Summary
Skive patch klemme teknik er en effektiv metode til at analysere læring-inducerede ændringer i iboende egenskaber og plasticitet af excitatoriske eller hæmmende synapser.
Abstract
Skive patch klemme teknik er et kraftfuldt værktøj til at undersøge læring-induceret neurale plasticitet i specifikke hjerneregioner. For at analysere motor-learning induceret plasticitet, vi er uddannet rotter ved hjælp af en fremskyndet rotor rod opgave. Rotter udført opgaven 10 gange på 30-s intervaller for 1 eller 2 dage. Performance blev væsentligt forbedret uddannelse dage i forhold til den første retssag. Vi forberedte derefter akut hjernen skiver af den primære motor cortex (M1) hos utrænede og trænede rotter. Nuværende-clamp analyse viste dynamiske ændringer i hvile membran potentiale, spike tærskel, afterhyperpolarization og membran modstand i layer II/III pyramideformet neuroner. Nuværende injektion induceret mange flere pigge i 2-dages uddannet rotter end utrænede kontrol.
For at analysere kontekstuel læring induceret plasticitet, vi er uddannet rotter ved hjælp af en hæmmende undgåelse (IA) opgave. Efter at have oplevet mund-chok i den mørke side af en boks, lært rotter at undgå det, opholder sig i det oplyste side. Vi forberedt akut hippocampus udsnit fra utrænede, IA-uddannet, uparrede og walk-through rotter. Spænding-clamp analyse blev brugt til at optage fortløbende miniature excitatoriske og hæmmende postsynaptiske strømme (mEPSCs og mIPSCs) fra den samme CA1 neuron. Vi fandt forskellige gennemsnitlige mEPSC og mIPSC amplituder i hver CA1 neuron, tyder på, at hvert neuron havde forskellige postsynaptiske styrker på sin excitatoriske og hæmmende synapser. Derudover havde sammenlignet med utrænede kontrolelementer, IA-uddannet rotter højere mEPSC og mIPSC amplituder, med bred diversitet. Disse resultater foreslog at kontekstuel læring skaber postsynaptiske mangfoldighed i både excitatoriske og hæmmende synapser på hver CA1 neuron.
AMPA eller GABA-A receptorer syntes at mægle de postsynaptiske strømninger, siden bad behandling med CNQX eller bicuculline en spærret henholdsvis hændelserne mEPSC eller mIPSC. Denne teknik kan bruges til at studere forskellige typer af læring i andre regioner såsom sensorisk cortex og amygdala.
Introduction
Patch klemme teknik, udviklet af Neher og Sakmann, har været meget anvendt til elektrofysiologiske eksperimenter1. Hele-celle patch klemme teknik2 kan bruges til at registrere intracellulære strøm eller spænding ved hjælp af gigaohm segl af cellemembranen. Nuværende-clamp-teknik gør det muligt for os at analysere forskellene i membranen egenskaber såsom hvilende potentiale, modstand og kapacitans3. Spænding-clamp-teknik gør det muligt for os at analysere læring-induceret synaptisk plasticitet på både excitatoriske og hæmmende synapser.
Den primære motor cortex (M1) er en central region, der er afgørende for at gøre dygtige frivillige bevægelser. Tidligere elektrofysiologiske undersøgelser viste udviklingen af langsigtede potensering (LTP)-gerne plasticitet i layer II/III ophidsende synapser efter dygtige motor uddannelse4. Desuden, i vivo billeddiagnostiske undersøgelser yderligere demonstreret remodellering af M1 dendritiske pigge efter en dygtig nåede opgave5,6. Læring-induceret synaptic og iboende plasticitet har imidlertid ikke været vist i M1 neuroner.
Vi har for nylig rapporteret, at en rotor rod opgave forfremmet dynamiske ændringer i glutamatergic og GABAergic synapser og ændret den iboende plasticitet i M1 layer II/III neuroner7. Her brugte vi skive patch klemme teknik for at undersøge læring-induceret plasticitet. Denne teknik kan også bruges til at undersøge andre typer af erfaring-afhængige plasticitet i andre områder af hjernen. For eksempel sanseindtryk i den tønde cortex kan styrke AMPA receptor-medieret excitatoriske input til layer II/III neuroner8, og cued frygt conditioning styrker excitatoriske indgangene på de laterale amygdala neuroner, der er nødvendige for frygt hukommelse9. Desuden skaber kontekstuel læring mangfoldighed med hensyn til excitatoriske og hæmmende synaptic input til hippocampus CA1 neuroner10,11.
Protocol
alle dyr bolig og kirurgiske procedurer var i overensstemmelse med retningslinjerne for dyr eksperimenter af Yamaguchi University School of Medicine og blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Yamaguchi Universitet.
1. dyr
- bruge 4 til 5 uger gamle mandlige Sprague-Dawley rotter (postnatal 28-31 dage gammel).
- Hus rotter i individuelle plastic bure (40 cm × 25 cm × 25 cm) holdes på en konstant temperatur (23 ° C ± 1 ° C) under en 12-h lys/mørke cyklus. Give rotter ad libitum adgang til vand og mad.
2. Rotoren stang test
- at undersøge motoriske færdigheder læring, underkaste hver rotte rotor stang test (stang diameter 7 cm; rutebredde 8.9 cm; fall højde 26.7 cm) til 1 eller 2 dage i træk ( figur 1A i Kida et al., 2016 < sup Class = "xref" > 7). Udføre opgaven i en rolig, temperatur-kontrolleret rum (23 ± 1 ° C). Ikke forstyrre eller håndtere rotter før test
- Sæt rotor stangen til acceleration tilstand, lineært fra 4 omdrejninger/min. til 40 omdrejninger/min (8 π/min. til 80 π/min) i 5 min., hvilket øger
- Sætte rotten på den hvilende roterende stang. Bekræfte, at alle lemmer på stangen.
- Måle ventetid for at falde fra roterende stangen til at evaluere motorisk præstation.
- Tillade hver rotte 10 forsøg (forsøg) med 30-s intervaller.
- Hvis rotten falder fra roterende stangen, sæt den på stangen igen efter en 10-20 s interval.
- Ofre rotte med en overdosis af pentobarbital (400 mg/kg) 30 min efter den afsluttende retssag. Injicere utrænede kontrol rotter med den samme dosis af anæstesi i deres hjem bure.
3. Hæmmende undgåelse test
- at undersøge kontekstuel læring, emnet rotter til en hæmmende undgåelse (IA) test ( figur 1 d i Mitsushima et al., 2011, 2013 10 , 11) undgå enhver episodiske erfaringer på dagen af forsøget som kontakt med andre, bur ændringer eller rengøring. Udføre opgaven i en rolig, temperatur-kontrolleret rum (23 ± 1 ° C).
Bemærk: IA uddannelse apparater er en to-chambered akryl boks (længde 33 cm, bredde 58 cm, højde 33 cm). Det har en tændte sikre side og en mørk chok side, der er adskilt af en faldlem ( fig. 1 d). - Placere rotten i den sikre (tændte) side af boksen belyst. Håndtere rotte forsigtigt uden stress.
- Vente en kort tid (10-20 s) til at acclimate rotte miljøet.
- Åbne skydedøren til at tillade rotte at angive boksen mørke behag.
- Måle latency (s) før rotten træder den nye mørke side af boksen. Latenstiden for den første retssag repræsenterer rotten ' s præstation før uddannelse.
- Efter indrejse i den mørke side, lukke døren og anvende et scrambled elektrisk fod chok (2 s, 1,6 mA) via elektrisk stål stænger sat i gulvet i boksen. Tillad walk-through rotter at udforske uddannelse apparater til 1 min uden at blive chokeret. Hus uparret rotter i en belyst chok bur for flere give dage og pludselig stød uden episodiske erfaringer. Håndtere forsigtigt uden stress i enhver grupper.
- Holde hver rotte i boksen mørke for 10 s før den returneres til burene.
- På 30 min efter chokket, mund, placere igen rotten i den tændte side af boksen. Måle ventetid for at indtaste den mørke side.
- Vende tilbage rotten til burene.
- På 60 min efter chokket, ofrer rotte med en overdosis af pentobarbital (400 mg/kg). Håndtere rotten forsigtigt og injicere anæstesi intraperitoneal. Hos utrænede kontrol rotter, injicere anæstesi i deres hjem bure uden de erfaringer, der er beskrevet ovenfor.
4. Dissektion buffer
- opløse krystaller af 0.195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0.188 g KCl, 0.074 g CaCl 2, 1.423 g MgCl 2-6 H 2 O og 12.579 g cholinchlorid i ultrarent vand (900 mL til 950 mL) . Se tabel 1.
- Opløses krystaller af 2.340 g ascorbinsyre, 0.342 g pyrodruesyre syre natriumsalt, 2.100 g NaHCO 3 og 4.500 g glucose.
- Tilføj vand op til 1000 mL. Rækken af osmolalitet vil være mellem 290 mOsm/L og 300 mOsm/L. Juster osmolalitet ved at tilføje ultrarent vand, hvis det er over rækken.
- Boble løsning med 5% CO 2 / 95% O 2 gas blandingen på iskolde temperaturer i 5 min før brug.
5. Kunstige cerebrospinalvæske (aCSF)
- opløse krystaller af 0.186 g KCl, 6.700 g NaCl, og 0.156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O i ultrarent vand (900 mL til 950 mL). Se tabel 2.
- Boble med gasblandingen i 5 min.
- Opløses krystaller af 1.800 g glukose og 2.184 g NaHCO 3 og derefter tilsættes 4 mL MgCl 2 og 4 mL CaCl 2 fra 1 M lager løsninger.
- Tilføj vand op til 1000 mL. Rækken af osmolalitet vil være mellem 290 mOsm/L og 295 mOsm/L. Juster osmolalitet ved at tilføje ultrarent vand, hvis det er over rækken.
- Boble med gas blandingen forudgående bruge.
6. Intracellulære løsninger
- For aktuelle-clamp optagelser (tabel 3), opløses 0.0746 g KCl, 6.089 g K-gluconat, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA og 500 µL MgCl 2 fra 1 M lager løsning i 180 mL ultrarent vand (justere pH til 7,2 med KOH).
- Tilføj 0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP og 0.510 g Na-fosforkreatin. Tilsæt vand til 200 mL og justere pH til 7,35 med KOH.
- Justere osmolalitet til ca 290 mOsm/L ved at tilføje ultrarent vand.
- Butik som 1 mL alikvoter i fryseren (30 ° C).
- For spænding-clamp optagelser (tabel 4), 5.244 g CsMeSO 3, 0,672 g CsCl opløses 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA og 500 µL MgCl 2 fra 1 M lager løsninger i 180 mL ultrarent vand. PH indstilles til 7,2 med CsOH. For mEPSP og mIPSP optagelser, skal du bruge modificerede koncentration af 5.814 g CsMeSO 3 og 0.252 g CsCl for at justere tilbageførsel potentiale af GABA A receptor svar 11.
- Tilføj 0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP og 0.510 g Na-fosforkreatin. Tilsæt vand til 200 mL og justere pH til 7,35 med CsOH.
- Justere osmolalitet til ca 290 mOsm/L ved at tilføje ultrarent vand.
- Butik som 1 mL alikvoter i fryseren (30 ° C).
7. Skær forberedelse
- forudgående at ofre, cool-down alle dissektion værktøjer med knust is ( figur 2A). Tilføje ca. 500 mL koldt vand ind i objektbeholderen knust is til at øge den kontakt areal. Denne procedure blev beskrevet tidligere 10 , 11 , 12.
Bemærk: Værktøjer her er: store saks, iris saks, en spatel, en mikro spatel, pincet, pincet, en rustfri stål 200 mL bægerglas, en vinge til hjernen trimning, en 120 mL hjerte perfusion sprøjte fyldt med dissektion buffer behandlet med gasblandingen, en silikone rør (20 cm) forbundet til en flad 18-gauge kanyle, en rustfri hjernen dissektion fase (tykkelse = 3 mm, φ = 12 cm), og en montering scenen for vibratome (φ = 5 cm). - Ofre rotte 30 min efter færdiggører den adfærdsmæssige paradigme af bedøve det med en overdosis af pentobarbital (400 mg/kg legemsvægt). Udføre skive forberedelse hurtigt til at sikre, at skiverne er så sunde som muligt 10 , 11 , 12. Hjernen udsugningaktion protokol opfylder alle veterinære standarder for vores Universitet.
- Fyld en 120-mL sprøjte med iskold dissektion buffer (tabel 1) boblede med en 5% CO 2 / 95% O 2 gas blandingen. Fjern eventuelle luftbobler før perfusion.
- Efter udsætter hjertet, indsætte nålen ind i den bageste del af venstre ventrikel.
- Udføre transcardial perfusion af hjerne manuelt ved hjælp af sprøjten. Større rotter kræver mere dissektion buffer for perfusion. Dykke hjernen med iskold dissektion buffer i 5 min. boble bufferen løbende under submersion.
- Trim den bageste side af hjernen på en vinkel parallelt med dendritiske orientering af de kortikale målområde ved hjælp af en vinge. Da hjernen er stå på dissektion scenen med afskårne ende bunden, bestemmer den oprindelige vinkel vinklen på alle efterfølgende hjernen skiver. Dette trin er kritisk vigtigt ( figur 2B). En forkert vinkel kan skære igennem mål pyramideformet neuroner.
Bemærk: Værktøjer her er: en vinge til hjernen trimning, et filtrerpapir (φ = 10 cm), en rustfri hjernen dissektion fase (tykkelse = 3 mm, φ = 12 cm), en spatel, en superlim, en dråbetæller og en montering scenen for vibratome (φ = 5 cm). - Cut 350 µm tykt koronale hjernen skiver ved hjælp af en vibratome. Fyld dissektion kammer med iskold buffer boblede med en 5% CO 2 / 95% O 2 gas blandingen ( figur 2 c). Boble bufferen løbende under hjernen slice.
- Trim i periferien af området ved hjælp af iris saks.
- Vask de trimmede skiver forsigtigt i stuetemperatur aCSF boblede med 5% CO 2 / 95% O 2 (tabel 2).
- Vedligehold studset skiver i en grænseflade salen indtil optagelsen er udført ( figur 2D og E). Inkubation i 1 h i salen forbedrer betingelse af cellerne, men fænotyper ændre hvis skiverne er udruget i mere end 10 timer. Luk låget af salen at vedlægge gasserne og de små flydende dråber af aCSF.
8. Hele-celle patch klemme
Bemærk: hele-celle optagelser kræver en forstærker og et low-pass filter, der er indstillet til en cutoff hyppigheden af 5 kHz. Signalerne er digitaliseret og lagret i en PC. De lagrede data er analyseret offline ( figur 3A).
- Opret glas elektroder ved hjælp af en vandret puller. Fyld elektroderne med en egnet løsning (tabel 3 og 4) ved hjælp af en almindelig polyethylen 1-mL sprøjte, der er tilknyttet et fint glasrør og et 0,22 µm filter.
- Før kontakt med cellen, opretholde overtryk og justere den aktuelle nul pipette.
- Efter dannelse af en gigaohm plombe, anvende negativt pres at briste cellemembranen (hele-celle konfigurationen i figur 3F).
9. Nuværende-clamp analyse
- egenskaber af cellemembranen
- fylde patch optagelse pipetter med den intracellulære løsning for nuværende-clamp optagelser (tabel 3). Modstanden i pipetten er mellem 4 MΩ og 7 MΩ i aCSF.
- Efter membranen bristninger, holde membran spænding på -60 mV på V-CLAMP tilstand. Derefter skifte fra " bad " mode til " celle " tilstand i membranen test ved hjælp af software til at måle de iboende celleegenskaber membran kapacitans, modstand og tidsvejning.
- Nuværende injektion undersøgelse
- efter optagelse de iboende celleegenskaber, skifter tilstand fra V-KLEMME til spor (jeg = 0) /I-CLAMP NORMAL for den aktuelle injektion. Bemærk, at flydende junction potentiale ikke bør være korrigeret 10.
- Inject aktuelle ind i cellen for 300 ms. ændre intensiteten af den nuværende trinvis fra − 100 pA at +550 pA med 50-pA stigninger. Tæl antallet af pigge (handling potentialer) fremkaldt af de nuværende injektioner.
- Måle den mindste spænding for at fremkalde en aktionspotentialet (dette er tærskel spændingen).
- Beregner afterhyperpolarization amplitude som forskellen mellem spændingen på spike indledning og den laveste spænding opnået under afterhyperpolarization 7.
10. Spænding-clamp analyse
- The AMPA/NMDA forholdet
Bemærk: The AMPA/NMDA ratio er en konventionel måde at evaluere postsynaptiske plasticitet på glutamatergic ophidsende synapser 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Bemærk dog, at samtidige stigninger i begge komponenter ikke kan ændre forholdet mellem 13.- Perfuse optagelse kammer med fysiologiske løsning boblede med gasblandingen og holde temperaturen ved 22 ° C til 25 ° C. Add 0.1 mM picrotoxin til løsningen at blokere GABA-A - medieret reaktion og tilføje 4 µM 2- chloroadenosine til at stabilisere evoked neurale svar 14.
- Fylde patch optagelse pipetter med den intracellulære løsning for spænding-clamp optagelser (tabel 4). Check modstand af optagelse pipette i aCSF. Modstanden er mellem 4 MΩ og 7 MΩ.
- For optagelse i laget II/III pyramideformet neuroner i M1, placere en bipolar wolfram stimulere elektroden 200 µm til 300 µm lateral til celler skal registreres, under pial overfladen i regionen af forelimb repræsentation (2-mm lateral til den midterlinjen) 15 , 16 , 17.
- Til optagelse i en CA1 pyramideformet neuron, placere den stimulerende elektrode 200 µm til 300 µm lateral (Schaffer sikkerhedsstillelse fiber) eller mediale (temporoammonic pathway) til cellerne, der bliver optaget ( figur 3B).
- Øge stimulus intensitet op til den synaptiske svar > 10 pA.
- Beregn AMPA/NMDA-forholdet forholdet mellem spidsværdien af strømmen målt på − 60 mV til aktuelt målt på + 40 mV på 150 msek efter stimulus debut. Bemærk, at 50 til 100 spor bør være et gennemsnit for at beregne forholdet.
- Miniature postsynaptiske aktuelle optagelser
Bemærk: Miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs) menes at svare til de svar, fremkaldt af den præsynaptiske frigivelse af en enkelt vesikel af glutamat 18 . Derimod menes miniature hæmmende postsynaptiske strømme (mIPSCs) at svare til de svar, fremkaldt af den præsynaptiske frigivelse af en enkelt vesikel GABA 18. Stigninger i amplituder af mEPSCs og mIPSCs afspejler postsynaptiske transmission styrke, mens stiger i tilfælde frekvens afspejle stigninger i antallet af funktionelle synapser eller præsynaptiske frigivelse sandsynligheden 11 .- Fylde patch optagelse pipette med modificerede intracellulære løsning (tabel 4) til at justere tilbageførsel potentiale af GABA A receptor-medieret nuværende til -60 mV.
- Tilføj 0,5 µM tetrodotoxin til bad at blokere spontan handling potentialer.
- Hold spænding på -60 mV til rIndspil mEPSC begivenheder i 5 min.
- Ændring bedriften potentielle 0 mV til at optage mIPSC begivenheder i 5 min. Fordi M1 neuroner vise lidt højere tilbageførsel potentiale for AMPA receptor-medieret strømme, mIPSCs af M1 neuroner er indspillet på + 15 mV med 0,1 mM APV.
- Vent et par minutter for aktuelt at stabilisere.
- Optage mIPSC begivenheder i 5 min.
- Opdage miniature begivenheder ved hjælp af software, og bruge begivenheder over 10 pA til analyse. Tæl antallet af mEPSCs eller mIPSCs arrangementer for 5 min at bestemme frekvensen. Gennemsnitlig amplituder af hændelser til at få den gennemsnitlige amplitude.
- Bekræfte om bad behandling med 10 µM CNQX eller 10 µM bicuculline methiodide blokerer hændelserne mEPSCs og mIPSCs hhv.
- Forbundne-puls analyse
Bemærk: præsynaptiske plasticitet kan analyseres ved hjælp af parret puls analyse. En stigning i den parret puls indikerer et fald i den præsynaptiske glutamat eller GABA frigive sandsynligheden 7 , 10 , 11.- Til at analysere ophidsende synapser, tilføje 0.1 mM picrotoxin og registrere svar på -60 mV. Selv om vi tilføjet 4 µM 2-chloroadenosine til bad, skal vi huske at stoffet påvirker præsynaptiske frigivelse sandsynlighed 14.
- Til at analysere hæmmende synapser, tilføje 0.1 mM APV og 4 µM 2-chloroadenosine til bad og optage svar på 0 mV. I M1 neuroner, optage svar på + 15 mV.
- Anvende parrede pulser med Inter stimulus interval på 100 ms eller 200 ms.
- Optage 50-100 sekventielle spor på hver enkelt bedrift potentielle og de middelværdier.
- Beregn parrede pulse-forholdet som forholdet mellem den anden top til den første højdepunkt i det postsynaptiske nuværende.
Representative Results
Som vi beskrev for nylig7, induceret rotor stang uddannelse (figur 1A) dynamiske ændringer i den iboende plasticitet af M1 layer II/III pyramideformet neuroner. Måling latenstiden indtil rotter falder fra de roterende stang tillader os at anslå dygtige læring udførelsen af rotten. Længere ventetid angiver bedre motorisk præstation. På dag 1 af uddannelse forbedret rotter deres rotor stang ydeevne indtil retssagen endte. På dag 2, rotter nået næsten asymptotiske niveauer i den gennemsnit session scorer (figur 1B). I forhold til ventetid på den første retssag, post-hoc analyse viste signifikante forbedringer ved de endelige forsøg på uddannelsesdage (figur 1 c).
Figur 4A viser et eksempel på nuværende-clamp analyse, hvor egenskaberne neuronal ændret efter motoriske færdigheder læring. Injektioner af 400 pA og 500 pA strømninger var nødvendig for at fremkalde handling potentialer i gruppen utrænet og i 1-dags uddannet rotter, henholdsvis. Derimod var injektion af kun en 150 pA aktuelle tilstrækkelig til at fremkalde handling potentialer i 2-dages uddannet rotter. Forholdet mellem nuværende intensiteten og antallet af handling potentialer er vist i figur 4B. Så lidt som 50 pA aktuelle var tilstrækkelig til at fremkalde pigge i 2-dages uddannet rotter; derimod reagerede 1-dags uddannet rotter med færre handling potentialer end utrænede rotter på 350 pA og højere strømme. Figur 4 c viser desuden, at 1-dags uddannet rotter viste lavere hvilende potentielle, højere spike tærskel og dybere afterhyperpolarization, hvorimod 2-dages uddannet rotter viste højere hvilende potentiale (figur 4 c) og membran modstand ( Figur 4D).
Som vi tidligere beskrevet11, induceret IA uddannelse (figur 1 d) postsynaptiske plasticitet på excitatoriske og hæmmende synapser af CA1 hippocampus neuroner. Ved at måle ventetid i lyskasse, kunne vi anslår kontekstuel læring udførelsen af rotten. Figur 1E viser resultaterne af IA opgave. Efter den parrede elektrisk stød lære rotter at undgå den mørke side af boksen og bo i den tændte side, som de ikke foretrækker normalt. Tendens til at undgå den mørke side angiver derfor erhvervelse af kontekstuelle erindringer.
Figur 5 viser et eksempel på spænding-clamp analyse i hvilken miniature postsynaptiske strømninger blev dramatisk ændret efter kontekstuel læring. At undersøge læring-induceret plasticitet, spontane AMPA-medieret mEPSCs og GABAA-medieret mIPSCs var sekventielt indspillet i overværelse af 0,5 µM tetrodotoxin (figur 5A og B). Som vist på to-dimensionelle parceller (figur 5 c), havde hver CA1 neuron forskellige gennemsnitlige amplituder for mEPSCs og mIPSCs. Selv om amplituder var lav og viste en smal distribution interval i utrænet, uparrede, og walk-through rotter, dem var forskellige i IA-uddannet rotter (tabel 5). ANOVA efterfulgt af post-hoc analyse viste en betydelig stigning i de gennemsnitlige amplituder af mEPSC og mIPSC i IA-uddannet rotter (figur 5E), hvilket tyder på læring-induceret postsynaptiske plasticitet i CA1 neuroner.
Desuden udstillet hver CA1 neuron forskellige mEPSC og mIPSC frekvenser (fig. 5 d). Selv om frekvenserne var lav og viste en smal distribution interval i utrænet, uparrede, og walk-through rotter, dem var forskellige i IA-uddannet rotter (tabel 6). ANOVA efterfulgt af post-hoc analyse viste en betydelig stigning i hyppigheden af mEPSC og mIPSC begivenhederne i IA-uddannet rotter (figur 5F). Der er to mulige fortolkninger af disse resultater. Først er, at kontekstuel læring steg antallet af funktionelle synapser af neuroner. Den anden er, at kontekstuel læring øget præsynaptiske frigivelse sandsynligheden af glutamat og GABA.
For at undersøge yderligere præsynaptiske plasticitet, vi gennemført parret puls stimulering, som rapporteret tidligere10,11.
Figur 1 : Læring præstation efter træning.
A: den eksperimentelle design viser rotor stang uddannelse og koronale hjernen skive. B: den gennemsnitlige ventetid at falde fra den accelererende rotor stang tønde. C: den gennemsnitlige ventetid til at falde ud af stangen på først og de sidste forsøg på uddannelse dage 1 og 27. P< 0,01 vs første retssag. D: skema af hæmmende undgåelse (IA) opgave og koronale hjernen skive. E: den gennemsnitlige ventetid til at angive boksen mørke før og efter IA uddannelse11. P< 0,01 vs før IA uddannelse. Numre af afsnittene koronale angive afstanden foran bregma i mm. Antallet af dyr, der er vist i bunden af søjlerne. Fejllinjer angive SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Skive procedurer.
A: fotografier viser forberedelse af akut hjernen skiver. Dissektion værktøjer blev afkølet i knust is før brug. B: hjerne dissektion og trimning. Bemærk at trimning vinklen på bageste side skal være orienteret parallelt med den dendritiske orientering. C: udskæring hjernen i et vibratome kammer. Hjernen er badet i dissektion buffer og boblede kontinuerligt med en 5% CO2/95% O2 gasblanding. D: en grænseflade kammer lavet af to plast mad containere og en silikone slange. Salen var fyldt med kunstige CSF og boblede kontinuerligt med gasblandingen. E: hjernen skiver var placeret på våde filterpapir i salen.Bar = 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Patch klemme procedurer.
A: patch-clamp systemet bruges til at optage elektriske signaler fra en neuron. Placeringen af den stimulerende og optagelse elektroder i layer II/III neuroner er vist i den rotte motoriske cortex. B: for at analysere Schaffer synapser af en CA1 pyramideformet neuron, en stimulerende elektrode var placeret i stratum radiatum. For at analysere temporoammonic synapser, var en stimulerende elektrode placeret i stratum moleculare. Repræsentant spor af evoked AMPA og NMDA receptor-medieret excitatoriske postsynaptiske strømninger i den samme CA1 neuron er vist. C: en skive anker blev brugt til at stabilisere skive i optagelse kammer. D: en repræsentation kort i den motoriske hjernebark, baseret på offentliggjorte papirer15,16,17. ML = midterlinjen. E: IR-DIC micrographs af M1 layer II/III neuroner før (øvre) og under optagelsen (lavere). Bar = 10 µm. F: ændringer i pipette nuværende før touch (øverst) og på membran brud (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative resultater af nuværende-clamp analyse7 .
A: repræsentative spor af handling potentialer registreres efter induktion med aktuelle injektioner. B: forholdet mellem den gennemsnitlige aktuelle input (pA) vs aktionspotentialet output (antallet af pigge) i hjernen skiver fra utrænede (åben bar), 1-dags uddannet (grå søjler) og 2-dages uddannet rotter (fyldt stænger). C: hvilende potentiale, tærskel og afterhyperpolarization af layer II/III neuroner. D: membran modstand og serie modstand af neuroner. Vi brugte 9-10 rotter i hver gruppe. Antallet af celler er vist inden for hver søjle. Fejllinjer angive SEM. *P< 0,05, **P< 0,01 vs utrænede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentative resultater af spænding-clamp analyse11 .
Repræsentative spor af miniature excitatoriske og hæmmende postsynaptiske strømme (mEPSCs og mIPSCs) i utrænede (A) og hæmmende undgåelse (IA)-uddannet rotter (B). mEPSCs-60 mV og mIPSCs på 0 mV blev målt sekventielt i samme CA1 pyramideformet neuron i overværelse af tetrodotoxin (0,5 µM). Lodret streg = 20 pA, vandret bar = 200 msek. C: to-dimensionelle parceller af middelværdien mig, (I) PSC amplituder i utrænet, IA-uddannet, uparrede, og walk-through rotter. D: to-dimensionelle afbildninger af mig (jeg) PSC frekvenser i de 4 grupper. Bemærk at hver CA1 neuron udstillet forskellige mener mig, (I) PSC amplituder og frekvenser. IA uddannelse ikke kun styrket de gennemsnitlige amplituder (E), men også øget frekvenser af mig (jeg) PSC begivenheder (F). Vi brugte 4-6 rotter i hver gruppe. Antallet af celler er vist i bunden af søjlerne. Rødt plustegn (C, D) og barer med lodrette streger (E, F) angiver den gennemsnit ± SEM. **P< 0,01 vs utrænede rotter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Dissektion buffer (Total 1L) | ||
| NaH2PO4 • 2 H2O | 0.195 g | 1.25 mmol/L |
| KCl | 0.188 g | 2,5 mmol/L |
| CaCl2 | 0.074 g | 0,5 mmol/L |
| MgCl2 • 6 H2O | 1.423 g | 7,0 mmol/L |
| Cholinchlorid | 12.579 g | 90 mmol/L |
| Ascorbinsyre | 2.340 g | 11,6 mmol/L |
| Pyrodruesyre syre | 0.342 g | 3.1 mmol/L |
| NaHCO3 | 2.100 g | 25 mmol/L |
| Glukose | 4.500 g | 25 mmol/L |
Tabel 1: En opskrift på dissektion buffer
| Kunstige CSF (Total 1L) | ||
| KCl | 0.186 g | 2,5 mmol/L |
| NaCl | 6.700 g | 114.6 mmol/L |
| NaH2PO4 •2H2O | 0.156 g | 1 mmol/L |
| Glukose | 1.800 g | 10 mmol/L |
| NaHCO3 | 2.184 g | 26 mmol/L |
| 1M MgCl2 | 4 mL | 4 mmol/L |
| 1M CaCl2 | 4 mL | 4 mmol/L |
Tabel 2: En opskrift på kunstige cerebrospinalvæske (CSF)
| Intracellulære løsning for nuværende klemme (samlede 200 mL) | ||
| KCl | 0.0746 g | 5 mmol/L |
| K-gluconat | 6.089 g | 130 mmol/L |
| HEPES | 0.476 g | 10 mmol/L |
| EGTA | 0.0456 g | 0,6 mmol/L |
| 1M MgCl2 | 500 ΜL | 2,5 mmol/L |
| Na2 ATP | 0.4408 g | 4 mmol/L |
| Na3 GTP | 0.0418 g | 0,4 mmol/L |
| Na fosforkreatin | 0.510 g | 10 mmol/L |
Tabel 3: En opskrift på en intracellulær løsning for nuværende klemme optagelse
| Intracellulære løsning for spænding klemme (samlede 200 mL) | ||||
| CsMeSO3 | 5 | |||
Tabel 4: En opskrift på en intracellulær løsning for spænding klemme optagelse
| Parametre | utrænede | IA uddannet | uparret | gå gennem | |
| mEPSC amplitude | Varians | 5.8 | 32,1 | 4.7 | 5.9 |
| Standardafvigelse | 2.4 | 5.7 | 2.2 | 2.4 | |
| Variationskoefficienten | 0.189 | 0.326 | 0.177 | 0.190 | |
| mIPSC amplitude | Varians | 17.1 | 56,7 | 31,8 | 20,7 |
| Standardafvigelse | 4.1 | 7.5 | 5.6 | 4.5 | |
| Variationskoefficienten | 0.279 | 0.387 | 0.367 | 0.286 |
Tabel 5: Mangfoldighed af miniature excitatoriske og hæmmende postsynaptiske nuværende (mEPSC og mIPSC) amplituder i hæmmende undgåelse (IA)-uddannet rotter
| Parametre | utrænede | IA uddannet | uparret | gå gennem | |
| mEPSC hyppighed | Varians | 278 | 2195 | 188 | 195 |
| Standardafvigelse | 17 | 47 | 14 | 14 | |
| Variationskoefficienten | 0.902 | 1.198 | 0.893 | 0.874 | |
| mIPSC hyppighed | Varians | 3282 | 27212 | 1385 | 5135 |
| Standardafvigelse | 57 | 165 | 37 | 72 | |
| Variationskoefficienten | 1.195 | 1,006 | 0.955 | 0.836 |
Tabel 6: Mangfoldighed af miniature excitatoriske og hæmmende postsynaptiske nuværende (mEPSC og mIPSC) frekvenser i hæmmende undgåelse (IA)-uddannet rotter
Discussion
Den største begrænsning af skive patch klemme teknik er optagelse i Skive forberedelse, der ikke måske afspejler, hvad der sker in vivo. Selv om i vivo aktuelle-clamp analyse er mere pålidelige, er det teknisk udfordrende for at få tilstrækkelige data fra bevidste dyr. Da hver pyramide neuron har forskellige cellulære egenskaber, er et passende antal celler nødvendig for korrekt analysere forskelle i neuroner efter træning. Derudover kræver spænding-clamp analyse kontinuerlig behandling med CNQX, APV eller bicuculline for at bestemme arten af de postsynaptiske svar. For at analysere miniature svar fremkaldt af en enkelt vesikel af glutamat eller GABA, er kontinuerlig behandling med tetrodotoxin nødvendig hen til hindre spontan handling potentialer. Selv om den nyligt udviklede multi photon imaging teknik er stærk til at analysere morfologiske ændringer på excitatoriske synapser19, en kombineret patch klemme teknik er nødvendig for at analysere funktionen af synapser i vivo. Det er i øjeblikket ganske vanskeligt at analysere morfologiske ændringer i hæmmende synapser, da mest hæmmende synapser ikke er en pigge. På dette tidspunkt, ville udsnit patch klemme være den mest hensigtsmæssige teknik til at analysere celleegenskaber eller funktioner af excitatoriske/hæmmende synapser i uddannet dyr.
Ved hjælp af strøm-clamp analyse (figur 4), rapporteret vi for nylig motoriske læring-induceret iboende plasticitet i layer II/III neuroner. Specifikt, 1-dags uddannet rotter viste en betydelig nedgang i hvile membran potentiale og en stigning i spike tærskel. 2-dages uddannet rotter viste en betydelig stigning i hvile membran potentiale, som førte til øget ophidselse. Disse resultater foreslog, at der var dynamiske ændringer i den iboende plasticitet af M1 layer II/III neuroner i uddannet rotter. Yderligere spænding-clamp analyse viste en stigning i parret-puls ratio på 1-dags uddannet rotter, tyder på, at der var en forbigående nedgang i den præsynaptiske GABA release sandsynlighed7. Det er derfor muligt at disinhibition fra GABA på laget II/III synapser kan udløse den resulterende læring-induceret plasticitet i M1. Til støtte for dette kræver skive forberedelse af M1 bad behandling med en GABAA receptor blokker til at fremkalde LTP20.
Analyse af miniature postsynaptiske potentialer er en kraftfuld måde at opdage synaptisk plasticitet i IA-uddannet dyr. Sekventiel indspilning af mEPSCs og mIPSCs i en enkelt CA1 neuron giver mulighed for analyse af synaptic excitatoriske/hæmmende styrken af hver enkelte neuron. Siden en enkelt mig, (I) PSC svar tilskrives en enkelt vesikel af glutamat eller GABA, en stigning i mig (jeg) PSC amplitude antyder postsynaptiske styrke. Med mig, (I) PSC analyse fandt individuelle forskelle i styrken af excitatoriske/hæmmende input til hver CA1 neuron (figur 5 c). IA uddannelse klart forfremmet mangfoldighed i synaptisk styrke, men dette blev ikke observeret i andre grupper (tabel 5).
Læring-induceret synaptic mangfoldighed kan analyseres matematisk. Ved at beregne udseende sandsynligheden for hvert punkt, kan data fra hver neuron konverteres til self-entropi (bit) ved hjælp af informationsteori Claude E. Shannon21. Et punkt med høj udseende sandsynlighed (omkring det gennemsnitlige niveau) indikerer lav self-entropi, mens et punkt med meget sjældne sandsynlighed (en afbøjet punkt) angiver høj self-entropi. Sammenlignet med utrænede rotter, self-entropi pr. neuron var klart øget i IA-uddannet rotter men ikke i uparrede eller walk-through rotter22. Denne analyse tyder på, at der var en stigning i intra-CA1 oplysninger efter den kontekstuelle læring.
Skive patch klemme teknik kan også bruges, for cued frygt conditioning undersøgelser i den laterale amygdala9 og sanseoplevelse undersøgelser i tønde cortex8. Desuden, denne teknik kan bruges med forskellige andre teknikker til yderligere undersøgelser. For eksempel, virus-medieret grøn fluorescerende proteiner (NGL)-mærket gen levering teknik kan kombineres med patch klemme teknik til at analysere funktionen af specifikke molekyler. Fokale mikroinjektion af et retrograd tracer kan desuden bruges til at visualisere specifikke neuroner at projektet til et bestemt område. Derefter, ved hjælp af strøm-clamp-teknik, celle-specifikke egenskaber kan analyseres i visualiseret neuroner23. Yderligere, kombinerer to-foton laser scanning mikroskopi med to-foton laser uncaging af glutamat er blevet brugt til at demonstrere rygsøjlen-specifikke vækst og EPSC svar i mus kortikale layer II/III pyramideformet neuroner19. Skive patch klemme teknik er således forbedres ved at kombinere det med romanen kemikalier, gen levering og foto manipulation teknikker.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter. Vi bekræfter, vi har læst Journals holdning til spørgsmål involveret i etiske publikation, og vi bekræfter, at denne betænkning er i overensstemmelse med disse retningslinjer. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling eller analyse, beslutningen om at offentliggøre eller udarbejdelsen af manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. pote-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin og Mrs H. Tsurutani for deres tekniske bistand. Dette projekt blev støttet af Grants-in-Aid for unge forskere (H.K. og Y.S.), videnskabelig forskning B (DM), videnskabelig forskning C (DM), og videnskabelige forskning i Innovative områder (DM), fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab, og Teknologi i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
| inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
| Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
| Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
| Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
| Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
| pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
| Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
| Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
| Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
| Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
| Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
| Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
| Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
| Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
| Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
| Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection buffer/ artificial CSF |
|||
| NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
| MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
| Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
| Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
| HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
| EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
| Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
| Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
| Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
| CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs in aCSF | |||
| 2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
| Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
| CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
| APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Kida, H., et al. Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III. Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).
- Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).
- Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning. Science. 308 (5718), 83-88 (2005).
- Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).
- Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses. Nat Commun. 4, 2760 (2013).
- Kida, H., Mitsushima, D. Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex. Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).
- Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses. Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).
- Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine. Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).
- Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths. Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).
- Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat. J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).
- Tennant, K. A., et al. The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture. Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).
- Pinheiro, P. S., Mulle, C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).
- Hess, G., Donoghue, J. P. Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps. J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).
- Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Sys Tech J. 27, (1948).
- Ono, K. M., D, Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse. J Physiol Sci. 67, (2017).
- Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).
