Summary
Se describe un protocolo para la fabricación de dispositivos microfluídicos plástico con puertos de vista transparentes para la proyección de imagen de luz visible e infrarroja.
Abstract
Infrarrojo (IR) spectro-microscopia de muestras biológicas vivas es obstaculizada por la absorción de agua en la gama mediados de-IR y por la falta de dispositivos microfluídicos adecuado. Aquí, se demuestra un protocolo para la fabricación de dispositivos microfluídicos plástico, donde se utilizan técnicas de litografía blandas para incrustar transparente fluoruro de calcio (CaF2)-puertos de vista en relación con cámaras de observación. El método se basa en un enfoque de fundición réplica, donde un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) se produce mediante procedimientos litográficos y luego utilizado como plantilla para producir un dispositivo plástico. Cuenta con el dispositivo plástico ultravioleta/visible/infrarrojo (UV/Vis/IR) - transparentes ventanas de CaF2 para permitir la observación directa con visible y luz infrarroja. Las ventajas del método propuesto incluyen: una menor necesidad de acceder a una instalación de fabricación de micro limpio, múltiples puertos de vista, una conexión fácil y versátil con un sistema de bombeo externo a través del cuerpo plástico, flexibilidad del diseño, p. ej. , abierto/cerrado la configuración de canales y la posibilidad de añadir características sofisticadas tales como membranas nanoporosas.
Introduction
Spectro-microscopía Fourier transforma infrarrojo (FTIR) se ha utilizado ampliamente como una técnica de imagen no invasiva y libre de etiqueta para proporcionar toda la información química de una muestra. Esto permite la extracción de información bioquímica para el estudio de la química de las muestras biológicas, con un mínimo de preparación puesto que el espectro de absorción de la muestra lleva las huellas intrínsecas de su composición química1 , 2. recientemente, FTIR se ha aplicado cada vez más al estudio de muestras biológicas vivas, por ejemplo, las células3. Sin embargo, el agua, que es el medio para las células vivas en la mayoría de los casos, muestra una fuerte absorción en la región mediados de-IR. Incluso como una capa delgada, su presencia puede abrumar totalmente la importante información estructural de las muestras.
Durante muchos años, el enfoque común fue la fijación o secado muestras para excluir totalmente la señal de absorción de agua en el espectro. Sin embargo, este enfoque no permite mediciones de tiempo real en células vivas, que es esencial para estudiar el cambio de su composición química y de procesos celulares con el tiempo. Una forma de obtener espectros de absorción confiables de muestras biológicas vivo, es limitar la longitud de trayectoria óptica total en el medio de la viga de IR a menos de 10 μm4.
Un enfoque bien establecido en la vida de los experimentos de la célula ha sido hasta ahora, reflexión Total atenuada (ATR)-FTIR la proyección de imagen, que permite mediciones independientes del espesor de la muestra, permitiendo a las células a mantenerse en una capa más gruesa del medio acuoso. Sin embargo, la pequeña profundidad de penetración de la onda evanescente restringe medidas de muestras a sólo las primera pocas micras de la superficie del cristal ATR5.
Por otra parte, la limitación de la absorción de agua ha sido eludida con la aparición de distintos sistemas de microfluidos, que generalmente se clasifican en dos grandes grupos: abre el canal (donde una de las superficies líquidas se expone a la atmósfera) y cerrado canal (donde dos ventanas IR transparente están separadas por un espaciador con un espesor definido).
Loutherback et al desarrolló un dispositivo de membrana canal abierto que permite a largo plazo IR mediciones continuas de células vivas para hasta 7 días6. El método requiere alta humedad en el ambiente para evitar la evaporación del medio de la superficie de la célula. El sistema funciona mejor con las células que crecen naturalmente en interfases aire-líquido, tales como los tejidos epiteliales de la piel, pulmón y los ojos o biofilms microbianos7.
Una configuración de canal cerrado pretende crear una capa uniforme y delgada entre dos ventanas transparentes IR paralelo, donde las células se mantienen en su medio acuoso. El espesor de esta cavidad es tal que la señal de absorción de agua está por debajo de la saturación. Fondo de agua entonces puede restar para obtener los espectros de la muestra correcta. La mayoría de los métodos de canal cerrado utiliza un espaciador de plástico separa las dos ventanas para formar una cámara de líquidos desmontables3,8,9. Una ventaja de este método es que no requiere microfabricación; sin embargo, las estructuras que son más complejas que una cámara de medición con in y out realquilar canales son extremadamente difíciles de realizar en el separador fino. También hay un problema con la reproducibilidad de la longitud del camino entre las mediciones de IR debido a su dependencia de sujeción mecánica. Para lograr un control más preciso de la separación para una adquisición más confiable del espectro, se han implementado métodos de litografía óptica para fotoresistencia de patrón en la parte superior del sustrato de IR a definir el separador9,10 , 11 , 12. A pesar de esto permite estructuras más complejas en el espaciador, el método requiere acceso a una instalación de microfabricación para producir el patrón en cada sustrato.
En este artículo presentamos una técnica sencilla de fabricación de un dispositivo de microfluidos compatible con IR, con el objetivo de reducir el costo de fabricación y los requisitos de acceso a una instalación de microfabricación. El método presentado aquí (ver figura 1) utiliza un proceso establecido, conocido como litografía blanda. Dos moldes en este caso se requieren. El molde principal está hecho de una oblea de silicio de 4 pulgadas usando un proceso de litografía UV estándar. El molde secundario es su réplica de PDMS, que tiene una polaridad invertida del patrón en el molde de silicona primaria y sirve como el molde principal para la fabricación de dispositivos posteriores.
El dispositivo tiene dos capas separadas: una primera capa con la disposición de microfluidos (que en el actual caso consiste en el canal microfluídico, en-let/out-let y una cámara de observación con una vista de2 de CaF) y una segunda capa con una superficie plana ( que consiste en sólo una ventana de2 CaF).
Aquí se utiliza un pegamento óptico UV-curable, pegamento óptico Norland 73 (NOA73, abreviado como NOA en adelante), para formar el cuerpo plástico principal del dispositivo. Hay varias ventajas de utilizar este adhesivo óptico: fabricación bajo costo, facilidad de conectividad con sistemas externos, buena transparencia óptica, baja viscosidad y lo más importante, biocompatibilidad13. CaF2 es una opción conveniente como el punto de visión debido a su biocompatibilidad y excelente transparencia IR14.
Con este nuevo enfoque, el acceso a una instalación de microfabricación es estrictamente necesario para la fabricación del molde principal. Procesos de fabricación subsiguientes para el dispositivo de microfluidos plástico pueden realizarse en cualquier laboratorio equipado con una fuente de iluminación UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparación del molde principal del silicio
Nota: un photomask se requiere para la preparación del molde principal. El photomask puede ser adquirido de proveedores independientes o fabricado en la empresa a través de procedimientos de fabricación de la máscara óptica estándar. Un photomask con polaridad de campo claro se utiliza en este caso ( figura 2 a).
- Definición del patrón
- vuelta capa una oblea de silicio de 4 pulgadas con photoresist negativo SU-8 3010 a 2.300 rpm durante 30 s.
- Suave-cueza al horno la fotoresistencia en un plato caliente a 65 ° C por 2 min y luego a 95 ° C durante 8 min.
- Exponer la fotoprotección a la luz UV (i-line, 365 nm) a través de la fotomáscara bajo el alineador de la máscara para una dosis total de energía de 100-120 mJ/cm 2; el duro modo de contacto es el preferido para lograr una mejor solución.
- Retirar la oblea y aplicar un post exposición cuece al horno a 65 ° C por 1 min y luego a 95 ° C por 2 min.
- Desarrollar la fotoprotección con un desarrollador de SU-8 a temperatura ambiente, luego enjuague con alcohol isopropílico y secarlo suavemente con nitrógeno, el espesor del patrón medida debe ser 10 μm o menos. Ver figura 2 b para la foto del molde de silicio real.
- Silanización del molde del silicio
- tratar el molde de silicona con plasma de oxígeno 60 W durante 30 s con sccm 20 de flujo de oxígeno. Ajuste la presión de la cámara a 1-10 mbar durante el proceso de.
- Colocar el molde en un tarro vacío con 50 μl de silano y deja la jarra en el estado de vacío (1-10 mbar) para por lo menos 2 h.
Nota: El proceso de silanización crea una capa superficial hidrofóbica que impide que se pegue al molde 15 PDMS. Tenga en cuenta que el molde principal también se puede fabricar utilizando un método alternativo, que consiste en aguafuerte seca del silicio. En este caso, el photomask será de polaridad opuesta (campo oscuro), y la definición del patrón en el paso 1.1 utilizará un photoresist positivo.
2. Preparación de molde secundario PDMS
- mezcla de PDMS
- mezclar el elastómero PDMS y el agente endurecedor, 10:1; la cantidad total es tal que el espesor resultante de PDMS es aproximadamente de 1 a 1.5 mm.
- Después de la mezcla, desgasificar la mezcla dejándolo en un recipiente vacío en el estado de vacío (1-10 mbar) durante aproximadamente 15 minutos o hasta que hay no hay burbujas visibles; esto es para eliminar cualquier aire atrapado dentro de la mezcla de.
- Replicación molde
- Vierta la mezcla PDMS en el molde de silicona fabricado en el paso 1 y desgasificar la mezcla para eliminar cualquier aire atrapado con los mismos ajustes que en el paso 2.1.2. Calor a 70 ° C por 2 h en un plato caliente para curar la mezcla de.
- Retirar el PDMS curados de la placa caliente y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Con una cuchilla de afeitar, cortar el PDMS a lo largo de los bordes del molde silicona.
- Con un par de pinzas, pellizcar una de las esquinas del corte PDMS y pelar cuidadosamente la réplica PDMS del molde de silicona, el patrón resultante de microfluidos en este molde secundario es una protuberancia, que es la polaridad opuesta de la (molde primario figura 2 c).
- silanización de la réplica PDMS (igual como en el paso 1.2)
- tratar el molde PDMS con plasma de oxígeno 60 W durante 30 s con sccm 20 de flujo de oxígeno. Ajuste la presión de la cámara a 1-10 mbar durante el proceso de.
- Lugar el molde en el vacío del tarro con 50 μl de silano y deja la jarra en el estado de vacío (1-10 mbar) para por lo menos 2 h.
3. Preparación de plantillas de PDMS
Nota: estandarizar la forma y el tamaño de los dispositivos de finales y para facilitar la alineación de las principales características de las dos mitades, dos plantillas PDMS separadas fueron utilizadas, que definen la geometría del dispositivo, la colocación de la ventana transparente y las conexiones de realquilar en y hacia fuera. La fabricación de la mitad con dibujos del dispositivo, mientras que la segunda ayuda a facilitar la fabricación de la mitad plana del dispositivo de ayuda a la primera plantilla PDMS.
- Diseño de las plantillas utilizando un software de diseño asistido por ordenador. figura 3 una muestra la disposición y dimensiones de la plantilla utilizada para fabricar la mitad con el dispositivo. Para fabricar la mitad plana del dispositivo, retire los orificios de diámetro 1,5 mm diseño.
- Adquirir las plantillas de un proveedor externo o a través de un taller mecánico interno si está disponible.
Nota: El acrílico fue utilizado como la plantilla de material debido a la facilidad de fabricación y bajo costo alcanzable en cualquier taller estándar. Hay opciones alternativas, como la impresión 3D. - Mezclar el elastómero PDMS y agente de curado 10:1; Asegúrese de preparar una cantidad suficiente de PDMS para sumergir totalmente las plantillas de.
- Después de la mezcla, desgasificar la mezcla dejándolo en un recipiente vacío en el estado de vacío (1-10 mbar) durante aproximadamente 15 minutos o hasta que hay no hay burbujas visibles (cualquiera es más adelante); esto es para eliminar cualquier aire atrapado dentro de la mezcla de.
- Vierta la mezcla PDMS en las plantillas de acrílico hasta que su superficie superior esté sumergida aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie del líquido. Desgasificar el PDMS otra vez para eliminar cualquier aire atrapado con los mismos ajustes que en 3.4. Este calor a 60 ° C por 2 h sobre una placa caliente nivelada para curar la mezcla de.
- Retirar el PDMS curados de la placa caliente y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Con una cuchilla de afeitar, cortar el PDMS a lo largo de los bordes de las plantillas de acrílico.
- Con un par de pinzas, pellizcar una de las esquinas del corte PDMS y pelar con cuidado los PDMS de las plantillas de acrílico.
Nota: b de la figura 3 muestra la disposición y dimensiones de la réplica PDMS, utilizado para fabricar la mitad con el dispositivo de. - Preparar la segunda réplica PDMS para la fabricación del plano la mitad del dispositivo repitiendo los pasos 3.3 a 3.7 pero usando la plantilla de acrílico sin los agujeros de diámetro 1,5 mm.
4. Fabricación de dispositivo de microfluidos
- fabricación de la mitad con el dispositivo (es decir, con diseño de dispositivo)
- tratar la ventana 2 de CaF con plasma de oxígeno 60 W durante 30 s con sccm 20 de flujo de oxígeno. Esto se hace para mejorar el flujo de NOA durante la fabricación siguiente.
Nota: Este paso no es obligatorio.
Placa de - lugar cuidadosamente la primera PDMS plantilla (uno con los pilares de diámetro 1,5 mm) en una superficie plana, por ejemplo, una de cal sodada ( figura 4 a). Colocar una ventana de 2 CaF centrada sobre la clavija PDMS y presione suavemente la ventana que está en buen contacto con el tapón ( figura 4 b).
- Tomar el molde PDMS que se hizo en el paso 2 y coloque una delgada placa de UV-transparente (en este caso, una placa de cuarzo, 500 μm de espesor y 1,5 cm x 1,5 cm de tamaño) en la parte posterior del molde, alineado con la ubicación de la cámara central ( figura 4 c). Asegúrese que la placa de cuarzo está en buen contacto con el molde PDMS.
Nota: Thplaca de cuarzo e impide que el área no deseados del molde fácilmente entran en contacto con la CaF 2 ventana. - Suavemente Coloque este PDMS molde boca abajo hacia la ventana 2 de CaF con la cámara fluídica alineada con el centro de la ventana 2 de CaF. Asegúrese de que todos los elementos (plantilla, molde y ventana) estén en buen contacto y alineación ( figura 4 c-4 d).
- Poco a poco añada gotas de NOA en el let de la plantilla PDMS y deje que se llene lentamente la cavidad. Una vez que la resina entra en contacto con el borde de la ventana, el flujo capilar llenará la brecha fina (~ 10 μm) entre el molde PDMS y CaF 2 ventana ( figura 4 e-4f).
- Después de que la cavidad se llena totalmente, la curación del NOA por la exposición a la luz UV (por ejemplo, con un sistema de exposición de rayos UV-LED, figura 4 g).
Nota: El tiempo de exposición puede variar por consiguiente con la energía de la fuente de UV. El sistema de exposición UV-LED, que proporciona una densidad de potencia de 24 mW/cm 2, requiere alrededor de 90 s a 100% de potencia y modo de exposición continua. - Retire con cuidado la placa de cuarzo fino de la parte posterior del molde PDMS y luego pelar suavemente el molde PDMS de la parte superior de la capa NOA ( figura 4 h). Por último, retire la capa NOA de la plantilla PDMS ( figura 4 ).
Nota: La disposición resultante de dispositivo en el NOA curado tendría la misma polaridad del patrón en el molde de silicona primaria.
- tratar la ventana 2 de CaF con plasma de oxígeno 60 W durante 30 s con sccm 20 de flujo de oxígeno. Esto se hace para mejorar el flujo de NOA durante la fabricación siguiente.
- Fabricación de la mitad plana del dispositivo (es decir, sin diseño de dispositivo)
- tratar la ventana 2 de CaF con plasma de oxígeno 60 W durante 30 s con sccm 20 flujo de oxígeno de.
Nota: Este paso no es obligatorio. - Coloque cuidadosamente la segunda plantilla de PDMS (uno sin los pilares de diámetro 1,5 mm) sobre una superficie plana, por ejemplo, una placa de cal sodada. Colocar una ventana de 2 CaF centrada sobre la clavija PDMS y presione suavemente la ventana que está en buen contacto con el enchufe.
- Colocar una hoja gruesa de PDMS de 1 mm con tamaño de 5 cm x 3,5 cm en la parte superior la ventana 2 de CaF, con la hoja PDMS alineada con el centro de la plantilla PDMS. Asegúrese de que la hoja PDMS está en buen contacto con la ventana.
- Poco a poco añada gotas de NOA en el let de la plantilla PDMS y deje que se llene lentamente la cavidad.
- Después de que la cavidad se llena totalmente, la curación del NOA por la exposición a la luz UV (por ejemplo, con un sistema de exposición de rayos UV-LED).
Nota: El tiempo de exposición puede variar por consiguiente con la fuente de energía UV. Con el sistema de exposición de rayos UV-LED, que proporciona una densidad de potencia de 24 mW/cm 2, esto requiere alrededor de 50 s en el 100% de potencia y modo de exposición continua. - Cáscara de la hoja desde la parte superior de la capa NOA de PDMS y retire cuidadosamente la capa curada de NOA de la plantilla PDMS.
- tratar la ventana 2 de CaF con plasma de oxígeno 60 W durante 30 s con sccm 20 flujo de oxígeno de.
- De la vinculación de las dos mitades del aparato
- alinear las dos mitades del dispositivo tal que ambas ventanas 2 de CaF están alineados. Suavemente dedo Presione ambas mitades en la esquina de las capas NOA que se fija la posición de las dos mitades.
- Dos discos circulares de una hoja PDMS espesor 1 mm, utilizando un punzón de diámetro 8 mm ( figura 5 a).
- Cortar dos rectángulos con el mismo tamaño del dispositivo (4 cm x 2,5 cm) de una hoja gruesa de PDMS de 1 mm. En ambos rectángulos PDMS, corte las aberturas correspondientes a los canales y el en-let/out-realquilar del dispositivo de.
Nota: Los orificios precortados en los rectángulos PDMS se pretenden impedir que los canales que se derrumban durante el prensado. - Pila en el siguiente orden desde abajo: un rectángulo PDMS con pre-corte aberturas, un disco PDMS (en contacto con la ventana inferior, corte de paso 4.3.2), las dos mitades pulsado por el dedo del dispositivo, el segundo disco PDMS (sentado en la ventana superior) y por último el segundo rectángulo PDMS con pre-corte aberturas ( figura 5 b).
- Lugar esta Asamblea en la configuración de la prensa al vacío de tal manera que se intercala entre 2 placas y selle la bolsa plástica ( figura 5 c). Encienda la bomba de vacío y evacuar el conjunto. Deje que la bomba de vacío alcanzar su presión base o aplicar el vacío durante al menos 10 min
Nota: La presión base alcanzada depende de la bomba de vacío usada y la calidad del lacre de la bolsa de plástico. - Exponer la Asamblea evacuada a los rayos UV con una lámpara de gas Hg de banda ancha en el 270 W durante 15 minutos a su vez la bomba de vacío y dejar que la Asamblea ventear lentamente a la presión atmosférica antes de retirar el dispositivo final de la Asamblea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 6 presenta los espectros de transmitancia de una nueva ventana de CaF2 , la mitad con el dispositivo y el dispositivo completo. Todos los tres espectros exhiben excelente transparencia para IR medio con más de 80% de transmitancia. El patrón de interferencia visible en el espectro del dispositivo completo (curva amarilla en la figura) es causado por el boquete de aire en el rango de 9-10 μm entre dos ventanas. Estos espectros demuestran que el método de fabricación presentado aquí no altera la transparencia del CaF2 en el rango medio de IR.
Figura 7 una muestra un ejemplo de buena replicación en NOA del molde secundario PDMS con el trazado de microfluidos. La estructura en la parte superior la ventana2 de CaF está formada bien por el pelado limpio de la capa NOA desde el molde PDMS después es parcialmente curado UV. No NOA debe permanecer en el molde o en la superficie de ventana en contacto con las protuberancias del molde. Cualquier NOA pegado al molde se traduce en falta de estructura NOA en la ventana, que causaría pérdidas durante los experimentos de flujo del dispositivo final. Además, para lograr el buen sellado de las dos mitades, NOA debe estar pegajoso después de la exposición UV de las capas medias. NOA es demasiado curado si es no-pegajoso. La dosis de exposición debe ser optimizada para lograr tal resultado.
Figura 7 b en cambio, muestra replicación sin éxito en NOA, donde el patrón en la ventana2 de CaF no se define correctamente. En su mayoría es causada por insuficiente dosis de UV la exposición, es decir, curado de NOA. En tales casos, NOA es aún algo húmeda, causando algunos de adherirse a los moldes PDMS. Sin embargo, si NOA todavía pega a PDMS molde a pesar de que ha recibido la dosis de exposición correcta, esto puede ser un síntoma de silano capa (es decir, capa antiadherente) ser degradado con el tiempo. Como PDMS es un molde suave, no es tan duradero como el molde principal del silicio. Debe ser reemplazado después de un número de usos.
Figura 1: Proceso de la fabricación de los dispositivos microfluídicos plástico: (a-e) Esquema del proceso de fabricación. (f) imagen de un dispositivo real y esquema de su sección transversal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen del photomask, molde primario del silicio y molde secundario PDMS replicado desde el molde del silicio: (un) Photomask con polaridad de campo brillante (arriba izquierda); Trazado del patrón de la fotomáscara (derecha) que consta de: en-let y enchufe con 2 mm de diámetro (1 y 2) y la distancia de 3 cm entre ellas, canales con 300 μm de anchura (3), dos de referencia cámaras con 5,5 mm x 0.75 mm de tamaño (4), cámara central con 5 x 2,5 mm tamaño ( 5), rejillas de difracción como una guía visual con amplia de líneas 10 μm y 20 μm brecha (6); Zoom-en realización de la cámara central que muestra la rejilla de difracción (abajo izquierda). (b) imagen del primario del molde del silicio con el modelo definido en el photoresist SU-8. (c) imagen del molde secundario PDMS con revés polaridad con respecto al molde primario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las herramientas de plantillas prepararon para facilitar la fabricación del dispositivo: (un) acrílico plantilla: plantilla real (arriba) y su vista esquemática transversal (abajo). (b) PDMS réplica de la plantilla de acrílico: réplicas reales (arriba) y su vista esquemática transversal (abajo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Proceso de flujo para la fabricación de la mitad con dibujos del dispositivo: (un) lugar el PDMS plantilla sobre una superficie plana. Aquí, utilizamos el vidrio de cal sodada. (b) CaF2 se coloca centrado en la parte superior del enchufe PDMS. (c-d) Molde PDMS se pone cara abajo hacia el CaF2 con la cámara fluídica alineada con el centro de la ventana. Asegúrese de que todos los elementos estén en buen contacto y alineación. (e-f) Fundición de NOA través de en-let y permitiendo que poco a poco llenar la cavidad. (g) NOA es curada por exponerlo bajo luz ultravioleta. Dosis de exposición pueden variar dependiendo de la energía de la fuente de UV. (h) Pelar cuidadosamente el molde PDMS y plantilla para liberar el NOA curado. () terminado capa del dispositivo con estructuras de microfluidos en el NOA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Configuración de prensa de vacío para presionar las dos mitades del aparato para formar un dispositivo completo: (un) PDMS disco circular (8 mm de diámetro) y PDMS rectángulo (4 x 2.5 cm) con orificios precortados. Ambos se cortan de una hoja gruesa de PDMS de 1 mm. (b) Resumen de la pila de capa antes del prensado. (c) Resumen de la prensa de vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Mediados de-IR t weight.High espectros de un CaF desnuda 2 ventana (rojo), un patrón medio del dispositivo (azul) y un dispositivo completo (amarillo). Todos los tres espectros exhiben excelente transparencia para IR mediado con transmitancia mayor de 80 años% Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Con dibujos la mitad del dispositivo: (a) ejemplo de una estructura de microfluidos bien formados en el NOA. Zona más oscura en la ventana muestra una estructura bien definida, mostrando claramente la cámara central, dos cámaras de referencia y los canales. (b) ejemplo de una estructura mal formados microfluídicos en NOA debido a undercuring. Hay reflujo del NOA según lo indicado por flechas rojas. Una de las cámaras de referencia también falta (flecha verde). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Plantilla de microfluidos conexión a circuito neumático externo fabricado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Molde colocación de PDMS durante la fabricación de la mitad con dibujos del dispositivo: (a) ejemplo de la buena colocación del molde PDMS en la ventana2 de CaF. La ventana está en contacto con solamente la protuberancia en el molde de PDMS, mostrando claramente los canales (indicados por la zona más oscura), la cámara central y dos cámaras de referencia. Las rejillas de difracción alrededor del aparato y en el centro de la cámara central se significan para una guía visual durante la colocación del molde PDMS. (b) ejemplo de una mala colocación del molde PDMS en la ventana2 de CaF. La zona más oscura demuestra que también es un área no deseados del molde, que está en contacto con la ventana, como se indica por las flechas rojas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Con el fin de evaluar y optimizar el protocolo de fabricación, utilizamos un diseño sencillo para el patrón de microfluidos con una cámara rectangular grande (tamaño 5 x 2,5 mm) en el centro, dos pequeñas cámaras rectangulares (tamaño 5,5 x 0,75 mm) separado del circuito principal en el lados superior e inferior y 300 μm ancho en-let/out-realquilar canales. La cámara central se utiliza para la siembra y observación de las células, mientras que las dos cámaras más pequeñas separadas se utilizan para medir el fondo de aire en FTIR se experimenta como una cámara de referencia, como comentamos en una anterior publicación13. En alquiler y enchufe Conecte la cámara central para el sistema fluídico.
Aquí, se introducen herramientas de plantillas (ver protocolo paso 3) para facilitar el proceso de fabricación. Anteriormente, era difícil de colocar constantemente el CaF2 windows exactamente en el centro del dispositivo final, que causó problemas al alinear las dos mitades del aparato. El uso de la plantilla proporciona a una guía visual para la colocación de la ventana y asegura que la situación siempre es similar. Como los requisitos geométricos para estas plantillas no son muy rigurosos, pueden utilizarse tecnologías de producción estándar y barato. En este caso, hicimos de acrílico plástico a través de un taller de mecanizado, pero una alternativa igualmente viable y barata es la impresión en 3D.
El diseño de las plantillas de acrílico es que cuentan con los siguientes (figura 3a): (a) una plantilla está diseñada con dos pequeños agujeros a cada lado, mientras que el segundo es sin agujeros; los agujeros son 1,5 mm de diámetro en tamaño y 1,5 mm de profundidad, (b) tanto las plantillas tienen un agujero circular de 8 mm de diámetro y 500 de μm de profundidad en el centro, y (c) ambas plantillas tienen una saliente rectangular para definir el tamaño, forma y espesor del dispositivo media; el rectángulo es 4 cm x 2,5 cm de largo/ancho y 1,5 mm de espesor.
Las plantillas resultantes de PDMS replicadas desde las plantillas de acrílico tendrá la polaridad opuesta (figura 3b): (a) una plantilla tendrá dos pilares a cada lado con 1,5 mm de diámetro y 1,5 mm de altura que la dejó en la forma y hacia fuera-dejó de la la mitad del dispositivo modelado después NOA; la segunda plantilla sin pilares, (b) ambas plantillas tienen un pilar alto 500 μm en el centro para facilitar la colocación de las ventanas2 de CaF; Esta característica se denomina "PDMS plug", y (c) ambas plantillas son con una cavidad, que define la forma y el tamaño de cada mitad del dispositivo: un rectángulo de la forma con 4 cm x 2,5 cm tamaño y 1,5 mm de espesor en este caso.
Para facilitar aún más el proceso de fabricación, rejillas de difracción se incorporaron en el diseño de la fotomáscara para el molde de silicona primaria. En la réplica PDMS de este molde de silicona, las protuberancias poco profundas (que son menos de 10 μm de altura) son difíciles de ver debido a la transparencia óptica de PDMS. Sin embargo, protuberancias poco profundas si dispuestas en una rejilla de 10 μm de ancho líneas con 20 μm brecha generan un patrón de interferencia visible16. Este patrón de interferencia fue explotado como una guía visual para definir la posición de trazado de microfluidos en el molde PDMS. El diseño del molde incorpora un marco hecho de la reja para definir la geometría general del dispositivo. Otra reja más añadida en medio de la cámara central de la distribución de microfluidos para facilitar el alineamiento con la CaF2 ventana. Cabe destacar que la rejilla de la cámara central no se reproducirá en el dispositivo final que consiste en una serie de cavidades cortas que no están conectadas al borde de la cámara central. Por lo tanto, la NOA que fluye no podrían acceder a estas cavidades.
Para la inyección de células y medio cambio, cada dispositivo necesita su en-let y enchufe perforado manualmente antes del sellado. Esto dio lugar en posicionamiento no reproducibles de los agujeros. Esto no limitó el funcionamiento de cada dispositivo puesto que la conexión se logró pegar un pin metálico pequeño en una de las aperturas y adjuntando un depósito plástico en el otro extremo como un colector de residuos. Por lo tanto, diferentes posiciones de los orificios no es de preocupación excepto a costa de un esquema más complejo de fabricación. Para simplificar y estandarizar el uso de prueba y final de cada dispositivo, un jig fluídico por encargo con lugares fijos a en-let/out realquilar es introducida (véase figura 8), quitando la necesidad de fijar el perno y el depósito. Por lo tanto, en-let/out realquilar agujeros con posiciones incompatibles presentaría un problema aquí. Mediante la incorporación de dos agujeros de diámetro de 1,5 mm en la plantilla de acrílico fabricado (paso 3 del Protocolo), que se convertirán en pilares en el molde PDMS, se elimina la necesidad de manualmente perforar agujeros en los extremos de los canales de microfluidos. Por otra parte, su posición es fija e igual para todos los dispositivos.
La ausencia de fugas en el dispositivo puede controlarse con el mismo procedimiento como se explica en otra parte13 es decir, alimentar el aparato con una solución de fluoresceína en agua desionizada.
Pasos críticos en el protocolo
Durante la fabricación de la mitad con el dispositivo, colocación del molde PDMS en la parte superior la ventana2 de CaF debe ser cuidadosamente realizada. Las estructuras sólo en el molde que se permitieron entrar en contacto con la ventana son los salientes altos de 10 μm. Cada vez que hay un área de contacto no deseado, debe rehacer el paso de colocación de molde. Para ilustrar, figura 9una muestra cuidadosa colocación del molde en la ventana, mientras que elb de la figura 9muestra un ejemplo de mala colocación, en un área no deseados del molde está en contacto con la ventana. Figura 9 b daría lugar a una estructura que falta del NOA en la ventana. La placa de cuarzo pequeño mencionada en el protocolo (paso 4.1.3, figura 2c) ayuda a la colocación del molde ya que evita que la zona no deseada del molde fácilmente entran en contacto con la ventana2 de CaF. La placa del cuarzo y el molde PDMS también son delgadas para que queden lo suficientemente ligero y transparente a UV17,18.
Encontrar la dosis correcta de exposición UV para las capas medias también es crucial para el proceso de fabricación. Cuando NOA se expone con una dosis insuficiente, NOA se reajustan durante la peladura apagado, causando una pérdida de definición de la estructura y posiblemente desbordante sobre la superficie2 de CaF. Por otra parte, demasiado de una resultados de dosis de exposición en exceso de curado de la NOA, NOA de torneado en un estado no-pegajoso. Posterior vinculación de las dos mitades sufriría porque NOA no pegajoso en la capa media con motivos no adherirse a la ventana2 de CaF en la capa media plana. Idealmente, la dosis correcta debe ser la exposición más cortadosis que permite NOA replicar la estructura fiable mientras que todavía mantiene su estado pegajoso. Además de determinar la dosis de exposición correcta, la vinculación de las dos mitades debe hacerse tan pronto como sea posible, dentro de 30 minutos, como la viscosidad de NOA disminuye gradualmente con el tiempo hasta que ya no es posible para la vinculación.
Otros puntos a destacar son al utilizar el sistema de prensa de vacío para la vinculación. Las capas de cumplimiento (es decir, láminas delgadas de PDMS colocando el dispositivo) deben tener espesor relativamente uniforme para una distribución uniforme de la presión en el dispositivo. Para ello, una plantilla de acrílico por encargo con un espesor de espaciador definida fue utilizada para emitir tales hojas PDMS. Las hojas de cumplimiento deberían ser limpias para evitar la introducción de presión local, especialmente en la frágil ventana2 de CaF.
Ventajas del método en comparación con los métodos existentes
Nuestro enfoque de fabricación demostró la producción de un dispositivo plástico compatible con medidas de FTIR. Debido a la técnica de microfabricación proporciona buen control sobre la dimensión de la función, el control posible sobre la altura de los canales de microfluidos es mucho más preciso que lo que se puede obtener con otros métodos de fabricación (por ejemplo, espaciadores de plástico).
Una ventaja fundamental de este protocolo es que resulta en un dispositivo plástico con UV-Vis-IR-puertos de transparente; todos los dispositivos microfluídicos previamente demostrada para FTIR se produjeron sobre un sustrato transparente IR grandes, que requieren pasos de litografía para cada dispositivo10,11,12. En el enfoque actual, el costo y la complejidad de la fabricación se reduce debido a que sólo la producción del molde Si requiere litografía.
Por último, utilizar un UV curable de la resina (NOA73 en esta demostración) como el principal cuerpo plástico facilita la Conectividad del dispositivo a un sistema externo de suministro líquido, pegar o colocar las conexiones en el cuerpo de plástico o mediante el uso de un jig fluídico para más rápido dispositivo de producción o uso.
Futuras aplicaciones del método
De las posibles mejoras y el desarrollo que puede explorarse, dos son los más inmediatos e importantes. En primer lugar, la transparencia óptica banda ancha del puerto de vista sugiere el acoplamiento de FTIR con microscopía de fluorescencia de alta resolución en la misma plataforma. Esto puede ser fácilmente perseguido reduciendo el espesor de una de las ventanas2 de CaF con el fin de cumplir con los requisitos de una distancia de trabajo con objetivos de alta magnificación y alta apertura numérica. En segundo lugar, este esquema de fabricación puede permitir diseños hidráulicos más complejos. Múltiples cámaras de observación y elementos funcionales conexión tales como mezcladores y separadores, pueden implementarse como su geometría define las cavidades abiertas por debajo de las ventanas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradece el apoyo financiero de MBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
