्यवहार पैदा होता है। जब रूचिकर रिसेप्टर न्यूरॉन्स (जीआरएन) स्टेस्टेंट अणुओं का पता लगाते हैं, तो वे स्वाद के बारे में सूचना और तेंदुए की एकाग्रता के बारे में जानकारी देते हैं, जो कि मस्तिष्क में अनुयायी न्यूरॉन्स के लिए प्रचार करते हैं। ये पैटर्न तात्विक के आंतरिक प्रस्तुतीकरण का गठन करते हैं, जो तब जानवरों को क्रियाओं और फार्म यादों का चयन करने की अनुमति देता है। संवेदी कोडिंग में बुनियादी सिद्धांतों का अध्ययन करने के लिए अपेक्षाकृत सरल पशु मॉडल का उपयोग एक शक्तिशाली उपकरण रहा है। यहां, हम मोंडुका सेन्स्टा की पतंग का उपयोग करके ग्लैस्टर कोडिंग का अध्ययन करने के लिए तीन नए तरीकों का प्रस्ताव करते हैं। सबसे पहले, हम एक्सीक्शन प्रक्रिया को एक्सिलोनी नसों और उपसमूह क्षेत्र (एसईजेड) को उजागर करने के लिए पेश करते हैं, जो उनके एक्सॉन से जीआरएन की गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। दूसरा, हम टी रखकर कई जीआरएन की गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए बाह्य इलेक्ट्रोड के उपयोग का वर्णन करते हैंतंतुओं के तारों को सीधे तंत्रिका तंत्र में सीधे तीसरा, हम उच्च तात्कालिक परिशुद्धता के साथ, अलग-अलग स्वाद के दालों के वितरण और निगरानी के लिए एक नई प्रणाली पेश करते हैं। इन विधियों से जीवाणुओं से सीधे स्विस में न्यूरॉन संबंधी प्रतिक्रियाओं को लक्षण वर्णन करने की अनुमति मिलती है, इसके दौरान और बाद में स्तनपान दिया जाता है। हम कई जीआरएन से दर्ज वोल्टेज निशान के उदाहरण प्रदान करते हैं, और एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं की पहचान करने के लिए एक स्पाइक सॉर्टिंग तकनीक कैसे लागू हो सकती है। अंत में, हमारे रिकॉर्डिंग दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए, हम जीआरएन से प्राप्त टेस्टोड्स के साथ तेज कांच इलेक्ट्रोड से प्राप्त इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग के लिए बाह्य रिकॉर्डिंग की तुलना करते हैं।

Introduction

स्वाद और घृणित सिस्टम पर्यावरण में रसायनों के आंतरिक प्रतिनिधित्व को उत्पन्न करते हैं, जो क्रमशः स्वाद और गंध की धारणाओं को जन्म देते हैं। इन रासायनिक इंद्रियों जीवों के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण कई व्यवहारों को हासिल करने के लिए जरूरी हैं, जो साथी और भोजन को शिकारियों और विषाक्त पदार्थों से बचाते हैं। प्रक्रिया शुरू होती है जब पर्यावरण रसायन संवेदी रिसेप्टर कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में स्थित रिसेप्टर्स के साथ बातचीत करते हैं; इन कोशिकाओं, सीधे या न्यूरॉन्स के साथ बातचीत के माध्यम से, बिजली के संकेतों में पहचान और रसायनों की एकाग्रता के बारे में जानकारी transduce। तब ये संकेत उच्च क्रम न्यूरॉन्स और अन्य मस्तिष्क संरचनाओं के लिए प्रेषित होते हैं। इन चरणों की प्रगति के रूप में, मूल संकेत हमेशा परिवर्तनों से गुज़रता है, जो संवेदी जानकारी का पता लगाने, भेदभाव, वर्गीकृत, तुलना और संचय करने के लिए जीव की क्षमता को बढ़ावा देते हैं, और एक उपयुक्त कार्रवाई चुनने के लिए। समझ कैसे ब्रामें पर्यावरणीय रसायनों के बारे में जानकारी को विभिन्न प्रकार के कार्यों में सर्वश्रेष्ठ रूप से बदलने के लिए न्यूरोसाइंस में एक बुनियादी सवाल है।

घृणित कोडिंग अपेक्षाकृत सरल माना गया है: एक व्यापक रूप से आयोजित दृष्टिकोण यह मानता है कि हर रासायनिक अणु जो स्वाद (एक "स्वाद") को प्राप्त करता है, स्वाभाविक रूप से लगभग पांच या तो बुनियादी स्वाद गुणों ( अर्थात मीठा, कड़वा, खट्टा , नमकीन और उमामी) 1 इस "बुनियादी स्वाद" दृश्य में, स्वाद का तंत्र का काम यह निर्धारित करना है कि इन बुनियादी स्वादों में से कौन सा मौजूद है। इसके अलावा, तंत्रिका तंत्र में बुनियादी स्वाद का प्रतिनिधित्व करने वाले तंत्रिका तंत्र स्पष्ट नहीं हैं, और यह "लेबल लाइन" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 या "फाइबर पैटर्न के पार" 7 द्वारा शासित होने का अनुमान है। , 8 कोड एक लेबल वाले कोड में, प्रत्येक संवेदी कोशिका और प्रत्येक तंत्रिका अनुयायियों को एक स्वाद की गुणवत्ता का जवाब मिलता है, साथ ही इस स्वाद के लिए समर्पित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उच्च प्रोसेसिंग केंद्रों के लिए सीधे और स्वतंत्र चैनल का गठन होता है। इसके विपरीत, एक फाइबर पैटर्न कोड में, प्रत्येक संवेदी सेल कई स्वाद गुणों का जवाब दे सकता है जिससे कि स्वाद के बारे में जानकारी संवेदी न्यूरॉन्स की आबादी के समग्र प्रतिक्रिया से दर्शायी जाती है। चाहे स्वादिष्ट सूचनाएं मूलभूत स्वादों, लेबल वाली रेखाओं के माध्यम से, या किसी अन्य तंत्र के माध्यम से प्रदर्शित की जाती हैं, यह अस्पष्ट है और हाल ही में 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 की जांच का फ़ोकस है। हमारे अपने हाल के काम से पता चलता है कि स्नेही प्रणाली उत्पन्न करने के लिए एक spatiotemporal जनसंख्या कोड का उपयोग करता हैबुनियादी स्वाद श्रेणियों के बजाय व्यक्तिगत टीचरों का प्रतिनिधित्व

यहां हम स्वाद का कोडिंग के अध्ययन में सहायता के लिए 3 नए टूल प्रदान करते हैं। सबसे पहले, हम हॉक्वमोथ मंडुका सेक्स्टा का इस्तेमाल अपेक्षाकृत सरल मॉडल जीव के रूप में करते हैं, जो स्वाद के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए उत्तरदायी है और विच्छेदन प्रक्रिया का वर्णन करता है। दूसरा, हम व्यक्तिगत जीआरएन की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए बाह्य "टेट्रोड" का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। और तीसरा, हम पशु को तस्सैल के ठीक समय पर दालों को वितरित करने और निगरानी करने के लिए एक नया उपकरण सुझाते हैं। इन उपकरणों को हमारी प्रयोगशाला और अन्य तकनीकों से अनुकूलित किया गया था जो घ्राण प्रणाली का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता था।

फलों के उड़ने जैसे ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर , टिड्डिस शिस्टोकेर्का अमेरीकाना और साथ ही कीट मंडुका सेफ्टा जैसे किड़े, दशकों तक नेताओं के बारे में बुनियादी सिद्धांतों को समझने के लिए शक्तिशाली संसाधन प्रदान किए हैंसंवेदी कोडिंग ( जैसे, ऑल्फ़ैक्शन 13 ) सहित vous सिस्टम। स्तनधारियों में, स्वाद रिसेप्टर विशिष्ट कोशिकाएं हैं जो कि जटिल द्वितीय-दूत मार्गों 1 , 14 के माध्यम से न्यूरॉन्स के साथ संवाद करते हैं। यह कीड़ों में सरल है: उनके स्वाद रिसेप्टर्स न्यूरॉन्स हैं। इसके अलावा, परिधि के पास स्तनधारी स्वाद पथ अपेक्षाकृत जटिल हैं, जिसमें कई, समानांतर तंत्रिका मार्ग शामिल हैं, और महत्वपूर्ण घटकों का उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, जिनमें छोटे बोनी संरचनाएं 15 कीट स्वाद के रास्ते सरल लगते हैं। कीड़ों में जीआरएन विशेष संश्लेषण में समाहित होती हैं जिन्हें एंटीना, माउंपर, पंख और पैर 16 , 17 में स्थित सेंसिला कहा जाता है। जीआरएन सीधे सबोसोफेगल ज़ोन (एसईजेड) को एक परियोजना बनाते हैं, जिनकी भूमिका को मुख्य रूप से स्नेही 17 माना जाता है, और जिसमें दूसरा क्रम होता हैस्वाद न्यूरॉन्स 10 वहां से सूचना शरीर को सजगता चलाने के लिए यात्रा करती है, और अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों को एकीकृत, संग्रहित करने और अंततः व्यवहार विकल्पों को चलाने के लिए 16

परिधीय स्वाद की प्रतिक्रियाओं को समझना आवश्यक है कि स्वाद की जानकारी कैसे फैल गई है और तंत्रिका तंत्र में बिंदु से लेकर पूरे बिंदु तक बदल जाती है। कीड़ों में जीआरएन की तंत्रिका गतिविधि की निगरानी करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका टिप-रिकॉर्डिंग तकनीक 12 , 18 , 1 9 , 20 , 21 , 22 , 23 है । इसमें एक इलेक्ट्रोड सीधे एक संवेदी पर रखा जाता है, जिनमें से कई अपेक्षाकृत आसानी से पहुंचते हैं। स्वाद इलेक्ट्रोड के अंदर शामिल किया गया है, जिससे कि एक को सक्रिय और विस्तारित किया जा सकता हैसंवेदीकरण में जीआरएन के न्यूरॉनल प्रतिक्रियाओं के बारे में racellularly उपाय लेकिन, क्योंकि स्वाद इलेक्ट्रोड में निहित है, तात्पर्य को हटाया जाने के बाद जीआरएन गतिविधि को मापना संभव नहीं है या इलेक्ट्रोड 20 की जगह के बिना चश्मदीद का आदान-प्रदान करने के लिए संभव है। एक अन्य विधि, "साइड-वॉल" रिकॉर्डिंग तकनीक, का उपयोग जीआरएन की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए भी किया गया है। यहाँ, एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को स्वाद संवेदी 24 के आधार में डाला जाता है, और सेंथिलम की नोक पर एक अलग गिलास केशिका के माध्यम से टैस्टेंट दिया जाता है। दोनों तकनीकों को जीआरएन से एक विशेष संवेदना तक रिकॉर्ड करना प्रतिबंधित है। यहाँ, हम एक नई तकनीक का सुझाव देते हैं: अलग-अलग संवेदी से यादृच्छिक रूप से चयनित जीआरएन एक्सॉनों से रिकॉर्डिंग करते हुए, जबकि अलग-अलग स्वादुस्सैस को संदेह के रूप में वितरित करते हैं। ऐक्सोन रिकॉर्डिंग को तेज ग्लास इलेक्ट्रोड या बाह्य इलेक्ट्रोड बंडलों (टेट्रॉड्स) को तंत्रिका में रखा जाता है जो कि एसिन्स से युक्त होते हैंजीईआरएस एसईजेड 10 को संदेह में मंडुका में , ये एक्सॉन अधिकाधिक तंत्रिका को पार करते हैं, जो कि विशुद्ध रूप से अभिवाही होने के लिए जाना जाता है, जिससे संवेदी प्रतिक्रियाओं की स्पष्ट रिकॉर्डिंग 25 हो सकती है । अक्षांश से रिकॉर्डिंग की इस पद्धति, दो घंटे से अधिक समय तक, स्वाद के प्रस्तुतियों की श्रृंखला के दौरान और बाद में, जीआरएन प्रतिक्रियाओं के स्थिर माप के लिए अनुमति देता है।

यहां, हम एसईजेड के साथ उपकला तंत्रिकाओं को उजागर करने के लिए एक विच्छेदन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जो एसईजेड 10 में कई जीआरएन और न्यूरॉन्स की प्रतिक्रियाओं को एक साथ रिकॉर्ड करने की अनुमति दे सकता है। हम कस्टम-निर्मित 4-चैनल मुड़ तार टेदरोड का उपयोग करते हुए जीआरएन के बाह्य रिकॉर्डिंग के उपयोग का भी वर्णन करते हैं, जो एक स्पाइक सॉर्टिंग पद्धति के साथ मिलकर कई (हमारे हाथों में), जीआरएन के साथ-साथ एक साथ विश्लेषण करती है। हम टेस्टोड के साथ रिकॉर्डिंग की तुलना में तीव्र इंट्रासेल्युलर के साथ बनाए गए रिकॉर्डिंग की तुलना करते हैंइलेक्ट्रोड। अंत में, हम स्वादित उत्तेजनाओं को वितरित करने के लिए एक नए उपकरण का वर्णन करते हैं। कई शोधकर्ताओं द्वारा लंबे समय तक ऑल्फ़ाफी अध्ययन में सुगंध वितरित करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले उपकरणों से अनुकूलित किया गया, हमारे नए उपकरण में गैस्टेशन के अध्ययन के लिए फायदे हैं: पिछले मल्टीचैनल डिलीवरी सिस्टम जैसे स्ट्रर्को और सहयोगियों द्वारा विकसित (जैसे संदर्भ 26 , 27 देखें ) में सुधार, हमारे उपकरण सटीक इस समय के एक वोल्टेज readout प्रदान करते हुए स्वाभाविक वितरण के समय पर नियंत्रण; और यह कई स्वादित उत्तेजनाओं 10 के तीव्र, अनुक्रमिक वितरण की अनुमति देता है। तंत्र स्वच्छ पानी के निरंतर प्रवाह में सूंड की जांच करता है जिसमें स्वादिष्ट दालों को नियंत्रित किया जा सकता है। प्रत्येक स्वाद नब्ज गुंडों से गुजरता है और फिर इसे धोया जाता है टेस्टेंट में बेस्वाद खाद्य रंगों की एक छोटी मात्रा होती है, जिससे एक रंग संवेदक को मॉनिटर करने की अनुमति मिलती है, सटीक समय के साथ, स्वादिष्ट ओव का मार्गह्रास के एर

Protocol

सावधानी: मंडुका द्वारा जारी किए गए ठीक, पाउडर स्केल, एलर्जीक हो सकते हैं ताकि प्रयोगशाला सुरक्षा दस्ताने का उपयोग किया जा सके और चेहरे का मुखौटा अनुशंसित हो।

मैंडिलरी नर्वस और एसईजेड को प्रकट करने के लिए मंडुका सेफ्टा का विच्छेदन

  1. निम्न विशेषताओं के आधार पर या तो सेक्स की एक उपयुक्त पतंग चुनें: सामान्य स्वभाव के साथ ग्रहण के तीन दिन बाद (पंखों को पूरी तरह से बढ़ाया जाना चाहिए, और सूंड और एंटीना बरकरार होना चाहिए)।
    1. परिवहन के लिए एक प्लास्टिक कप में अलग-अलग कीट को रखें।
  2. एक पॉलीप्रोपीलेन ट्यूब में कीट डालें।
    सावधानी: हम पतले झूले को फैलाने से रोकने के लिए इस चरण को एक धूमिल हुड में करने की सलाह देते हैं।
    1. ट्यूब थोड़ी अधिक लंबी होनी चाहिए कि पतंग का शरीर ( चित्रा 1 ए )। ट्यूब 15 एमएल पॉलीप्रोपीलेन ट्यूब काटने के द्वारा किया जा सकता है।
    2. <Li> जब तक सिर उजागर नहीं हो जाता है, तब तक कीट को पुश करें और ट्यूब के दूसरे छोर पर बोल्ड-अप टिशू पेपर डालें जिससे कि पतंग को स्थिर रखने में मदद मिल सके ( चित्रा 1 ए )।
  3. उस पर दबाव हवा को उड़ाने से पतंग के उजागर सिर (उदर और पृष्ठीय) से बाल निकालें
    1. एक एयर जेट को एक सिरिंज (एक सुई के साथ 1 एमएल, लगभग 1.4 मिमी के आसपास आईडी, तेज तीखी हटाने के साथ) दबाव हवा के स्रोत से जोड़ा जा सकता है।
      नोट: बाल निकालने के बाद, सभी निम्नलिखित चरणों को धूआं हुड के बाहर किया जा सकता है।
  4. एक बार जब ज्यादातर बाल निकाल दिए जाते हैं, तो ट्यूब को एक होल्डिंग चैंबर में रखकर सिर के पृष्ठीय भाग के साथ सामना करना पड़ता है, जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।
    1. पेट्री डिश पर, 7 सेमी लंबा, 2.5 सेमी ऊंची ( चित्रा 1 बी ) के बारे में त्रिकोणीय आधार बनाने के लिए मॉडलिंग मिट्टी का उपयोग करें।


चित्रा 1 : मंडिक्का के विच्छेदन कक्ष की तैयारी ( ) एक ट्यूब में एक कीट को रोक दिया गया है। सिर को एक छोर पर उजागर किया जाता है, जबकि दूसरे छोर को टिशू पेपर के साथ जोड़ा जाता है। ( बी ) एक पेटी डिश और मॉडलिंग मिट्टी से बना एक विच्छेदन कक्ष दिखाया गया है। सिर के पृष्ठीय भाग का सामना करना पड़ रहा है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

  1. एंटीना और सूंड की रक्षा करें
    1. लंबाई के बारे में 0.5 सेंटीमीटर के 3 टुकड़ों में रेज़र ब्लेड के साथ एक विंदुक टिप (पीले रंग की टिप्स, 1-200 μL) काटने के द्वारा 3 छोटे ट्यूबों को तैयार करें। आंतरिक व्यास बहुत बड़ा होना चाहिए ताकि ऐन्टेना और सूंड से भस्म हो सके।
    2. द्वारा एक हुक तैयारएक तार (22 एडब्ल्यूजी, लगभग 7 सेंटीमीटर लंबा) झुकाव कीट की सूंड को बढ़ाएं और फिर इसे छोटी हड्डियों में से एक में तार के हुक के माध्यम से खींचकर तब तक सम्मिलित करें जब तक कि ट्यूब संदेह के समीपस्थ भाग तक नहीं पहुंचता है।
    3. पतंग बाटिक मोम के साथ छोटी ट्यूब को सुरक्षित करें (उदाहरण के लिए, एक दंत विद्युत मोक्स को पिघल और मोम को निर्देशित करने के लिए) पतंग के सिर-कैप्सूल ( चित्रा 2 ए बाएं) के पृष्ठीय भाग में।
    4. प्रत्येक एंटीना को एक ट्यूब में रखें और चित्रा 2 ए (बाएं) में दिखाए गए अनुसार बाटिक मोम के साथ ट्यूब सुरक्षित करें। गर्म मोम के साथ एंटीना को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सावधान रहें।
  2. मस्तिष्क की पूर्वकाल की सतह को कवर करने वाली मांसपेशियों को काटने के द्वारा आंदोलन के खिलाफ मस्तिष्क स्थिर करें ( अर्थात बुक्कल कंप्रेसर मांसपेशियों)
    1. विच्छेदन खुर्दबीन के तहत, सूक्ष्म विच्छेदन कैंची या एक मिनी कुल्हाड़ी का प्रयोग करें जो एक रेजर चिप से टूथपीक से चिपके रहता है जिससे सिर कैप्सूल खुली होती है।संदेह के नीचे एक छोटी सी कटौती ( चित्रा 2 ए , बायां ऊपरी अंदरूनी सूत्र)।
    2. बुक्कल कंप्रेसर मांसपेशी को काटने के लिए सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का प्रयोग करें (उदाहरण के लिए संदर्भ देखें 25 )। चूंकि मांसपेशी आसानी से दिखाई नहीं दे रही है, इस बात की पुष्टि करने के लिए निम्नलिखित व्यवहार परीक्षण की सिफारिश की गई है कि यह कट गया है।
    3. एक 1 एम समाधान प्राप्त करने के लिए डिस्टिल्ड वॉटर में स्योरोस को पतला।
    4. संदेह के 2/3 बहिष्कार के लिए 200 μL सुक्रोज़ समाधान के बारे में देने के लिए विंदुक का प्रयोग करें, और 5 मिनट के लिए सूंड का निरीक्षण करें। अगर मांसपेशी ठीक से कीट में काट ली जाती है तो वह सूजन के विस्तार या स्थानांतरित करने में सक्षम नहीं होना चाहिए।
    5. सिर-कैप्सूल में उद्घाटन मुहरने के लिए पिघला हुआ बाटिक मोम की एक परत को लागू करें।
  3. कीट पर फ्लिप करें ताकि सिर-कैप्सूल के उदर की ओर अब का सामना करना पड़ रहा है।
  4. विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान और बाद में खारा छिड़कने के लिए सिर के उदर की ओर एक मोम कप का निर्माणइलेक्ट्रिक वेक्सर जी: विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, पीठ की ओर बढ़ते हुए, सिर के सामने मोम की पहली पंक्ति को लागू करके कप का निर्माण शुरू करें कप के अंदर सूंड और एंटीना ट्यूब रखें ( चित्रा 2 ए दाएं)
    1. आंखों के स्तर तक पहुंचने तक कप के बाहर और ऊपर की तरफ का निर्माण जारी रखें।
  5. संदंश का प्रयोग दो लेबली पेप्पलों में से एक ले जाने के लिए करें, फिर इसे पक्ष में रखें और मोम कप में इसे और अधिक पिघलाया मोम जोड़कर सुरक्षित करें। अन्य मेकिलरी पैपल ( चित्रा 2 ए दाएं) के साथ भी यही करें।
  6. मोम कप और ट्यूबों में किसी भी उद्घाटन को सील करें।
    नोट: इस चरण में एपॉक्सी का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह मोम और ट्यूबों में अंतराल को आसानी से मुहरने में मदद करता है, और ऐन्टेना और प्रोबसिस को किसी भी गर्मी से संबंधित नुकसान से बचा जाता है।
    1. प्लास्टिक मिक्सिंग डिश में बाइनरी एपॉक्सी को मिलाकर दन्तखोड़ी का उपयोग करें। मिक्सिंग डिश रखें।
    2. एक पतली लागू करने के लिए टूथपिक का उपयोग करेंबाहर epoxy की परत और कप के अंदर ( चित्रा 2 बी )।
    3. ट्यूबों में रिक्त स्थान को भरें जो कि प्रोक्सीसिस और एंटीना युक्त होता है, और गर्दन के आसपास के पोलिप्रोपैलीन ट्यूब के हिस्से को भरने के लिए पर्याप्त एपॉक्सी के साथ भरें ( चित्रा 2 बी )।
    4. लगभग 20 मिनट के लिए एपॉक्सी सूख छोड़ दें इसे जांचने के लिए, प्लास्टिक मिक्सिंग डिश में रहने वाले एपॉक्सी का परीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह ठोस है और अब चिपचिपा नहीं है।
    5. मंडुका शारीरिक खारा के साथ मोम कप भरें 28 और सुनिश्चित करें कि कोई लीक नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ मिनट प्रतीक्षा करें। यदि एक रिसाव दिखाई देता है, तो इसे अधिक गर्म मोम और / या एपॉक्सी लगाने से इसे सील करने की कोशिश करें।

चित्र 2
चित्रा 2 : मंडुका तैयार करना <विच्छेदन के लिए / em> ( ) विंदुक से बनाई गई छोटी ट्यूबों के अंदर एंटीना और गॉसोसिस संरक्षित होते हैं जो लंबाई के बारे में 0.5 सेंटीमीटर के तीन टुकड़ों में कटौती करते हैं। (वाम पैनल, बड़ी छवि) ट्यूबों को सिर के पृष्ठीय भाग के आसपास लागू पिघले बाटिक मोम से सुरक्षित किया जाता है। (वाम पैनल, इनसेट) बुक्कल कंप्रेसर मांसपेशियों को निकालने के लिए, सिर कैप्सूल के पृष्ठीय पक्ष को एक छोटी कटौती करके बड़ी छवि में बिंदीदार रेखा से दर्शाया गया है। (दाएं पैनल) विच्छेदन प्रक्रिया और रिकॉर्डिंग प्रयोगों के दौरान ख़राब खारा के लिए एक जलाशय के रूप में एक मोम कप सिर के ऊतक पक्ष के आसपास बनाया गया है। ( बी ) एपॉक्सी का उपयोग मोम कप के आधार और सिर के पृष्ठीय भाग (बाएं पैनल) के बीच अंतराल को सील करने के लिए किया जाता है, और मोम और ट्यूबों के उद्घाटन (सही पैनल सहित एंटीना और सूंड युक्त ट्यूबों के बीच) )। कृपया यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखें

  1. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, लेबली पेल्प्स को काटने के लिए सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का उपयोग करें।
  2. सूक्ष्म विच्छेदन कैंची या एक मिनी-कुल्हाड़ी का प्रयोग करें जो चार कटौती करके सिर कैप्सूल के उदर की ओर खुलने के लिए उपयोग करता है: छिद्र के साथ दो कटौती जो पीछे से सामने प्रत्येक आंख को घेर लेता है, सिर के पीछे की छल्ली पर एक कट, और सूजन के सामने सिर के सामने छल्ली पर एक कट ( चित्रा 3 ए )।
  3. धीरे से मस्तिष्क को बेनकाब करने के लिए सूक्ष्म विच्छेदन संदंश का उपयोग कर छल्ली को हटा दें।
  4. धीरे-धीरे दो तेज सूक्ष्म विच्छेदन संदंश का उपयोग करके और सावधानीपूर्वक सेज को कवर करने वाले वसा वाले ऊतक और ट्रेकिआ को हटा दें। मस्तिष्क या तंत्रिकाओं (जैसे, अधिशमी तंत्रिका, ऑप्टिक तंत्रिका, ग्रीवा संयोजक) को किसी भी क्षति से बचें। खमीर समाधान की जगह अक्सर मस्तिष्क को कुल्ला, और बेहतर दृश्यता के लिए अक्सर प्रकाश समायोजित करें। नोट: यह di का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा हो सकता हैssection; यह अनजाने में ट्यूबलिंग या पेराशिंग द्वारा अतिसंवेदनशील तंत्रिका को नुकसान पहुंचाते हुए आसान है।
    नोट: इस बिंदु पर एसईजेड और मेकिलरी नसों को स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए ( चित्रा 3 बी -3 सी )। हालांकि, मस्तिष्क और अतिसारी नसों को एक पतली म्यान से कवर किया गया है।
  5. म्यान को हटाने के लिए, 10% (w / v) कोलाजेज़ेज / खारा में भंग के साथ मोम कप में नमक को बदलें और 5 मिनट के लिए इसे जगह छोड़ दें। फिर, खमीर से कई बार मस्तिष्क को धोने के बाद, धीरे-धीरे म्यान को सुपर-सूक्ष्म विच्छेदन संदंश के साथ सेज़ से ऊपर की तरफ नलिका से खींचकर खींच कर खींचें।
  6. ताज़ा नमक के साथ मोम कप को छिड़कना शुरू करें ट्यूब को खारा ड्रिप लाइन से मोम कप में रखें और इसे पिघलाया मोम के साथ सुरक्षित रखें।

चित्र तीन
अंजीरUre 3 : मंडुका विच्छेदन प्रक्रिया। ( ) लेबली पेल्प्स को हटाया गया, सिर कैप्सूल को चार कट बनाकर खोला गया है, जैसा कि बिंदीदार रेखा से दर्शाया गया है। ( बी ) सिर कैप्सूल खोलने और वसा ऊतक और ट्रेकिआ को निकालने के बाद मस्तिष्क की एक बड़ी छवि, अधिकाधिक नसों (एमएक्सएन) और उप-समसामयिक क्षेत्र (एसईजेड) के तहत मस्तिष्क के क्षेत्र के संदर्भ में एक शब्द घेघा)। सुपारी तंत्रिकाएं एसईजेड को संदेह में ग्लूकट रिसेप्टर न्यूरॉन्स (जीआरएन) से एक्सॉन लेती हैं। ( सी ) मंडुका मस्तिष्क के एक योजनाबद्ध। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

2. स्वादिष्ट डिलीवरी सिस्टम

  1. स्वादिष्ट डिलीवरी सिस्टम चार मुख्य तत्वों से बना है: पानी का स्रोत, स्वादयुक्त मैनिफोल्ड, रंग संवेदक, और उस साइट से युक्तसूंड, सभी एक कठोर प्लास्टिक ट्यूब से जुड़े ( चित्रा 4 ए -4 बी )। इस प्रणाली को बनाने के लिए चित्रा 4 बी में दिखाए गए चरणों का पालन करें एक कठोर प्लास्टिक ट्यूब का उपयोग लंबाई में 6 सेंटीमीटर (आईडी 0.3 सेमी) के बराबर करें।
  2. ट्यूब में एक छोटा छेद बनाने के लिए टांका लगाने वाला लोहे का प्रयोग करें जहां संदेह किया जा रहा है ( चित्रा 4 ए -4 बी )।
  3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि विभिन्न जानवरों की संभावनाएं हमेशा एक ही स्थान में रखी जाती हैं, ट्यूब ( चित्रा 4 ए -4 बी ) में प्लास्टिक स्क्रीनिंग सामग्री (जाल, लगभग 0.1 सेमी का छेद आकार) संलग्न करती है । रेजर ब्लेड या रोटरी उपकरण के साथ, हड्डियों के छेद से लगभग 5 मिमी ऊपर कठोर ट्यूब काट दिया जाता है। ट्यूब के दो टुकड़ों के बीच मेष रखें। ट्यूबों के बाहर epoxy को लागू करके जाल को सुरक्षित रखें और ट्यूबों को फिर से कनेक्ट करें। लगभग 20 मिनट के लिए एपॉक्सी सूख छोड़ दें
  4. स्वादिष्ट डिलीवरी के लिए दबाव का उपयोग करेंछिड़काव प्रणाली के रूप में जरूरत के रूप में कई tastant ट्यूबों के साथ, एक मैनिफ़ोल्ड (नीचे देखें) में शामिल हो गए। मेघ के ऊपर 1 सेमी ऊपर कठोर ट्यूब में छोटा छेद बनाने के लिए टांका लगाने का लोहे का उपयोग करें। छिड़काव प्रणाली (आईडी 0.86 मिमी) से निर्वात ट्यूब को कठोर ट्यूब में डालें और इसे इकोक्सी ( चित्रा 4 ए -4 बी ) लगाने से वहां सुरक्षित करें।
  5. डिस्टिल्ड वॉटर के निरंतर प्रवाह (~ 40 एमएल / मिनट) देने के लिए एक पिस्टलास्टिक पंप का उपयोग करें। इसे सिलिकॉन टयूबिंग से कठोर ट्यूब ( चित्रा 4 ए -4 सी ) से कनेक्ट करें। एक बड़ी कचरा कंटेनर ( चित्रा 4 ए -4 सी ) में उत्पादन को निर्देशित करने के लिए कठोर ट्यूब की दूसरी तरफ एक और सिलिकॉन ट्यूब से कनेक्ट करें।
  6. स्वादिष्ट वितरित करने के लिए, संपीड़ित हवा को छिड़काव तंत्र के कई गुना में डालें। यह हासिल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एक वायवीय पंप (10 साई) का उपयोग करके एक समयबद्ध वोल्टेज नाड़ी इनपुट द्वारा नियंत्रित किया जाता है जो कि मैनिफ़ोल में संपीड़ित हवा को इंजेक्ट करता है डी ट्यूब जिसमें वांछित स्वादयुक्त होता है 1 एस पल्स 0.5 एमएल ऑफ टीस्टेंट के बाहर निकलता है।

3. स्वादिष्ट तैयारी और निगरानी स्वादिष्ट डिलीवरी

  1. डिस्टिल्ड वॉटर में चंचल वांछित एकाग्रता को पतला करें। जागरूक रहें कि स्वादिष्ट पानी धारा से आगे पतला हो जाएगा। हमने प्रारंभिक एकाग्रता (77 , संदर्भ देखें) की 77% के रूप में अंतिम संवेदना तक पहुंचने वाली अंतिम एकाग्रता को मापा।
  2. प्रत्येक स्वाद के समाधान के लिए एक कृत्रिम भोजन डाई जोड़ें ताकि सटीक समय का निर्धारण किया जा सके जिसके साथ स्वाद संवेदनाओं से गुजरता हो। हमने पाया है कि 0.05% w / v पर हरे डाई ( सामग्री सूची देखें) मंडुका जीआरएन को सक्रिय नहीं करता है।
  3. स्वादिष्ट समाधानों में खाद्य रंग का पता लगाने के लिए रंग संवेदक का प्रयोग करें (तालिका 1 देखें)। जाल के आस-पास छेद बनाने और छिड़काव प्रणाली के आउटपुट ट्यूब के नीचे 0.5 सेंटीमीटर कम करने के लिए एक सोल्डर लोहे का उपयोग करें ( S = "xfig"> चित्रा 4 ए -4 बी)। सेंसर को कठोर ट्यूब से कनेक्ट करें और इसे सुरक्षित रखें वहां बाहर epoxy को लागू करना।
    1. शारीरिक संकेतों के साथ एक एनालॉग संकेत के रूप में रंग संवेदक वोल्टेज आउटपुट रिकॉर्ड करें (अनुभाग 4 देखें)। रंग सेंसर वोल्टेज संकेत सेंसर ( चित्रा 4 ए ) से जुड़े डीसी एम्पलीफायर का उपयोग करके प्रवर्धित किया जा सकता है।
  4. सुनिश्चित करें कि रंग संवेदक स्ताट को वितरित करके और संवेदक के वोल्टेज आउटपुट रिकॉर्डिंग के द्वारा काम कर रहा है। डाई द्वारा प्राप्त संकेत शोर स्तर से अधिक होना चाहिए।
    1. संकेत के रूप में संभव के रूप में वर्ग के करीब बनाने के लिए लगातार जल प्रवाह दर समायोजित करें।
      नोट: अनुक्रम में एक से अधिक tastants वितरित करते समय, नोट एक नए tastant के साथ पहले परीक्षण नए और पिछले tastant के मिश्रण से मिलकर होगा इस कारण से, हमने इन पहले परीक्षणों का विश्लेषण नहीं किया।
"> चित्रा 4
चित्रा 4 : स्वादिष्ट डिलीवरी सिस्टम ( ) जानवरों की संदिग्धों के लिए टिटाटंट के समय पर दालों को वितरित करने और निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किए गए उपकरण के एक योजनाबद्ध। सिस्टम के मुख्य घटक लाल संख्याओं के साथ चिह्नित हैं। डिस्टिल्ड वॉटर का एक निरंतर प्रवाह शंक्वाकार पंप से सिलिका टयूबिंग के साथ जुड़ा कठोर प्लास्टिक ट्यूब (1) जहां संदेह को रखा जाना है (6) के अनुसार संधिशोथ में बनाए रखा जाता है। एक छोटी मात्रा में स्वाद रहित डाई युक्त तस्कर को एक दबावयुक्त 16 चैनल छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर दिया जाता है। टीचंट युक्त जलाशयों को मैनिफोल्ड (2) से जुड़ा हुआ है जो कि छेद के ऊपर कठोर ट्यूब से जुड़ा हुआ है, जहां पर संदेह रखा जाना है (5)। वायवीय पंप से संपीडित हवा छिड़काव प्रणाली को इंजेक्ट कर रही है ताकि कस्टम सॉफ़्टवेयर द्वारा नियंत्रित समय पर तेजी से एक स्टेपेंट वितरित किया जा सके। एरंग संवेदक (3) का उपयोग स्वादिष्ट डिलीवरी को मॉनिटर करने के लिए किया जाता है। संवेदक संदेह से जुड़ी कठोर ट्यूब से जुड़ा हुआ है और स्वाभाविक छिड़काव प्रणाली के आउटलेट के नीचे है। रंग सेंसर वोल्टेज संकेत डीसी प्रवर्धक द्वारा प्रवर्धित होता है। एम्पलीफायर के निकट आसन पर लाल रंग का पता लगाने के लिए कस्टम डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक रंग संकेत दिखाया गया है; सिग्नल में तीव्र वृद्धि और कमी क्रमशः आगमन और तास्टेंट के वाउचर को दर्शाती है। कीट की सूंड को छेद (5) में रखा जाता है जो कि रंग संवेदक के ठीक नीचे स्थित है। एक जाल (4) को छेद से ऊपर रखा गया है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अलग-अलग जानवरों की संभावना हमेशा एक ही स्थान पर स्थित होती है। कठोर ट्यूब के दूसरी तरफ एक कचरा कंटेनर (7) में आउटपुट को निर्देशित करने के लिए एक अन्य सिलिकॉन ट्यूब से जुड़ा हुआ है। ( बी ) कठोर प्लास्टिक ट्यूब से जुड़े स्वादिष्ट डिलीवरी सिस्टम के मुख्य तत्वों को दिखा रहा है, जो कि पैनल में दिखाए गए लाल नलों से दर्शाया गया है: पानीस्रोत (6), स्वादित मैनिफोल्ड आउटपुट टयूबिंग (2), रंग संवेदक (3), जाल (4), और छेद जहां सम्मिलित किया जाना है (5) सभी एक कठोर प्लास्टिक ट्यूब (1) में जुड़ा हुआ है । ( सी ) सेट अप में मंडुका तैयारी का स्थान दिखाया गया है। कठोर प्लास्टिक ट्यूब (1) पर छेद (5) में कीट की सूंड के बाहर की टी 2/3 पेश की जाती है। सूंड की स्थिति दांत मोम और एपॉक्सी के साथ सुरक्षित होती है, जैसा कि इनसेट द्वारा दिखाया गया है। कठोर नलिका के पानी का इनपुट और कचरे के कंटेनर में इसका उत्पादन क्रमशः 6 और 7 अंकों से दर्शाया गया है। संख्या 2 स्वादित मैनिफोल्ड आउटपुट टयूबिंग को इंगित करता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

4. जीआरएन से चश्मा-प्रेरित गतिविधि को मॉनिटर करने के लिए एक्स्ट्रासेल्युलर टेट्रोड रिकॉर्डिंग

  1. एक व्यास पर एक स्टीरियोमोरिकोस्कोप के तहत एक मंच पर कीट की तैयारी रखेंआयन-अलगाव तालिका ( चित्रा 4 सी )।
  2. स्वादिष्ट डिलीवरी सिस्टम ( चित्रा 2 बी ) के कठोर ट्यूब में कीट की संदिग्ध से बाहर के दो-तिहाई हिस्से को रखें। ऐसा करने के लिए, पतलून की सूंड का विस्तार करें और फिर उसे सशक्त ड्रेसिंग की सहायता से धीरे-धीरे इसे दबाकर कठोर ट्यूब के छेद में डालें। सूक्ष्म दांत मोम के साथ सूंड पर सील करें और फिर लीक ( चित्रा 4 सी , इनलेट) से बचने के लिए epoxy की एक परत।
  3. सिर के कैप्सूल में खारा छिड़काव लाइन को कनेक्ट करें और प्रतिदिन प्रवाह 0.04 एल / एच की स्थिर दर पर सेट करें।
  4. खारा स्नान ( चित्रा 5 ए ) में ग्राउंड इलेक्ट्रोड ( अर्थात क्लोरीइड चांदी के तार) को विसर्जित करें।
  5. 30 में वर्णित निर्माण प्रक्रिया (4 इलेक्ट्रोड तारों को अच्छी तरह से पृथक इकाइयों को प्राप्त करने और फिट करने के लिए सुझाव दिया गया है) के बाद निर्मित एक कस्टम निर्मित मुड़ तार टेदरोड का प्रयोग करेंनस)। प्रयोग करने से पहले, 30 में वर्णित चरणों के बाद इलेक्ट्रोड को इलेक्ट्रॉप्लेट करें।
  6. मैदानी तंत्रिका के करीब टेट्रोड की स्थिति में रखने के लिए मैन्युअल माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें। जब तक यह तंत्रिका ( चित्रा 5 ) दर्ज नहीं हो जाता तब तक टेट्रोड को अग्रिम करें।
  7. टेर्रोड को रिकॉर्ड करने से पहले इसे तंत्रिका में स्थिर करने के लिए अनुमति देने के बाद कम से कम 10 मिनट की प्रतीक्षा करें।
  8. सिग्नल को बढ़ाएं (3000x) और 0.3 -6 kHz के बीच एक बैंड-पास फिल्टर सेट का उपयोग करें। डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए 40 kHz नमूना दर पर संकेत प्राप्त करें।
  9. प्रयोग करने के बाद मस्ती की तैयारी फ्रीजर में करें।

चित्रा 5
चित्रा 5 : जीआरएन से टेट्रोड रिकॉर्डिंग। ( , बड़ी छवि) एक माइक्रोमैनिपुलेटर को पी के लिए प्रयोग किया जाता हैजीआरएन के क्रियाकलाप को रिकॉर्ड करने के लिए मुड़ तार तारकोण को सुक्ष्म तंत्रिका (एमएक्सएन) में ले जाना। दिखाए गए अनुसार क्लोराइड चांदी ग्राउंड इलेक्ट्रोड को खारा स्नान में रखा गया है। ( , इनसेट) मस्तिष्क की एक बढ़ी हुई छवि जो अतिसंवेदनशील तंत्रिका में टेट्रोड दिखाती है। उपसमूह क्षेत्र (एसईजेड) भी संकेत दिया गया है। ( बी ) ए के रूप में उन्मुख एक मंडुका मस्तिष्क की एक योजनाबद्ध । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

जीएसआर की गतिविधि को स्टेस्टेंट डिलिवरी ( चित्रा 6 ए और 6 सी ) के पहले, उसके दौरान और बाद में एक बाह्य टेट्रोड इलेक्ट्रोड का उपयोग करके रिकॉर्ड किया जा सकता है। चित्रा 6 ए (मध्यम और निचले पैनल) एक्स्टील क्षमता वाले (तीरों) को दर्शाती विभिन्न आयामों के संकेतों को देखे जा सकते हैं, जो अतिसंवेदनशील तंत्रिका में रखे चार तारों में से प्रत्येक द्वारा दर्ज किए गए फ़िल्टर्ड (300-6,000 हर्ट्ज) वोल्टेज निशान दिखाए जा सकते हैं। प्रयोग की शुरूआत के बाद एक 1 स्वाद के स्वाद (1 एम सूक्रोज) को 2 एस दिया गया; उत्तेजना की शुरूआत और ऑफसेट रंग संवेदक ( चित्रा 6 ए , ऊपरी पैनल) द्वारा मॉनिटर किया गया था। स्वादिष्ट प्रेरित स्पाइक जो चार चैनलों में से प्रत्येक में देखा जा सकता है ( चित्रा 6 ए , मध्य पैनल)। जीआरएन (जीआरएन) की पहचान की जा सकती है और मैकेन्सेन्सर्स से अलग हो सकती हैं (कोई भी यहां नहीं दिखाया गया है) जब वे कुछ टीचंट्स का जवाब देते हैं और अन्य नहीं

टेट्रोड रिकॉर्डिंग से एक न्यूरॉन की प्रतिक्रियाओं को पहचानने और अलग करने के लिए, हमने पॉज़ेट के 31 और क्लेनफेल्ड के 32 , 33 विधियों (इन विधियों को इन उद्धरणों में वर्णित किया गया है: 10 , 2 9 ) के आधार पर कस्टम फ़ंक्शन के एक सेट का उपयोग करके ऑफ-लाइन स्पाइक सॉर्टिंग किया। चित्रा 6B चित्रा 6 ए में दिखाए गए डेटा के लिए लागू स्पाइक सॉर्टिंग का एक उदाहरण दिखाता है, जिसमें तीन अच्छी तरह पृथक इकाइयां मिलीं।

चित्रा 6 सी से रास्टर भूखंडों में चित्रा 6 बी में तीन अलग-अलग इकाइयों की प्रतिक्रियाओं को छह अलग-अलग टैस्टंट (1 एम सुक्रोज, माल्टोस और नाओकल, 100 एमएम कैफीन और 10 एमएम बेरबेरिन और लाइबेलिन) अनुक्रम (4 परीक्षणएस / टीस्टेंट दिखाए गए हैं)। जैसा कि चित्रा 6 सी में दिखाया गया है, दर्ज जीआरएन के आधारभूत गतिविधि के विभिन्न स्तर हैं, जिसमें से चुप (जीआरएन 1) से लेकर कम या मध्यम (जीआरएन 2 और 3) तक। ताजी शुरुआत के बाद, जीआरएन विविध गतिविधि के पैटर्न दिखाते हैं और तस्करों के लिए विभिन्न चुनिंदा प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, जीआरएन 1 ने केवल सुक्रोज़ के लिए प्रतिक्रिया दी, जबकि जीआरएन 2 ने उत्तेजनाओं की शुरुआत में ही मिकटोज़ और नाक्ले को स्पाइक के फट और लाइकल के साथ लेबलाइन के साथ जवाब दिया। इसके अलावा, कुछ प्रतिक्रियाएं उत्तेजना के समय ( उदाहरण के लिए जीआरएन 1 सुक्रोज़ के प्रति प्रतिक्रिया) पर बंद होती हैं, जबकि अन्य प्रतिक्रियाएं उत्तेजना की अवधि को समाप्त करती हैं ( जैसे जीआरएन 3 बेर्बेरीन के प्रति प्रतिक्रिया) या दोनों उत्तेजक और निरोधक घटकों ( जैसे चित्रा 7 जीआरएन 2 NaCl और सूक्रोज के प्रति प्रतिक्रियाएं) जीआरएन के विविध संवेदनशीलता और गतिविधि पैटर्न के बारे में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 10 देखें

चित्रा 7 ) का उपयोग करके देखे गए प्रतिक्रियाओं के समान थे। पैनल ए में हरे रंग की बॉक्स में वोल्टेज का निशान स्यरोज़ प्रस्तुति के लगातार पांच परीक्षणों के दौरान जीआरएन 1 से दर्ज किया गया था, और इसी प्रतिक्रिया को पैनल बी में रेखापुंज भूखंड के रूप में दिखाया गया है (ध्यान दें कि इस प्रकार की प्रतिक्रिया मैच जो टेट्रोड से प्राप्त होती है चित्रा 6 सी में दिखाया गया है।) जीआरएन 2, तीव्र इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज किया गया है, एक व्यापक प्रतिक्रिया पैटर्न दिखाता है।

चित्रा 6 6 चित्रा: एक्स्ट्रासेल्यूलर टेट्रोड के साथ मैक्सिलरी नर्व रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि परिणाम। ( ) छिद्रित (300-6000 हर्ट्ज) वोल्टेज निशान जो अधिकतम तारों में से चार तारों द्वारा दर्ज की जाती हैं (मध्य पैनल) दिखाए जाते हैं। मध्य 1 9 में लाल पलक द्वारा इंगित समय अवधि के दौरान एक 1 स्वाद के स्वाद को लागू किया गया था। उत्तेजना की शुरूआत और ऑफसेट को रंग संवेदक द्वारा मॉनिटर किया गया था जैसा कि ऊपरी पैनल पर लाल वोल्टेज ट्रेस द्वारा इंगित किया गया है, और लाल-छायांकित क्षेत्र द्वारा मध्य पैनल पर चिह्नित किया गया है। बिंदीदार क्षैतिज लाइनें +50 (शीर्ष), 0 (बीच) और -50 (नीचे) μV को दर्शाती हैं। ऊर्ध्वाधर बिंदीदार रेखाओं के अंदर स्थित क्षेत्र के अनुरूप कच्चे वोल्टेज के निशान का विस्तार (नीचे पैनल) दिखाया गया है। स्पाइक के उदाहरण तीरों द्वारा इंगित किए जाते हैं। ( बी ) पैनल ए में दिखाए गए आंकड़ों पर लागू स्पाइक सॉर्टिंग का एक उदाहरण। चार वायरल तारों (1-4) के प्रत्येक पर दर्ज वाउवॉर्म्सई तीन अलग जीआरएन (यूनिट 1-3) के साथ दर्ज किए गए संकेतों में योगदान देते हैं। व्यक्तिगत घटनाओं (रंगीन पतली रेखाएं) और माध्य (मोटी काली रेखा) तीन इकाइयों के लिए दिखाए जाते हैं। कई संख्यात्मक मानदंडों को स्पाइक-सॉर्टिंग विधि का उपयोग करके स्वतंत्र इकाइयों को विश्वसनीय तरीके से पहचानने के लिए माना जाता है (देखें संदर्भ 10 , 2 9 )। ( सी ) छः अलग अलग तस्त्तों के अनुक्रम के लिए तीन अलग-अलग इकाइयों की प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले रास्टर भूखंडों (4 परीक्षण / टीस्टेंट दिखाए गए हैं)। स्वाभाविक वितरण (1 एस) का समय अवधि लाल-छायांकित क्षेत्र द्वारा दर्शाया गया है। Tastants की सांद्रता या तो 1 एम (सुक्रोज, माल्टोस, NaCl), 100 मिमी (कैफीन) और 10 मिमी (बेर्बेरीन और लाबलीन) थे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 7 Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
चित्रा 7 : जीआरएन एक्सॉन से इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग। ( , हरे रंग के बॉक्स पैनल) जीआरएन से तेज ग्लास इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोड (80-120 एमयू का प्रतिरोध) के साथ दर्ज किया गया है, जो सुक्ष्म तंत्रिका में रखा गया है, 1 एम सुक्रोज (एससीयू) के साथ 5 लगातार उत्तेजनाओं द्वारा प्राप्त किया गया। ( बी ) अनुक्रम (100 मिमी ग्रे फॉंट रंग; 1 एम ब्लैक फॉन्ट रंग) में दिए गए दो अलग-अलग टीचरों के लिए, तेज ग्लास इंट्रासेल्युलर इलेक्ट्रोड के साथ दर्ज की गई प्रतिक्रियाओं सहित दो जीआरएन की प्रतिक्रियाओं के रास्टर प्लॉट उपकला तंत्रिका में रखा गया (7 परीक्षण / स्वाद और 3 परीक्षण / पानी दिखाए गए हैं) स्वादिष्ट डिलीवरी का समय दोनों पैनलों में लाल-छायांकित क्षेत्रों द्वारा दर्शाया गया है। उत्तेजना की शुरूआत और ऑफसेट रंग संवेदक द्वारा मॉनिटर किया गया था, जैसा कि प्रत्येक पैनल के निचले भाग में लाल वोल्टेज निशान द्वारा दर्शाया गया है।Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां वर्णित विधियां अपेक्षाकृत सरल पशु, मंडुका सेक्स्टा से विवो रिकॉर्ड्स में अनुमति देने के लिए, लंबे समय से अधिक लंबे समय से चुनी गई जीआरएन (2 घंटे से अधिक समय के लिए), पहले, प्रसव के दौरान और प्रसव के बाद इन विधियों में सटीक अस्थायी नियंत्रण के साथ कई स्वादित उत्तेजनाओं के तेजी से, अनुक्रमिक वितरण की सुविधा है, लाभ जो स्वाभाविक प्रतिनिधित्व वाले तंत्रिका तंत्र के अध्ययन के लिए उपयोगी हैं। इस प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए इसका उपयोग किया गया है कि कैसे जीआरएन के टीएनटी के प्रति प्रतिक्रियाओं को बदल दिया जाता है जब वे अपने पोस्टअन्तैप्टीक लक्ष्य न्यूरॉन्स ( जैसे एसईजेड में) को संक्रमित करते हैं, तो एक साथ जीआरएन (जीआरएन) पर निगरानी रखने के लिए एक साथ monosynaptically connected interneurons 10 इसके अतिरिक्त, इन विधियों को प्रयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे परिष्कृत कोडन के मौलिक पहलुओं का अध्ययन करने के लिए जटिल मानदंडों का निष्पादन किया जा सकता है।

जब शुरुआतीहमारे अध्ययन, एक तकनीकी समस्या जिसे हम कभी-कभी समस्या निवारण करना पड़ते थे टेटरोड तारों के साथ अधिकाधिक तंत्रिका से स्पिकिंग सिग्नल का पता लगाने में अक्षमता थी। इसके लिए संभावित कारण भिन्न हैं, क्योंकि विच्छेदन प्रोटोकॉल चुनौतीपूर्ण है, और अच्छी तैयारी प्राप्त करने के लिए कुछ अभ्यास आवश्यक है। सबसे पहले, पतंग विच्छेदन के दौरान तंत्रिका ऊतक के आस-पास के म्यान को हटाने के दौरान अतिसंवेदनशील तंत्रिकाओं को क्षतिपूर्ति करना आसान होता है दूसरा, अगर म्यान पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है, तो टेट्रोड तार तंत्रिका तक पहुंचने में सक्षम नहीं हो सकते हैं। दोनों ही मामलों में, इन मुद्दों को सुलझाने का सबसे आसान तरीका एक नई तैयारी शुरू करना अक्सर होता है तीसरा, टेदरोड तारों के साथ समस्या हो सकती है यह तारों के प्रतिबाधा को मापकर जांच की जा सकती है, जो कि ~ 270 के.यू. 1 किलोहर्ट्ज़ पर होना चाहिए। अगर प्रतिबाधा मूल्य ~ 300 के.टी.ए ऊपर है, वांछित प्रतिबाधा हासिल करने के लिए सोने के तारों के तारों को विद्युत रूप से उतारना (संदर्भ 30 देखें)। चौथा, उपकरण का एक टुकड़ा गलत तरीके से जुड़ा हो सकता हैया दुर्व्यवहार

एक और संभावित समस्या यह है कि स्पाइकिंग सिग्नल रिकॉर्ड किए जाते हैं लेकिन न्यूरॉन (टी) टीस्टेंट्स के लिए अनुत्तरदायी दिखाई देते हैं। ऐसा इसलिए हो सकता है क्योंकि दर्ज न्यूरॉन्स वितरित टीचंट्स के सेट में असंवेदनशील हैं। इसके अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि जीआरएन के ऐक्सानों के अलावा, अतिसंवेदनशील तंत्रिका भी मेकांस्पेन्सरी फाइबर भी लेती हैं। इस प्रकार, जीआरएन के अलावा या इसके अतिरिक्त, तंत्रिकाय न्यूरॉन्स से रिकॉर्ड करना संभव है। हालांकि, स्वाभाविक डिलीवरी सिस्टम पूरे प्रयोग के दौरान लगातार मैकेनिकल इनपुट प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जिससे यह संभव नहीं हो पाया कि एक स्वाद के प्रति प्रतिक्रियाएं उसके प्रसव के यांत्रिक घटकों के प्रति प्रतिक्रियाओं से चकित होंगी। न्यूरॉन्स जो कुछ लेकिन कुछ अन्य टीचंट्स को नहीं देते हैं, या अलग अलग तरीकों के लिए अलग-अलग तरीकों से जीआरएन के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। मिश्रित गिरावट या वाष्पीकरण के कारण स्वाददार एकाग्रता या संरचना में भिन्नता से बचने के लिए हम ताजा पतले tastants का उपयोग करने की सलाह देते हैंविलायक का हम टयूबिंग संदूषण और / या अवरोधों से बचने के लिए नियमित रूप से सिस्टम सफाई की सिफारिश करते हैं।

एक अन्य संभावित तकनीकी समस्या एक हानिकारक संकेत-टू-शोर अनुपात है। इस समस्या को अक्सर रिंचोराइड या बाथ ग्राउंड इलेक्ट्रोड की स्थिति का समायोजन करके हल किया जा सकता है। अन्य समाधानों को परिरक्षण और उपकरण में प्रत्येक विद्युत कनेक्शन की लंबाई को कम करने की आवश्यकता हो सकती है।

अंत में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि टेट्रोड रिकॉर्डिंग के उपयोग से प्राप्त आंकड़ों के सही विश्लेषण के लिए सावधान स्पाइक सॉर्टिंग आवश्यक है। हमने पाया कि पूरी तरह से स्वचालित विधियां आम तौर पर अपर्याप्त हैं हम सलाह देते हैं कि टेटरोड डेटा 10 , 2 9 , 31 , 32 , 33 का विश्लेषण करने से पहले स्पाइक सॉर्टिंग साहित्य से परिचित हो।

हमारे विच्छेदन समर्थक के विकल्पतिल का इस्तेमाल किया जा सकता है यहां, हमने मस्तक के ऊतक हिस्से के माध्यम से एक विच्छेदन का वर्णन किया है, जो कि उपकला नसों और एसईजेड तक पहुंच प्रदान करता है, लेकिन पृष्ठीय पक्ष के माध्यम से विदारक द्वारा इन संरचनाओं तक पहुंचना भी संभव है। हमें पाया गया कि पृष्ठीय पक्ष की तैयारी इन गन्दा संरचनाओं से उनके गहरे स्थान के कारण रिकॉर्डिंग करने के लिए इष्टतम नहीं है, लेकिन यह तैयारी मशरूम के शरीर जैसे उच्च क्रम संरचनाओं से रिकॉर्डिंग को सक्षम करने का लाभ प्रदान करती है, एक ऐसा क्षेत्र जो बहु से जुड़ा हुआ है -सेंद्री एकीकरण, एसोसिएटिव अधिगम और स्मृति प्रोसेसिंग 34 । हमने टेट्रोड इलेक्ट्रोड के इस्तेमाल से अधिकाधिक तंत्रिका से रिकॉर्ड करने पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन जैसा कि हमने सचित्र किया है, मानक इन्ट्रासेल्युलर तेज इलेक्ट्रोड भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, दोनों तकनीकों को कई मस्तिष्क क्षेत्रों 10 से एक साथ रिकॉर्डिंग करने के लिए जोड़ा जा सकता है। तंत्रिका विज्ञान साहित्य में कई उदाहरण हैं Iनैवेटेब्रेट मॉडल, जो संवेदी प्रसंस्करण के मौलिक सिद्धांतों जैसे कि घ्राण कोडिंग के बारे में खुलासा करने के लिए शक्तिशाली उपकरण साबित हुए हैं, जो कि कीड़े और कशेरुक दोनों के लिए लागू होते हैं 35 , 36 , 37 , 38 , 39 । हम आशा करते हैं कि हमारे तरीकों से चंचल कोडिंग के बारे में मौलिक नए अंतर्दृष्टि हो जाएंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच-एनआईआईएचडी से एमएस के लिए इंट्रामरल अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। टीआईएआईएच-एनआईएचएच इंस्ट्रुमेंटेशन कोर सुविधा के जी डॉल्ड और टी। टैलबॉट को स्वाभाविक डिलीवरी सिस्टम डिजाइन करने में सहायता के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET 888200144 For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish -100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421 Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097

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References

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Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).More

Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).

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