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Neuroscience

सीखने-प्रेरित प्लास्टिक विश्लेषण के लिए स्लाइस पैच दबाना तकनीक

Published: November 11, 2017 doi: 10.3791/55876
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Yamaguchi University Graduate School of Medicine

Summary

टुकड़ा पैच दबाना तकनीक आंतरिक गुण और उत्तेजक या निरोधात्मक synapses की प्लास्टिक में सीखने प्रेरित परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रभावी तरीका है ।

Abstract

स्लाइस पैच दबाना तकनीक सीखने प्रेरित तंत्रिका प्लास्टिक की विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । मोटर सीखने प्रेरित प्लास्टिक का विश्लेषण करने के लिए, हम एक त्वरित रोटर रॉड कार्य का उपयोग चूहों को प्रशिक्षित किया । चूहों 1 या 2 दिनों के लिए 30-s अंतराल पर 10 बार कार्य प्रदर्शन किया । पहले ट्रायल के मुकाबले प्रशिक्षण के दिनों में प्रदर्शन में काफी सुधार हुआ । हम तो अप्रशिक्षित और प्रशिक्षित चूहों में प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (M1) के तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें तैयार । वर्तमान क्लैंप विश्लेषण आराम झिल्ली की क्षमता में गतिशील परिवर्तन दिखाया, कील दहलीज, afterhyperpolarization, और परत द्वितीय में झिल्ली प्रतिरोध/ वर्तमान इंजेक्शन अप्रशिक्षित नियंत्रण में से 2 दिन प्रशिक्षित चूहों में कई और spikes प्रेरित किया ।

प्रासंगिक अध्ययन प्रेरित प्लास्टिक का विश्लेषण करने के लिए, हम एक निरोधात्मक परिहार (IA) कार्य का उपयोग चूहों को प्रशिक्षित किया । एक बॉक्स के अंधेरे पक्ष में पैर के झटके का सामना करने के बाद, चूहों इसे से बचने के लिए, हल्के पक्ष में रहना सीखा. हम अप्रशिक्षित, IA-प्रशिक्षित, ख़राब, और चलते-चलते चूहों से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस तैयार करते हैं । वोल्टेज दबाना विश्लेषण क्रमिक रूप से एक ही mIPSCs ंयूरॉन से लघु उत्तेजक और निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (mEPSCs और CA1) रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हम प्रत्येक CA1 ंयूरॉन में अलग मतलब mEPSC और mIPSC आयाम पाया, सुझाव है कि प्रत्येक ंयूरॉन अपनी उत्तेजक और निरोधात्मक synapses में विभिंन postsynaptic ताकत थी । इसके अलावा, अप्रशिक्षित नियंत्रण के साथ तुलना में, IA प्रशिक्षित चूहों उच्च mEPSC और mIPSC आयाम था, व्यापक विविधता के साथ । इन परिणामों का सुझाव दिया है कि प्रासंगिक सीखने प्रत्येक CA1 ंयूरॉन में दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक synapses में postsynaptic विविधता पैदा करता है ।

AMPA या गाबाएक रिसेप्टर्स postsynaptic धाराओं मध्यस्थता करने के लिए लग रहा था, CNQX या bicuculline के साथ स्नान उपचार के बाद से mEPSC या mIPSC घटनाओं, क्रमशः अवरुद्ध. इस तकनीक का इस्तेमाल अन्य क्षेत्रों में सीखने के विभिन्न प्रकारों जैसे संवेदी प्रांतस्था और प्रमस्तिष्कखंड के अध्ययन के लिए किया जा सकता है ।

Introduction

पैच दबाना तकनीक, Neher और Sakmann द्वारा विकसित, व्यापक रूप से electrophysiological प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है1. पूरे सेल पैच दबाना तकनीक2 intracellular वर्तमान या वोल्टेज सेल झिल्ली के gigaohm सील का उपयोग कर रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वर्तमान दबाना तकनीक हमें क्षमता, प्रतिरोध, और समाई3आराम के रूप में झिल्ली संपत्तियों में मतभेदों का विश्लेषण करने की अनुमति देता है । वोल्टेज दबाना तकनीक हमें दोनों उत्तेजक और निरोधात्मक synapses में सीखने प्रेरित synaptic प्लास्टिक का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है ।

प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (M1) एक केंद्रीय क्षेत्र है कि कुशल स्वैच्छिक आंदोलनों बनाने के लिए महत्वपूर्ण है । पिछले electrophysiological अध्ययन लंबी अवधि के विकास का प्रदर्शन किया potentiation (LTP)-परत द्वितीय में प्लास्टिक की तरह/III उत्तेजक synapses के बाद कुशल मोटर प्रशिक्षण4। इसके अलावा, vivo इमेजिंग अध्ययन में आगे एक कुशल पहुंच कार्य5,6के बाद M1 वृक्ष spins के remodeling का प्रदर्शन किया । हालांकि, सीखने प्रेरित synaptic और आंतरिक प्लास्टिक के M1 ंयूरॉंस में नहीं दिखाया गया है ।

हमने हाल ही में बताया कि एक रोटर रॉड कार्य glutamatergic और GABAergic synapses में गतिशील परिवर्तन को बढ़ावा दिया और M1 परत द्वितीय में आंतरिक प्लास्टिक की बदल/ यहां हम टुकड़ा पैच दबाना तकनीक का इस्तेमाल सीखने प्रेरित प्लास्टिक की जांच । इस तकनीक का उपयोग अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में अन्य प्रकार के अनुभव पर निर्भर प्लास्टिक की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, प्रति बैरल प्रांतस्था में संवेदी इनपुट AMPA रिसेप्टर-मध्यस्थता उत्तेजक इनपुट को मजबूत कर सकते हैं लेयर II/III न्यूरॉन्स8में, और cued डर कंडीशनिंग पार्श्व उत्तेजक ंयूरॉंस पर प्रमस्तिष्कखंड आदानों को मजबूत, जो के लिए आवश्यक है भय स्मृति9. इसके अलावा, प्रासंगिक सीखने हिप्पोकैम्पस CA1 ंयूरॉंस में उत्तेजक और निरोधात्मक synaptic इनपुट के संदर्भ में विविधता बनाता है10,11।

Protocol

< p class = "jove_content" > सभी पशु आवास और शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया यामागुची विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन के पशु प्रयोग के दिशानिर्देशों के अनुसार की गई थी और संस्थागत पशु देखभाल और यामागुची की उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे । University.

< p class = "jove_title" > 1. पशु

  1. 4-से 5 सप्ताहीय पुरुष Sprague-Dawley चूहों (प्रसव 28 से 31 दिन की आयु) का उपयोग करें ।
  2. घर में चूहों को व्यक्तिगत प्लास्टिक के पिंजरों में (४० cm & #215; 25 cm & #215; 25 cm) लगातार तापमान पर बनाए रखा (23 & #176; c & #177; 1 & #176; ग) के अधीन एक 12-h प्रकाश/ चूहों को अद libitum पानी और भोजन तक पहुँच दे.
< p class = "jove_title" > 2. रोटर रॉड टेस्ट

  1. मोटर कौशल सीखने की जांच, विषय प्रत्येक चूहा रोटर रॉड परीक्षण (रॉड व्यास 7 सेमी; लेन चौड़ाई ८.९ सेमी; गिर ऊंचाई २६.७ सेमी) 1 या 2 लगातार दिनों के लिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a किडा एट अल., 2016 < सुप class = "xref" > 7 ). कार्य को शांत, तापमान-नियंत्रित कक्ष में निष्पादित करें (23 & #177; 1 & #176; C). परेशान या परीक्षण से पहले चूहों को संभाल नहीं है ।
  2. त्वरण मोड के लिए रोटर रॉड सेट, जो रैखिकता से बढ़ जाती है 4 घुमावों/न्यूनतम करने के लिए ४० घुमावों/मिनट (8 & #960; मिनट से ८० & #960; मिनट) 5 min.
    3. में
  3. ने आराम से घुमाने वाली रॉड पर चूहा रख दिया. पुष्टि करें कि सभी अंगों रॉड पर हैं ।
  4. मापने विलंबता मोटर प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए घूर्णन रॉड से गिर करने के लिए ।
  5. 30-s अंतराल के साथ प्रत्येक चूहे 10 प्रयास (परीक्षणों) की अनुमति दें ।
  6. अगर चूहा घूर्णन रॉड से गिर जाता है, यह छड़ी पर फिर से सेट एक 10-20 s अंतराल के बाद ।
  7. pentobarbital की अधिक मात्रा के साथ चूहा बलिदान (४०० मिलीग्राम/अंतिम परीक्षण के बाद 30 मिनट । अपने घर पिंजरों में संज्ञाहरण की एक ही खुराक के साथ अप्रशिक्षित नियंत्रण चूहों इंजेक्षन.
< p class = "jove_title" > 3. निरोधात्मक परिहार परीक्षण

  1. की जांच करने के लिए प्रासंगिक अधिगम, विषय चूहों के लिए एक निरोधात्मक परिहार (IA) टेस्ट (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 डी में Mitsushima एट अल., २०११, 2013 < सुप वर्ग = "xref" > १० , < सुप वर्ग = "xref" > ११ ) अन्य लोगों के साथ संपर्क के रूप में प्रयोग के दिन पर किसी भी प्रासंगिक अनुभवों से बचें, पिंजरे में परिवर्तन या सफाई. कार्य को शांत, तापमान-नियंत्रित कक्ष में निष्पादित करें (23 & #177; 1 & #176; ग).
    नोट: आइए प्रशिक्षण उपकरण एक दो-मंडलों एक्रिलिक बॉक्स (लंबाई ३३ सेमी; चौड़ाई ५८ सेमी; ऊंचाई ३३ सेमी) है । यह एक प्रकाशित सुरक्षित पक्ष और एक अंधेरे सदमे पक्ष है कि एक जाल दरवाजे से अलग कर रहे है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 डी ).
  2. को सुरक्षित (लिट) साइड में चूहे की जगह रोशन बाक्स में रखें । तनाव के बिना धीरे से चूहे को संभालें ।
  3. कम समय (10 से 20 एस) का इंतजार करते हुए चूहे को पर्यावरण के acclimate ।
  4. स्लाइडिंग दरवाजा खोलने के लिए चूहे की अनुमति देगा पर डार्क बॉक्स में प्रवेश करने के लिए ।
  5. उपाय विलंबता (ओं) से पहले चूहे बॉक्स के उपंयास अंधेरे पक्ष में प्रवेश करती है । पहले परीक्षण की लेटेंसी चूहा & #39; एस प्रशिक्षण से पहले प्रदर्शन का प्रतिनिधित्व करता है ।
    6. अंधेरे पक्ष में प्रवेश के बाद
  6. , दरवाजा बंद करो और बिजली के इस्पात बॉक्स के फर्श में सेट छड़ के माध्यम से एक तले हुए बिजली के पैर सदमे (2 एस, १.६ मा) लागू होते हैं । अनुमति देने के लिए चूहों के माध्यम से चलने के लिए प्रशिक्षण तंत्र का पता लगाने के बिना 1 मिनट चौंक जा रहा है । घर कई दिनों के लिए एक प्रबुद्ध सदमे पिंजरे में चूहों ख़राब और अचानक प्रासंगिक अनुभवों के बिना सदमे दे । धीरे से किसी भी समूह में तनाव के बिना संभाल ।
  7. घर के पिंजरे में लौटने से पहले प्रत्येक चूहे को 10 एस के लिए डार्क बॉक्स में रखें ।
    8. पैर के झटके के बाद 30 मिनट पर
  8. , फिर बॉक्स की लाइट्ड साइड में चूहे की जगह. अंधेरे पक्ष में प्रवेश करने के लिए विलंबता उपाय.
  9. घर के पिंजरे में चूहा लौटा ।
    10. झटके के बाद ६० मिनट पर
  10. ने pentobarbital (४०० मिलीग्राम/) की ओवरडोज के साथ चूहा कुर्बान कर दिया । धीरे चूहे संभाल और संज्ञाहरण intraperitoneally सुई । अप्रशिक्षित नियंत्रण चूहों में, ऊपर वर्णित अनुभव के बिना अपने घर पिंजरों में संज्ञाहरण सुई ।
< p class = "jove_title" > 4. विच्छेदन बफर

  1. के क्रिस्टल भंग ०.१९५ g णः 2 पो 4 -2H 2 O, ०.१८८ g KCl, ०.०७४ g CaCl 2 , १.४२३ g MgCl 2 -6H 2 O, व १२.५७९ ग्राम choline क्लोराइड में ultrapure जल (९०० मिलीलीटर से ९५० मिलि) . तालिका 1.
    2. देखें
  2. २.३४० ग्राम ascorbic एसिड की क्रिस्टल भंग, ०.३४२ ग्राम पाइरुविक एसिड सोडियम नमक, २.१०० ग्राम NaHCO 3 , और ४.५०० ग्राम ग्लूकोज.
  3. में १००० मिलीलीटर तक पानी डालें । परासरणीयता की श्रेणी २९० mOsm/l और ३०० mOsm/l के बीच होगी परासरणीयता ultrapure पानी से जोड़कर समायोजित करें, यदि यह सीमा से अधिक है ।
  4. बुलबुला 5% कं 2 के साथ समाधान/९५% हे 2 उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए बर्फ ठंडा तापमान पर गैस मिश्रण ।
< p class = "jove_title" > 5. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF)

  1. के क्रिस्टल भंग ०.१८६ g KCl, ६.७०० g NaCl, और ०.१५६ g णः 2 पो 4 -2H 2 O में ultrapure पानी (९०० मिलीलीटर से ९५० मिलीलीटर) । तालिका 2.
    2. देखें
  2. 5 min.
    3. के लिए गैस मिश्रण के साथ बुलबुला
  3. के क्रिस्टल भंग १.८०० g ग्लूकोज और २.१८४ g NaHCO 3 और फिर जोड़ें 4 एमएल MgCl 2 और 4 एमएल CaCl 2 से 1 मीटर स्टॉक सॉल्यूशंस.
  4. में १००० मिलीलीटर तक पानी डालें । परासरणीयता की श्रेणी २९० mOsm/l और २९५ mOsm/l के बीच होगी परासरणीयता ultrapure पानी से जोड़कर समायोजित करें, यदि यह सीमा से अधिक है ।
    5. उपयोग करने से पहले गैस मिश्रण के साथ
  5. बुलबुला.
< p class = "jove_title" > 6. Intracellular समाधान

  1. के लिए वर्तमान-दबाना रिकॉर्डिंग (तालिका 3), भंग ०.०७४६ g KCl, ६.०८९ g K-gluconate, ०.४७६ g HEPES, ०.०४५६ g EGTA, और ५०० & #181; L MgCl 2 से 1 M स्टॉक समाधान में १८० मिलीलीटर ultrapure पानी (समायोजित पीएच KOH के साथ ७.२) ।
    1. जोड ०.४४०८ g न 2 -एटीपी, ०.०४१८ g न 3 -GTP, व ०.५१० g ना-phosphocreatine. २०० मिलीलीटर के लिए पानी जोड़ें और ७.३५ KOH के साथ पीएच को समायोजित करें ।
    2. को ultrapure पानी से जोड़कर परासरणीयता को लगभग २९० mOsm/ फ्रीजर में 1-एमएल aliquots के रूप में
    3. स्टोर (-30 & #176; C).
  2. वोल्टेज के लिए-दबाना रिकॉर्डिंग (तालिका 4), भंग ५.२४४ g CsMeSO 3 , ०.६७२ g CsCl, ०.४७६ g HEPES, ०.०४५६ g EGTA, और ५०० & #181; L MgCl 2 से 1 M स्टॉक समाधान में १८० मिलीलीटर ultrapure पानी । CsOH के साथ ७.२ के लिए पीएच समायोजित करें । mEPSP और mIPSP रिकॉर्डिंग के लिए, ५.८१४ g CsMeSO 3 और ०.२५२ g CsCl की उत्क्रमणीय क्षमता को समायोजित करने के लिए संशोधित एकाग्रता का उपयोग करें गाबा एक रिसेप्टर प्रतिक्रिया < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
    1. जोड ०.४४०८ g न 2 -एटीपी, ०.०४१८ g न 3 -GTP, व ०.५१० g ना-phosphocreatine. २०० मिलीलीटर के लिए पानी जोड़ें और CsOH के साथ ७.३५ के लिए पीएच समायोजित करें ।
    2. को ultrapure पानी से जोड़कर परासरणीयता को लगभग २९० mOsm/ फ्रीजर में 1-एमएल aliquots के रूप में
    3. स्टोर (-30 & #176; C).
< p class = "jove_title" > 7. स्लाइस वडा

  1. से पहले बलिदान, शांत-कुचल बर्फ के साथ सभी विच्छेदन उपकरण (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ). संपर्क सतह क्षेत्र में वृद्धि करने के लिए कुचल बर्फ कंटेनर में ठंडे पानी की ५०० मिलीलीटर के बारे में जोड़ें । इस कार्यविधि का वर्णन पहले < सुप वर्ग = "xref" > 10 , < सुप class = "xref" > 11 , < सुप class = "xref" > 12 .
    नोट: यहां उपकरण हैं: बड़ी कैंची, आइरिस कैंची, एक रंग, एक माइक्रो रंग, संदंश, चिमटी, एक स्टेनलेस स्टील २००-एमएल चोंच, मस्तिष्क trimming के लिए एक ब्लेड, एक १२० मिलीलीटर कार्डियक छिड़काव सिरिंज के साथ भरा हुआ बफर गैस मिश्रण के साथ इलाज किया, एक सिलिकॉन ट्यूब (20 सेमी) एक चपटा 18 गेज सुई, एक स्टेनलेस मस्तिष्क विच्छेदन चरण (मोटाई = 3 मिमी, & #981; = 12 सेमी), और vibratome के लिए एक बढ़ते चरण से जुड़ा (& #981; = 5 सेमी).
  2. anesthetizing द्वारा व्यवहार प्रतिमान पूरा करने के बाद चूहा 30 मिनट बलिदान pentobarbital की अधिक मात्रा के साथ यह (४०० मिलीग्राम/kg bodyweight) । स्लाइस करने की तैयारी तेजी से करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाईस यथासंभव स्वस्थ हों < सुप वर्ग = "xref" > १० , < सुप वर्ग = "xref" > ११ , < सुप क्लास = "xref" > १२ . ब्रेन extrकार्रवाई प्रोटोकॉल हमारे विश्वविद्यालय के लिए सभी पशु चिकित्सा मानकों को पूरा करती है ।
  3. भरें एक १२०-बर्फ ठंडा विच्छेदन बफर (तालिका 1) एक 5% कं 2 /९५% के साथ bubbled के साथ सिरिंज 2 गैस मिश्रण । छिड़काव.
    4. करने से पहले किसी भी हवा के बुलबुले निकालें
  4. दिल को उजागर करने के बाद, बाईं निलय के पीछे के हिस्से में सुई डालें.
  5. मैन्युअल सिरिंज का उपयोग कर मस्तिष्क के transcardial छिड़काव प्रदर्शन. बड़े चूहों छिड़काव के लिए और अधिक विच्छेदन बफर की आवश्यकता है । बर्फ के साथ मस्तिष्क जलमग्न-शीत विच्छेदन बफर के लिए 5 min. डुबकी के दौरान लगातार बफर बुलबुला.
  6. एक ब्लेड का उपयोग लक्ष्य cortical क्षेत्र के वृक्ष उंमुखीकरण के समानांतर एक कोण पर मस्तिष्क के पीछे की ओर ट्रिम कर दीजिए । के बाद से मस्तिष्क कट अंत नीचे के साथ विच्छेदन मंच पर खड़ा है, प्रारंभिक कोण सभी बाद में मस्तिष्क स्लाइस के कोण निर्धारित करता है । यह चरण क्रिटिकल महत् (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा b ) है । एक गलत कोण लक्ष्य पिरामिड ंयूरॉंस के माध्यम से कटौती कर सकते हैं ।
    नोट: उपकरण यहां हैं: मस्तिष्क trimming के लिए एक ब्लेड, एक फिल्टर पेपर (& #981; = 10 सेमी), एक स्टेनलेस मस्तिष्क विच्छेदन मंच (मोटाई = 3 मिमी, & #981; = 12 सेमी), एक रंग, एक superglue, एक ड्रॉपर, और vibratome के लिए एक बढ़ते चरण (& #981; = 5 सेमी).
  7. कट ३५०-& #181; m थिक कोरोनर ब्रेन स्लाइस एक vibratome का उपयोग कर । बर्फ ठंडा बफर के साथ विच्छेदन कक्ष भरें एक 5% के साथ bubbled सह 2 /९५% O 2 गैस मिक्सचर (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2c ). बफर मस्तिष्क टुकड़ा के दौरान लगातार बुलबुला ।
  8. आईरिस कैंची का उपयोग कर लक्ष्य क्षेत्र की परिधि ट्रिम कर दीजिए ।
  9. कमरे के तापमान में धीरे से छंटनी की स्लाइस धोने aCSF 5% के साथ bubbled सह 2 /९५% O 2 (तालिका 2).
  10. एक अंतरफलक कक्ष में छंटनी की स्लाइसें बनाए रखने जब तक रिकॉर्डिंग किया जाता है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2d और ई ). कक्ष में 1 एच के लिए मशीन कोशिकाओं की हालत में सुधार, लेकिन phenotypes परिवर्तन यदि स्लाइसें से अधिक 10 घंटे के लिए मशीन हैं । बंद करो चैंबर के ढक्कन गैसों और aCSF.
    11. के छोटे तरल बूंदें संलग्न करने के लिए
< p class = "jove_title" > 8. पूरे सेल पैच दबाना

< p class = "jove_content" > नोट: पूरे सेल रिकॉर्डिंग एक एम्पलीफायर और 5 kHz के एक cutoff आवृत्ति के लिए सेट है कि एक कम पास फिल्टर की आवश्यकता होती है. संकेतों डिजीटल और एक पीसी में संग्रहित कर रहे हैं । संग्रहीत डेटा ऑफ़लाइन विश्लेषण कर रहे हैं (< सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 3 ए ).

  1. एक क्षैतिज खींचने का उपयोग कर कांच इलेक्ट्रोड बनाने. एक उपयुक्त समाधान के साथ इलेक्ट्रोड भरें (टेबल्स 3 और 4) एक नियमित पॉलीथीन का उपयोग 1-एमएल एक ठीक ग्लास ट्यूब से जुड़ी सिरिंज और एक ०.२२-& #181; m फ़िल्टर.
  2. पहले कक्ष के साथ संपर्क करने के लिए, सकारात्मक दबाव बनाए रखने और पिपेट वर्तमान शूंय करने के लिए समायोजित करें ।
  3. एक gigaohm सील बनाने के बाद, कोशिका झिल्ली टूटना करने के लिए नकारात्मक दबाव लागू (< मजबूत वर्ग में पूरे सेल विन्यास = "xfig" > चित्रा 3F ).
< p class = "jove_title" > 9. वर्तमान-क्लैंप विश्लेषण

  1. कोशिका झिल्ली
      के गुण
    1. वर्तमान-दबाना रिकॉर्डिंग (तालिका 3) के लिए पिपेट समाधान के साथ पैच रिकॉर्डिंग intracellular भरें । पिपेट का प्रतिरोध 4 m & #937 के बीच है; और 7 m & #937; म aCSF
    2. के बाद झिल्ली टूटना, पर झिल्ली वोल्टेज पकड़-६० एमवी वी में दबाना मोड । फिर, & #34 से स्विच करें; बाथ & #34; मोड टू & #34; सेल & #34; मोड झिल्ली में परीक्षण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए आंतरिक कोशिका गुण जैसे कि म्यूकोसा समाई, प्रतिरोध, और समय स्थिरांक को मापने के लिए ।
  2. चालू इंजेक्शन अध्ययन
    1. आंतरिक कोशिका संपत्तियों को रिकॉर्ड करने के बाद, मोड को वी-क्लैंप से ट्रैक करने के लिए स्विच करें (मैं = 0) वर्तमान इंजेक्शन के लिए सामान्य/I-CLAMP । ध्यान दें कि तरल जंक्शन संभावित सही नहीं किया जाना चाहिए < सुप वर्ग = "xref" > १० .
    2. ३०० ms के लिए सेल में करंट इंजेक्ट करें & #8722 से चालू stepwise की तीव्रता बदलें; १०० pa से + ५५० pa के साथ ५०-pa बढ़ाता है । spikes की संख्या की गणना (कार्रवाई की क्षमता) वर्तमान इंजेक्शन द्वारा ।
    3. न्यूनतम वोल्टेज एक कार्रवाई क्षमता प्रेरित करने के लिए आवश्यक उपाय (यह दहलीज वोल्टेज है).
    4. के बीच अंतर के रूप में afterhyperpolarization आयाम की गणना स्पाइक दीक्षा और सबसे कम वोल्टेज पर प्राप्त afterhyperpolarization < सुप वर्ग = "xref" > ७ .
< p class = "jove_title" > 10. वोल्टेज दबाना विश्लेषण

  1. the AMPA/एनएमडीए अनुपात
    नोट: AMPA/एनएमडीए अनुपात postsynaptic glutamatergic में उत्तेजक प्लास्टिक का मूल्यांकन करने के लिए एक पारंपरिक तरीका है synapses < सुप class = "xref" > 7 , < सुप class = "xref" > 8 , < सुप वर्ग = "xref" > ९ , < सुप वर्ग = "xref" > १० , < सुप वर्ग = "xref" > ११ . हालांकि, दोनों घटकों में सहवर्ती वृद्धि अनुपात < सुप वर्ग = "xref" > 13 नहीं बदल सकता है कि ध्यान दें ।
    1. Perfuse शारीरिक समाधान के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर गैस मिश्रण के साथ bubbled और तापमान को बनाए रखने में 22 & #176; c से 25 & #176; c. ०.१ mM picrotoxin को ब्लॉक करने के समाधान में जोड़ें गाबा एक मध्यस्थता प्रतिक्रिया और जोड़ 4 & #181; एम 2- chloroadenosine को स्थिर करने के लिए पैदा तंत्रिका प्रतिक्रिया < सुप वर्ग = "xref" > १४ .
    2. वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग (तालिका 4) के लिए intracellular समाधान के साथ पैच रिकॉर्डिंग पिपेट भरें । aCSF में रिकॉर्डिंग पिपेट के प्रतिरोध की जांच करें । प्रतिरोध के बीच 4 m & #937; र 7 m & #937;.
    3. में रिकॉर्डिंग के लिए द्वितीय/III हवामहल न्यूरॉन्स में एम 1, प्लेस एक द्विध्रुवी टंगस्टन उत्तेजक इलेक्ट्रोड २०० & #181; m से ३०० & #181; m करने के लिए कक्षों को पार्श्व में रिकॉर्ड किया जा करने के लिए, forelimb प्रतिनिधित्व के क्षेत्र में pial सतह के नीचे (2-mm पार्श्व midline) < सुप class = "xref" > 15 , < सुप class = "xref" > 16 , < सुप class = "xref" > 17 .
      4. एक CA1 पिरामिडीय ंयूरॉन में रिकॉर्डिंग के लिए
    4. , उत्तेजक इलेक्ट्रोड २०० & #181; m से ३०० & #181; m पार्श्व (Schaffer संपार्श्विक फाइबर) या औसत दर्जे (temporoammonic मार्ग) कोशिकाओं है कि रिकॉर्ड किया जाएगा (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ).
    5. उत्तेजना तीव्रता को बढ़ाने के लिए synaptic प्रतिक्रिया & #62; 10 pA.
    6. & #8722 पर मापी गई पीक करेंट के अनुपात के रूप में AMPA/एनएमडीए अनुपात की गणना करें; ६० mv वर्तमान में मापा + ४० एमवी उत्तेजना शुरुआत के बाद १५० msec पर । ध्यान दें कि ५० करने के लिए १०० निशान अनुपात की गणना करने के लिए औसत होना चाहिए ।
  2. लघु postsynaptic वर्तमान रिकॉर्डिंग
    नोट: लघु उत्तेजक postsynaptic धाराओं (mEPSCs) ग्लूटामेट के एक एकल presynaptic के पुटिका रिलीज द्वारा निकाली गई प्रतिक्रियाओं के अनुरूप करने के लिए लगा रहे हैं < सुप वर्ग = "xref" > १८ . इसके विपरीत, लघु निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (mIPSCs) गाबा के एक एकल पुटिका के presynaptic रिलीज द्वारा बटोरी प्रतिक्रियाओं के अनुरूप करने के लिए लगा रहे हैं < सुप वर्ग = "xref" > १८ . mEPSCs और mIPSCs के आयाम में बढ़ता है postsynaptic संचरण को मजबूत बनाने को दर्शाता है, जबकि समारोह आवृत्ति में बढ़ता है कार्यात्मक synapses की संख्या में वृद्धि को प्रतिबिंबित या presynaptic रिलीज प्रायिकता < सुप वर्ग = "xref" > 11
    1. संशोधित intracellular समाधान (तालिका 4) के साथ पैच रिकॉर्डिंग पिपेट को भरने के लिए गाबा की उत्क्रमणीय क्षमता को समायोजित करने के लिए एक रिसेप्टर-मध्यस्थता वर्तमान करने के लिए-६० एमवी.
    2. जोड ०.५ & #181; M tetrodotoxin स्नान करने के लिए सहज क्रिया क्षमता ब्लॉक ।
    3. पकड़ वोल्टेज पर-६० एमवी करने के लिए आरecord के लिए mEPSC घटनाओं 5 min.
    4. 5 मिनट के लिए mIPSC घटनाओं रिकॉर्ड करने के लिए 0 एमवी के लिए होल्डिंग क्षमता बदल जाते हैं । m1 न्यूरॉन्स थोड़ा उच्च उत्क्रमण क्षमता AMPA रिसेप्टर-मध्यस्थ धाराओं के लिए दिखाएँ, क्योंकि m1 न्यूरॉन्स के mIPSCs पर दर्ज कर रहे हैं + 15 एमवी के साथ ०.१ मिमी APV.
    5. वर्तमान स्थिर करने के लिए कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ।
    6. के लिए mIPSC घटनाओं रिकॉर्ड 5 min.
    7. लघु सॉफ्टवेयर का उपयोग कर घटनाओं का पता लगाने, और विश्लेषण के लिए 10 पीए ऊपर घटनाओं का उपयोग करें । आवृत्ति निर्धारित करने के लिए 5 मिनट के लिए mEPSCs या mIPSCs ईवेंट्स की संख्या की गणना करें । औसत घटनाओं के आयाम मतलब आयाम प्राप्त करने के लिए ।
    8. पुष्टि करें कि क्या 10 & #181 के साथ स्नान उपचार; मी CNQX या साथ १० & #181; मी bicuculline methiodide ब्लॉक्स mEPSCs आणि mIPSCs स्पर्धा, क्रमशः.
  3. मीन्स-पल्स विश्लेषण
    नोट: Presynaptic प्लास्टिक की जोड़ी-नाड़ी विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । युग्मित-पल्स दर में वृद्धि presynaptic ग्लूटामेट या गाबा रिलीज़ प्रायिकता में कमी का पता चलता है < सुप वर्ग = "xref" > 7 , < सुप वर्ग = "xref" > 10 , < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
    1. उत्तेजक synapses का विश्लेषण करने के लिए, जोड़ें ०.१ mM picrotoxin और पर प्रतिक्रिया रिकॉर्ड-६० एमवी । हालांकि हमने जोड़ा 4 & #181; M 2-नहाने के लिए chloroadenosine, हमें ध्यान में रखना चाहिए कि दवा presynaptic रिलीज प्रायिकता को प्रभावित करता है < सुप क्लास = "xref" > 14 .
    2. निरोधात्मक synapses का विश्लेषण करने के लिए, जोड़ें ०.१ मिमी APV और 4 & #181; एम 2-chloroadenosine स्नान करने के लिए और 0 एमवी पर प्रतिक्रिया रिकॉर्ड. एम 1 न्यूरॉन्स में, + 15 एमवी.
      3. पर प्रतिक्रिया रिकॉर्ड
    3. एक अंतर-उत्तेजना अंतराल के साथ युग्मित दालों लागू १०० ms या २०० ms.
    4. रिकॉर्ड 50-100 अनुक्रमिक प्रत्येक होल्डिंग क्षमता पर निशान और औसत मूल्यों.
    5. postsynaptic वर्तमान की पहली चोटी के लिए दूसरी चोटी के अनुपात के रूप में युग्मित पल्स अनुपात की गणना.

Representative Results

जैसा कि हम हाल ही में7वर्णित है, रोटर रॉड प्रशिक्षण (चित्रा 1a) M1 परत द्वितीय के आंतरिक प्लास्टिक की में गतिशील परिवर्तन प्रेरित/ विलंबता मापने जब तक चूहों घूर्णन रॉड से गिर हमें चूहे के कुशल सीखने के प्रदर्शन का अनुमान लगाने के लिए अनुमति देता है । अब विलंबता बेहतर मोटर प्रदर्शन इंगित करता है । प्रशिक्षण के दिन 1 पर, चूहों उनके रोटर रॉड प्रदर्शन में सुधार जब तक परीक्षण समाप्त हो गया । 2 दिन पर, चूहों औसत सत्र स्कोर (चित्र 1b) में लगभग asymptotic स्तर प्राप्त । पहले परीक्षण में विलंबता के साथ तुलना में, पोस्ट-हॉक विश्लेषण प्रशिक्षण दिन (चित्रा 1C) पर अंतिम परीक्षणों में महत्वपूर्ण सुधार दिखाया ।

चित्रा 4a वर्तमान-क्लैंप विश्लेषण जिसमें ंयूरॉन गुण मोटर कौशल सीखने के बाद बदल का एक उदाहरण से पता चलता है । ४०० फिलीस्तीनी अथॉरिटी और ५०० पीए धाराओं के इंजेक्शन अप्रशिक्षित समूह में और 1 दिन प्रशिक्षित चूहों में कार्रवाई की क्षमता प्रेरित करने की जरूरत थी, क्रमशः । इसके विपरीत, केवल एक १५० पीए वर्तमान के इंजेक्शन के लिए 2 दिन प्रशिक्षित चूहों में कार्रवाई की क्षमता को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था । वर्तमान तीव्रता और कार्रवाई संभावितों की संख्या के बीच का संबंध चित्रा 4Bमें दिखाया गया है । के रूप में कम के रूप में ५० पीए वर्तमान 2 में spikes-दिन प्रशिक्षित चूहों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था; इसके विपरीत, 1 दिन प्रशिक्षित चूहों ३५० फिलीस्तीनी अथॉरिटी और उच्च धाराओं के लिए अप्रशिक्षित चूहों से कम कार्रवाई क्षमता के साथ जवाब दिया । इसके अलावा, चित्रा 4c से पता चलता है कि 1-दिन प्रशिक्षित चूहों कम आराम क्षमता, उच्च स्पाइक सीमा, और गहरी afterhyperpolarization दिखाया, जबकि 2 दिन प्रशिक्षित चूहों उच्च आराम क्षमता दिखाया (आंकड़ा 4c) और झिल्ली प्रतिरोध ( चित्र 4d) ।

जैसा कि हम पहले11वर्णित है, IA प्रशिक्षण (चित्रा 1 डी) उत्तेजक और हिप्पोकैम्पस CA1 ंयूरॉंस की निरोधात्मक synapses में postsynaptic प्लास्टिक प्रेरित । प्रकाश बॉक्स में विलंबता को मापने के द्वारा, हम चूहे के प्रासंगिक सीखने के प्रदर्शन का अनुमान लगा सकता है । आरेख 1E IA कार्य के परिणाम दिखाता है । युग्मित बिजली के झटके के बाद, चूहों को बॉक्स के अंधेरे पक्ष से बचने के लिए और प्रकाश में रहने की ओर है, जो आम तौर पर वे पसंद नहीं करेंगे सीखते हैं । अंधेरे पक्ष से बचने की प्रवृत्ति इसलिए प्रासंगिक यादों के अधिग्रहण इंगित करता है ।

चित्रा 5 वोल्टेज का एक उदाहरण से पता चलता है-दबाना विश्लेषण जिसमें लघु postsynaptic धाराओं नाटकीय रूप से प्रासंगिक सीखने के बाद बदल रहे थे । सीखने-प्रेरित प्लास्टिक की जांच करने के लिए, सहज AMPA मध्यस्थता mEPSCs और गाबाएकमध्यस्थता mIPSCs क्रमिक रूप से ०.५ µ एम tetrodotoxin (चित्र 5 ए और बी) की उपस्थिति में दर्ज किए गए थे. के रूप में दो आयामी भूखंडों (चित्रा 5C) पर दिखाया गया है, प्रत्येक CA1 ंयूरॉन अलग मतलब mEPSCs और mIPSCs के लिए आयाम था । हालांकि आयाम कम थे और अप्रशिक्षित में एक संकीर्ण वितरण रेंज दिखाया, ख़राब, और चलना-चूहों के माध्यम से, उन IA में विविध थे प्रशिक्षित चूहों (तालिका 5) । ANOVA के बाद हॉक विश्लेषण द्वारा IA में mEPSC और mIPSC का मतलब आयाम में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई-चूहों (चित्रा 5E) प्रशिक्षित, सीखने-postsynaptic ंयूरॉंस में प्रेरित CA1 प्लास्टिक का सुझाव ।

इसके अलावा, प्रत्येक CA1 ंयूरॉन विभिंन mEPSC और mIPSC आवृत्तियों (चित्रा 5d) का प्रदर्शन किया । हालांकि आवृत्तियों कम थे और unअप्रशिक्षित में एक संकीर्ण वितरण रेंज दिखाया, ख़राब, और चलना-चूहों के माध्यम से, उन IA में विविध थे प्रशिक्षित चूहों (तालिका 6). पोस्ट-हॉक विश्लेषण के बाद ANOVA mEPSC और IA-प्रशिक्षित चूहों (चित्रा 5F) में mIPSC घटनाओं की आवृत्तियों में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई । इन परिणामों के दो संभावित व्याख्या कर रहे हैं । पहला यह है कि प्रासंगिक अधिगम न्यूरॉन्स के कार्यात्मक synapses की संख्या में वृद्धि हुई. अंय यह है कि प्रासंगिक सीखने ग्लूटामेट और गाबा के presynaptic रिलीज संभाव्यता में वृद्धि हुई है ।

आगे presynaptic प्लास्टिक की जांच करने के लिए, हम भी युग्मित पल्स उत्तेजना का आयोजन किया, के रूप में पहले10,11की सूचना दी ।

Figure 1
चित्र 1 : प्रशिक्षण के बाद प्रदर्शन सीखना ।
A: प्रयोगात्मक डिजाइन रोटर रॉड प्रशिक्षण और राज्याभिषेक मस्तिष्क टुकड़ा से पता चलता है । ख: मतलब विलंबता तेजी रोटर रॉड बैरल से गिर करने के लिए । सी: मतलब विलंबता पहली और प्रशिक्षण के दिन 1 और 27पर अंतिम परीक्षणों पर रॉड से गिर करने के लिए । * *P& #60; ०.०१ बनाम प्रथम परीक्षण । D: निरोधात्मक परिहार (IA) कार्य और कोरोनरी ब्रेन स्लाइस की स्कीमा । ई: मतलब विलंबता से पहले और IA प्रशिक्षण11के बाद डार्क बॉक्स में प्रवेश करने के लिए । * *P& #60; ०.०१ बनाम IA प्रशिक्षण से पहले । कोरोनरी वर्गों द्वारा संख्या मिमी में bregma के लिए दूरी पूर्वकाल संकेत मिलता है । जानवरों की संख्या को सलाखों के नीचे दिखाया गया है । त्रुटि पट्टियों का संकेत SEM. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : स्लाइस कार्यविधियाँ.
एक: तस्वीरें तीव्र मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी दिखा । विच्छेदन उपकरण का उपयोग करने से पहले कुचल बर्फ में ठंडा किया गया । बी: मस्तिष्क विच्छेदन और ट्रिमिंग । ध्यान दें कि पीछे की ओर trimming के कोण वृक्ष उंमुखीकरण के साथ समानांतर में उंमुख होना चाहिए । ग: एक vibratome कक्ष में मस्तिष्क की क्रिया । मस्तिष्क विच्छेदन बफर में नहाया और एक 5% सह के साथ लगातार bubbled है2/९५% O2 गैस मिश्रण । D: एक इंटरफेस चैंबर दो प्लास्टिक खाद्य कंटेनर और एक सिलिकॉन ट्यूब से बना है । चैंबर कृत्रिम सीएसएफ से भरा था और गैस मिश्रण के साथ लगातार bubbled । ई: मस्तिष्क स्लाइसें कक्ष में गीले फिल्टर कागज पर रखा गया था ।बार = 5 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : पैच दबाना कार्यविधियां.
a: पैच-क्लैंप प्रणाली एक ंयूरॉन से विद्युत संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया । परत द्वितीय/III न्यूरॉन्स में उत्तेजक और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के स्थान चूहे मोटर प्रांतस्था में दिखाए जाते हैं. ख: एक CA1 पिरामिडीय ंयूरॉन के Schaffer synapses का विश्लेषण करने के लिए, एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड परत radiatum में रखा गया था । temporoammonic synapses का विश्लेषण करने के लिए, एक उत्तेजक इलेक्ट्रोड परत आणविक पर रखा गया था. पैदा AMPA और एनएमडीए रिसेप्टर के प्रतिनिधि अंश-मध्यस्थता उत्तेजक postsynaptic धाराओं में एक ही CA1 ंयूरॉन दिखाया जाता है । C: एक स्लाइस एंकर को रिकॉर्डिंग कक्ष में स्लाइस को स्थिर करने के लिए उपयोग किया गया था । D: प्रकाशित पत्रों के आधार पर मोटर प्रांतस्था में एक निरूपण मानचित्र15,16,17. मिलि = midline । ई: (ऊपरी) और रिकॉर्डिंग (कम) के दौरान पहले M1 लेयर द्वितीय/III न्यूरॉन्स के IR-उद्योग माइक्रोग्राफ । बार = 10 µm. च: स्पर्श (शीर्ष) और झिल्ली टूटना (नीचे) से पहले पिपेट वर्तमान में परिवर्तन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : वर्तमान-क्लैंप विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम7 .
A: कार्रवाई क्षमता के प्रतिनिधि निशान वर्तमान इंजेक्शन के साथ प्रेरण के बाद दर्ज की गई । बी: मतलब वर्तमान इनपुट के बीच संबंध (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) बनाम कार्रवाई संभावित उत्पादन unअप्रशिक्षित (खुली सलाखों), 1 दिन प्रशिक्षित (ग्रे सलाखों), और 2 दिन प्रशिक्षित चूहों (भरा सलाखों) से मस्तिष्क स्लाइस में spikes के (संख्या) । C: क्षमता, थ्रेशोल्ड, और परत II के afterhyperpolarization को आराम/ घ: झिल्ली प्रतिरोध और ंयूरॉंस की श्रृंखला प्रतिरोध । हम प्रत्येक समूह में 9-10 चूहों का इस्तेमाल किया । कक्षों की संख्या प्रत्येक बार में दिखाई जाती है । त्रुटि पट्टियों का संकेत SEM. *p& #60; ०.०५, * *P& #60; ०.०१ vs. अप्रशिक्षित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : वोल्टेज-क्लैंप विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम11 .
अप्रशिक्षित (ए) और mIPSCs परिहार (IA) में लघु उत्तेजक और निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (mEPSCs और निरोधात्मक) के प्रतिनिधि अंश (आइए) प्रशिक्षित चूहों (बी) । mEPSCs पर-६० एमवी और mIPSCs पर 0 एमवी tetrodotoxin (०.५ µ मीटर) की उपस्थिति में एक ही CA1 हवामहल ंयूरॉन में क्रमिक रूप से मापा गया । ऊर्ध्वाधर पट्टी = 20 फिलीस्तीनी अथॉरिटी, क्षैतिज बार = २०० msec. C: मतलब मुझे (I) के दो आयामी भूखंड अप्रशिक्षित, IA-प्रशिक्षित, बिगड़ा, और चलने के माध्यम से चूहों में पीएससी आयाम । D: मुझे के दो आयामी भूखंड (I) पीएससी आवृत्तियों 4 समूहों में । ध्यान दें कि प्रत्येक CA1 ंयूरॉन प्रदर्शित अलग मुझे मतलब है (मैं) पीएससी आयाम और आवृत्तियों । आइए प्रशिक्षण न केवल माध्य आयाम को सुदृढ़ करते हैं (E) बल्कि मुझे (I) पीएससी की घटनाओं (एफ) की आवृत्तियों को भी बढ़ाते हैं. हम प्रत्येक समूह में 4-6 चूहों का इस्तेमाल किया । कक्षों की संख्या पट्टियों के नीचे दिखाई जाती है । लाल प्लस संकेत (सी, डी) और ऊर्ध्वाधर लाइनों (ई, एफ) के साथ सलाखों मतलब ± SEM संकेत. * *P& #60; ०.०१ बनाम अप्रशिक्षित चूहों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

विच्छेदन बफर (कुल 1L)
णः2पो4 • 2H2O ०.१९५ छ १.२५ mmol/L
kcl ०.१८८ छ २.५ mmol/L
CaCl2 ०.०७४ छ ०.५ mmol/L
MgCl२ • 6H२हे १.४२३ छ ७.० mmol/L
Choline क्लोराइड १२.५७९ छ ९० mmol/L
Ascorbic एसिड २.३४० छ ११.६ mmol/L
पाइरुविक अम्ल ०.३४२ छ ३.१ mmol/L
NaHCO3 २.१०० छ 25 mmol/
ग्लूकोज ४.५०० छ 25 mmol/

तालिका 1: वि च्छेदन बफर के लिए एक नुस्खा

कृत्रिम सीएसएफ (कुल 1L)
kcl ०.१८६ छ २.५ mmol/L
nacl ६.७०० छ ११४.६ mmol/L
णः2PO4 • 2H2O ०.१५६ छ 1 mmol/
ग्लूकोज १.८०० छ 10 mmol/
NaHCO3 २.१८४ छ 26 mmol/
1m MgCl2 4 मिलीलीटर 4 mmol/
1m CaCl2 4 मिलीलीटर 4 mmol/

तालिका 2: कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) के लिए एक नुस्खा

वर्तमान दबाना के लिए Intracellular समाधान (कुल २०० mL)
kcl ०.०७४६ छ 5 mmol/
K-Gluconate ६.०८९ छ १३० mmol/L
HEPES ०.४७६ छ 10 mmol/
EGTA ०.०४५६ छ ०.६ mmol/L
1m MgCl2 ५०० µ l २.५ mmol/L
ना2 एटीपी ०.४४०८ छ 4 mmol/
ना३ GTP ०.०४१८ छ ०.४ mmol/L
ना phosphocreatine ०.५१० छ 10 mmol/

तालिका 3: वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक intracellular समाधान के लिए एक नुस्खा

वोल्टेज दबाना के लिए Intracellular सॉल्यूशन (कुल २०० mL)
CsMeSO3 5
. २४४ ग्राम (५.८१४) * ११५ mmol/L (१२७.५) * CsCl ०.६७२ छ (०.२५२) * 20 mmol/ (७.५) * HEPES ०.४७६ छ 10 mmol/ EGTA ०.०४५६ छ ०.६ mmol/L 1m MgCl2 ५०० µ l २.५ mmol/L ना2 एटीपी ०.४४०८ छ 4 mmol/ ना३ GTP ०.०४१८ छ ०.४ mmol/L ना phosphocreatine ०.५१० छ 10 mmol/ लघु रिकॉर्डिंग के लिए * कम सीएल- एकाग्रता

तालिका 4: वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग के लिए एक intracellular समाधान के लिए एक नुस्खा

पैरामीटर अप्रशिक्षित आइए प्रशिक्षित unpaired के माध्यम से चलना
mEPSC आयाम विचरण ५.८ ३२.१ ४.७ ५.९
मानक विचलन २.४ ५.७ २.२ २.४
भिंनता का गुणांक ०.१८९ ०.३२६ ०.१७७ ०.१९०
mIPSC आयाम विचरण १७.१ ५६.७ ३१.८ २०.७
मानक विचलन ४.१ ७.५ ५.६ ४.५
भिंनता का गुणांक ०.२७९ ०.३८७ ०.३६७ ०.२८६

तालिका 5: mIPSC परिहार (IA) में लघु उत्तेजक और निरोधात्मक postsynaptic वर्तमान (mEPSC और निरोधात्मक) आयाम की विविधता-प्रशिक्षित चूहों

पैरामीटर अप्रशिक्षित आइए प्रशिक्षित unpaired के माध्यम से चलना
mEPSC कव विचरण २७८ २१९५ १८८ १९५
मानक विचलन 17 ४७ 14 14
भिंनता का गुणांक ०.९०२ १.१९८ ०.८९३ ०.८७४
mIPSC कव विचरण ३२८२ २७२१२ १३८५ ५१३५
मानक विचलन ५७ १६५ ३७ ७२
भिंनता का गुणांक १.१९५ १.००६ ०.९५५ ०.८३६

तालिका 6: लघु उत्तेजक की विविधता और निरोधात्मक postsynaptic वर्तमान (mEPSC और mIPSC) आवृत्तियों में निरोधात्मक परिहार (IA)-प्रशिक्षित चूहों

Discussion

स्लाइस पैच दबाना तकनीक की प्रमुख सीमा टुकड़ा तैयारी में रिकॉर्डिंग है, जो प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है क्या vivo मेंहोता है । हालांकि vivo में वर्तमान-दबाना विश्लेषण अधिक विश्वसनीय है, यह तकनीकी रूप से जागरूक जानवरों से पर्याप्त डेटा प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । के बाद से प्रत्येक पिरामिड ंयूरॉन अलग सेलुलर गुण है, कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या को ठीक ढंग से प्रशिक्षण के बाद ंयूरॉंस में मतभेदों का विश्लेषण की जरूरत है । इसके अलावा, वोल्टेज दबाना विश्लेषण CNQX, APV, या bicuculline के साथ सतत दवा उपचार की आवश्यकता है postsynaptic प्रतिक्रियाओं की प्रकृति का निर्धारण । ग्लूटामेट या गाबा के एकल पुटिका द्वारा प्रेरित लघु प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए, tetrodotoxin के साथ सतत उपचार सहज कार्रवाई क्षमता को अवरुद्ध करने के लिए आवश्यक है । हालांकि हाल ही में विकसित मल्टी फोटॉन इमेजिंग तकनीक उत्तेजक synapses में रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली है19, vivo मेंsynapses के समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक संयुक्त पैच दबाना तकनीक की जरूरत है । यह वर्तमान में काफी निरोधात्मक synapses में रूपात्मक परिवर्तन का विश्लेषण मुश्किल है, क्योंकि सबसे निरोधात्मक synapses spins फार्म नहीं है । इस समय, स्लाइस पैच दबाना सबसे उपयुक्त तकनीक का विश्लेषण करने के लिए सेल संपत्तियों या उत्तेजक के कार्यों/निरोधात्मक synapses प्रशिक्षित पशुओं में किया जाएगा ।

वर्तमान दबाना विश्लेषण (चित्रा 4) का उपयोग करना, हम हाल ही में मोटर सीखने की सूचना दी-परत द्वितीय में आंतरिक प्लास्टिक की/ विशेष रूप से, 1-दिन प्रशिक्षित चूहों आराम झिल्ली की क्षमता में एक महत्वपूर्ण कमी और स्पाइक दहलीज में वृद्धि दिखाई । 2 दिन प्रशिक्षित चूहों आराम झिल्ली की क्षमता में वृद्धि हुई है कि बढ़ती उत्तेजितता के लिए नेतृत्व में एक महत्वपूर्ण दिखाई दिया । इन परिणामों का सुझाव दिया गया है कि वहां गतिशील में परिवर्तन किया गया M1 परत द्वितीय/III ंयूरॉंस के प्रशिक्षित चूहों में आंतरिक प्लास्टिक की । अतिरिक्त वोल्टेज दबाना विश्लेषण 1 में जोड़ा पल्स अनुपात में वृद्धि-दिन प्रशिक्षित चूहों से पता चला, सुझाव है कि वहां presynaptic गाबा रिलीज संभावना7में एक क्षणिक कमी थी । यह इसलिए संभव है कि गाबा से परत द्वितीय में संकोच/III synapses में एम 1 के परिणामस्वरूप सीखने प्रेरित प्लास्टिक ट्रिगर हो सकता है । इस के समर्थन में, M1 के स्लाइस तैयारी एक गाबाएक रिसेप्टर अवरोधक के साथ स्नान उपचार LTP20प्रेरित करने की आवश्यकता है ।

लघु postsynaptic क्षमता का विश्लेषण IA प्रशिक्षित पशुओं में synaptic प्लास्टिक का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । एक एकल CA1 ंयूरॉन में mEPSCs और mIPSCs के अनुक्रमिक रिकॉर्डिंग synaptic उत्तेजक/निरोधात्मक शक्ति के विश्लेषण की अनुमति देता है प्रत्येक व्यक्ति ंयूरॉन । एक मुझे (मैं) पीएससी प्रतिक्रिया के बाद से ग्लूटामेट या गाबा, मुझे (i) पीएससी आयाम में वृद्धि की एक एकल पुटिका के लिए जिंमेदार ठहराया है postsynaptic मजबूत बनाने का सुझाव है । मुझे (I) पीएससी विश्लेषण का उपयोग करते हुए, हम प्रत्येक CA1 ंयूरॉन (चित्रा 5C) में उत्तेजक/निरोधात्मक इनपुट की ताकत में व्यक्तिगत अंतर पाया । आइए प्रशिक्षण स्पष्ट रूप से synaptic शक्ति में विविधता को बढ़ावा दिया है, लेकिन यह अंय समूहों (तालिका 5) में नहीं देखा गया था ।

सीखने प्रेरित synaptic विविधता गणितीय विश्लेषण किया जा सकता है । प्रत्येक बिंदु की प्रकटन प्रायिकता की गणना करके, प्रत्येक न्यूरॉन से डेटा को क्लाउड ई. शैनन21के सूचना सिद्धांत का उपयोग करके स्वयं-एन्ट्रापी (bit) में परिवर्तित किया जा सकता है. उच्च प्रकटन संभावना (माध्य स्तर के आसपास) के साथ एक बिंदु कम आत्म एन्ट्रापी इंगित करता है, जबकि बहुत दुर्लभ संभावना (एक किंचित बिंदु) के साथ एक बिंदु उच्च स्व-एन्ट्रापी इंगित करता है । अप्रशिक्षित चूहों के साथ तुलना में, स्व-एन्ट्रापी प्रति ंयूरॉन स्पष्ट रूप से IA-प्रशिक्षित चूहों में वृद्धि हुई है या नहीं या चलने में चूहों के माध्यम से22। इस विश्लेषण से पता चलता है कि प्रासंगिक सीखने के बाद इंट्रा-CA1 जानकारी में वृद्धि हुई थी ।

स्लाइस पैच दबाना तकनीक भी पार्श्व प्रमस्तिष्कखंड9 में cued डर कंडीशनिंग अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और8प्रांतस्था बैरल में संवेदी अनुभव अध्ययन के लिए । इसके अलावा, इस तकनीक को आगे की जांच के लिए विभिंन अंय तकनीकों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, वायरस-मध्यस्थता ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)-टैग जीन डिलिवरी तकनीक पैच दबाना तकनीक के साथ संयुक्त किया जा सकता है विशिष्ट अणुओं के समारोह का विश्लेषण । इसके अलावा, एक प्रतिगामी अनुरेखक के फोकल microinjection विशिष्ट न्यूरॉन्स कि एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए परियोजना कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उसके बाद, वर्तमान-दबाना तकनीक का उपयोग कर, कक्ष-विशिष्ट गुण visualized न्यूरॉन्स में23विश्लेषण किया जा सकता है । इसके अलावा, दो के संयोजन-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ दो-फोटॉन लेजर uncaging ग्लूटामेट की रीढ़ की हड्डी विशिष्ट वृद्धि को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और माउस cortical परत द्वितीय में EPSC प्रतिक्रिया/ इस प्रकार, स्लाइस पैच दबाना तकनीक उपंयास रसायनों, जीन वितरण, और फोटो हेरफेर तकनीक के साथ संयोजन के द्वारा सुधार किया जा रहा है ।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा । हम पुष्टि करते है कि हम नैतिक प्रकाशन में शामिल मुद्दों पर है जर्नल की स्थिति को पढ़ा है, और हम पुष्टि करते है कि यह रिपोर्ट उन दिशानिर्देशों के अनुरूप है । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह या विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।

Acknowledgments

हम डॉ पंजा-मिन-Thein-ऊ, डॉ हान-Thiri-ज़ीन, और श्रीमती एच Tsurutani उनकी तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद देना चाहूंगा । इस परियोजना के युवा वैज्ञानिकों (H.K. और Y.S.), वैज्ञानिक अनुसंधान बी (जिलाधिकारी), वैज्ञानिक अनुसंधान सी (जिलाधिकारी), और अभिनव क्षेत्रों में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता द्वारा समर्थित किया गया था (जिलाधिकारी), शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान मंत्रालय से, और जापान की प्रौद्योगिकी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rota-Rod Treadmills Med Associates Inc. ENV577
inhibitory avoidance box Shinano Seisakusho
Pentobarbital Kyoritsu Seiyaku
Blade Nisshin EM Co., Ltd LC05Z
Cardiac perfusion syringe JMS Co., Ltd JS-S00S
Vibratome  Leica Microsystems VT-1200
Horizontal puller Sutter Instrument Model P97
Microfilm 34 gauge World Precision Instruments, Inc MF34G-5
0.22 µm filter Millipore SLGVR04NL
Axopatch–1D amplifier  Axon Instruments
Digidata 1440 AD board Axon Instruments
pCLAMP 10 software Axon Instruments
Upright Microscope Olympus BX51WI
CCD camera Olympus U-CMAD3
Camera controller Hamamatsu Photonics K.K. C2741
Stimulator Nihon Kohden SEN-3301
Isolator Nihon Kohden SS-104J
Motorized manipulator Sutter Instrument MP-285
Micromanipulator Narishige NMN-21
Peristaltic Pump  Gilson, Inc MINIPULS® 3
Glass capillary Narishige GD-1.5
Ag/AgCl electrode  World Precision Instruments, Inc EP4
Slice Anchor Warner instruments 64-0252
Stimulus electrode Unique Medical Co., Ltd KU201-025B
Materials Company Catalog Number Comments
Dissection buffer/
artificial CSF
NaH2PO4 • 2H2O Sigma-Aldrich Co. C1426
KCl Wako Pure Chemical Industries 163-03545
CaCl2 Wako Pure Chemical Industries 039-00475
MgCl2 • 6H2O Wako Pure Chemical Industries 135-00165
Choline chloride  Sigma-Aldrich Co. C7527
Ascorbic acid Wako Pure Chemical Industries 190-01255
Pyruvic acid Na Wako Pure Chemical Industries 199-03062
NaHCO3 Sigma-Aldrich Co. 28-1850-5
Glucose Sigma-Aldrich Co. 07-0680-5
Materials Company Catalog Number Comments
Intracellular solution
K-Gluconate Sigma-Aldrich Co. G4500
HEPES Wako Pure Chemical Industries 346-01373
EGTA Wako Pure Chemical Industries 348-01311
Na2 ATP Nacalai Tesque 01072-24
Na3 GTP Sigma-Aldrich Co. G-8877
Na phosphocreatine Sigma-Aldrich Co. P-7936
CsMeSO3 Sigma-Aldrich Co. C1426
CsCl Wako Pure Chemical Industries 033-01953
Materials Company Catalog Number Comments
Drugs in aCSF
2-Chloroadenosine Sigma-Aldrich Co. C5134
Picrotoxin  Sigma-Aldrich Co. P-1675
Tetrodotoxin Wako Pure Chemical Industries 207-15901
CNQX  Sigma-Aldrich Co. C239
APV Sigma-Aldrich Co. A5282

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  3. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  4. Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).
  5. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  6. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
  7. Kida, H., et al. Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III. Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).
  8. Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).
  9. Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning. Science. 308 (5718), 83-88 (2005).
  10. Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).
  11. Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses. Nat Commun. 4, 2760 (2013).
  12. Kida, H., Mitsushima, D. Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex. Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).
  13. Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses. Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).
  14. Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine. Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).
  15. Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths. Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).
  16. Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat. J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).
  17. Tennant, K. A., et al. The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture. Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).
  18. Pinheiro, P. S., Mulle, C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).
  19. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).
  20. Hess, G., Donoghue, J. P. Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps. J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).
  21. Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Sys Tech J. 27, (1948).
  22. Ono, K. M., D, Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse. J Physiol Sci. 67, (2017).
  23. Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).

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Kida, H., Sakimoto, Y., Mitsushima, D. Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity. J. Vis. Exp. (129), e55876, doi:10.3791/55876 (2017).

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