Summary
En protokoll for fabrikasjon av plast microfluidic enheter med gjennomsiktig visning-synlige og infrarøde lyset imaging er beskrevet.
Abstract
Infrarød (IR) spectro-mikroskopi av levende biologiske prøver er hindret av absorpsjon av vann i midt-IR området og mangel på egnet microfluidic enheter. Her, en protokoll for fabrikasjon av plast microfluidic enheter er bevist, hvor myke litografisk teknikker brukes til å bygge gjennomsiktig kalsiumfluorid (CaF2) visning-porter i forbindelse med observasjon chamber(s). Metoden er basert på en kopi avstøpning tilnærming, der en polydimethylsiloxane (PDMS) mold er produsert gjennom standard litografisk prosedyrer og deretter brukt som malen til å produsere en plast enhet. Plast enheten har ultrafiolett/synlig/infrarød (UV/Vis/IR) - gjennomsiktige vinduer gjort CaF2 å tillate direkte observasjon med synlig og IR lys. Fordelene med den foreslåtte metoden inkluderer: redusert behov for tilgang til et rent mikro-fabrikasjon anlegg, flere visning-porter, en enkel og allsidig tilkobling til et eksternt pumping system gjennom plast kroppen, fleksibilitet av design, f.eks , åpen/lukket kanaler konfigurasjon og muligheten til å legge til avanserte funksjoner som nanoporous membraner.
Introduction
Fourier transformere infrarød Spectro-mikroskopi (FTIR) har blitt mye utnyttet som en etikett-fri og ikke-invasiv tenkelig teknikk å gi detaljerte kjemiske informasjon av et utvalg. Dette gjør det mulig utvinning av biokjemiske informasjon å studere kjemi av biologiske prøver, med et minimum av forberedelse siden absorpsjon spekteret av prøven bærer iboende fingeravtrykk av dens kjemiske sammensetning1 , 2. nylig FTIR har blitt stadig mer brukt til studiet av live biologiske prøver, f.eks, celler3. Vann, som er medium for levende celler i de fleste tilfeller, viser imidlertid en sterk absorbansen i regionen midt-IR. Som et tynt lag, kan sin tilstedeværelse helt overvelde viktig strukturelle informasjon av de.
I mange år, var den felles tilnærmingen fikse eller tørking prøver å helt ekskludere vann absorpsjon signalet i spekteret. Men tillater denne tilnærmingen ikke sanntid målene på levende celler, noe som er viktig å studere endring av deres kjemiske sammensetning og cellulære prosesser med tiden. En måte å få pålitelig absorpsjon spectra fra live biologiske prøver, er å begrense hvor totale optiske banen i medium IR strålen til mindre enn 10 µm4.
En veletablert tilnærming i levende celle eksperimenter har vært så langt, dempes totale refleksjon (ATR)-FTIR imaging, som gjør mål uavhengig av eksempel tykkelsen, slik at cellene skal opprettholdes i et tykkere lag av vandig medium. Imidlertid begrenser liten dybden for inntrengning av flyktige bølgen målinger av prøver til bare de første par mikron fra overflaten av ATR krystall5.
Eventuelt vann absorpsjon begrensning har blitt omgått med fremveksten av ulike microfluidic systemer, som er vanligvis delt inn i to store grupper: åpne kanal (der en av væske overflater er utsatt til atmosfæren) og lukket kanal (der to IR-gjennomsiktige vinduer er atskilt med et mellomrom med en definert tykkelse).
Loutherback et al. utviklet en åpen kanal membran enhet som gjør at lang sikt kontinuerlig IR målinger av levende celler for opptil 7 dager6. Metoden krever høy luftfuktighet i miljøet å hindre fordampning av mediet celleoverflaten. Systemet fungerer best med celler som naturlig vokser i luft-flytende grensesnitt, for eksempel epithelial vev av huden, lungene, og øynene eller mikrobiell biofilm7.
En lukket-channel konfigurasjon mål å lage et ensartet, tynne lag mellom to parallelle IR-gjennomsiktige vinduer, der celler vedlikeholdes i deres vandige media. Tykkelsen på denne hulrom er slik at vann absorpsjon signalet er under metning. Vann bakgrunn kan deretter trekkes for å få til riktig utvalg spectra. De fleste lukket kanal metodene bruker en plast spacer skille de to vinduene for å danne en demonterbare flytende kammer3,8,9. En fordel med denne metoden er at det ikke krever microfabrication; men er strukturer som er mer komplisert enn en måling kammer med in - og post-ut - let kanaler ekstremt vanskelig å realisere i tynne mellomlegget. Det er også et problem med reproduserbarhet på banen lengde mellom IR målinger på grunn av sin avhengighet av mekanisk clamping. For å oppnå en mer nøyaktig kontroll over avstanden for et mer pålitelig spektrum oppkjøp, er optisk litografi metoder gjennomført til mønster photoresist på IR underlaget å definere spacer9,10 , 11 , 12. selv om dette gjør det mulig for mer komplekse strukturer defineres i mellomlegget, metoden krever tilgang til en microfabrication å produsere mønster på hver substrat.
I dette papiret presenterer vi en enkel fabrikasjon teknikk en IR-kompatibel microfluidic enhet, med sikte på å redusere fabrikasjon koste og kravet om tilgang til et microfabrication anlegg. Metoden som presenteres her (se figur 1) bruker en fastsatt prossess kjent som myk litografi. To formene er nødvendig i dette tilfellet. Primære mold er laget av en 4-tommers silisium wafer bruker en standard UV litografi. Sekundær mold er sin kopi av PDMS, som har en motsatt polaritet av mønsteret i silisium primære mold og fungerer som master mold påfølgende enhet fabrikasjon.
Enheten har to separate lag: det første laget med microfluidic oppsett (som i presentert tilfelle består av mikrovæskekanalen, i-la/ut-la og en observasjon kammer med en CaF2 viewport), og et ekstra lag med et flatt underlag ( som består av bare en CaF2 viewport).
Her brukes en UV-helbredelig optisk selvklebende, Norland optisk lim 73 (NOA73, forkortet til NOA heretter), til plast hoveddelen av enheten. Det er flere fordeler med å bruke denne optiske lim: lav fabrikasjon kostnader, enkel tilkobling til eksterne systemer, god optisk åpenhet, lav viskositet og viktigst, biocompatibility13. CaF2 er et passende valg som viewport pga biocompatibility og utmerket IR-åpenhet14.
Med denne nye tilnærmingen er tilgang til en microfabrication strengt nødvendig for fabrikasjon av primære mold. Etterfølgende metallbearbeiding prosesser for plast microfluidic enheten kan utføres i et laboratorium utstyrt med en UV-belysning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Silicon primære formen
Merk: en photomask kreves for utarbeidelse av primære mold. Photomask kan være kjøpt fra uavhengige leverandører eller fremstille internt gjennom standard optisk maske fabrikasjon prosedyrer. En photomask med lyse feltet polaritet brukes i dette tilfellet ( figur 2 en).
- Mønster definisjon
- Spin coat en 4 tommers silisium wafer med SU-8 3010 negative photoresist på 2300 rpm for 30 s.
- Soft-bake photoresist på en varm plate på 65 ° C i 2 minutter og deretter på 95 ° C i 8 min.
- Viser photoresist for UV-lys (i-line, 365 nm) gjennom photomask under maske aligner for en total energi dose 100-120 mJ/cm 2; den harde kontakte modusen er foretrukket å oppnå en bedre oppløsning.
- Fjerne kjeks og bruke en post eksponering bake på 65 ° C i 1 min og deretter på 95 ° C i 2 min.
- Utvikle photoresist bruker SU-8 utvikler i romtemperatur, og deretter skyll med isopropyl alkohol og forsiktig blåse tørt med nitrogen, målt mønster tykkelsen bør være 10 µm og nedenfor. Se figur 2 b for bildet av den faktiske silicon formen.
- Silanization av silicon formen
- Behandle silicon formen med oksygen plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm av oksygen. Satt kammer trykk til 1-10 mbar under prosessen.
- Sett mugg i et vakuum krukke med 50 µL av silane og la glasset i vakuum staten (1-10 mbar) for minst 2 h.
Merk: Silanization prosessen oppretter en hydrofobe overflate belegg som hindrer PDMS fra stikker til mold 15. Merk at den primære mold kan også være fabrikasjon benytter en alternativ metoden, som innebærer tørr etsing av silisium. I dette tilfellet photomask blir motsatt polaritet (mørke felt) og mønster definisjonen i trinn 1.1 bruker en positiv photoresist.
2. Utarbeidelse av PDMS sekundær Mold
- PDMS blande
- bland PDMS elastomer og herding agent, 10:1; totalbeløpet er slik at den resulterende PDMS tykkelsen er ca 1 til 1,5 mm.
- Etter grundig blanding, degas blandingen ved å la det i et vakuum krukke i vakuum staten (1-10 mbar) i ca 15 min eller til det er ingen synlige bobler, dette er å fjerne alle fanget i blandingen.
- Mold replikering
- hell PDMS blandingen på silisium mold fabrikkert i trinn 1 og degas blandingen til å fjerne eventuelle innestengte luften med de samme innstillingene som i trinn 2.1.2. Varme på 70 ° C i 2 timer på en varm plate å kurere blandingen.
- Fjerne herdet PDMS fra kokeplate og la den avkjøles til romtemperatur. Med et barberblad kuttet PDMS langs kantene på silisium mold.
- Med et par pinsett, knip ett hjørne av kuttet PDMS og nøye skrelle PDMS kopi av silisium mold, resulterende microfluidic mønster på denne andre formen er en protrusion, som er den primære mold (motsatt polaritet figur 2 c).
- Silanization i PDMS replikasettet (samme som i trinn 1.2)
- Behandle PDMS mold med oksygen plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm av oksygen. Satt kammer trykk til 1-10 mbar under prosessen.
- Mold i et vakuum glasskrukke med 50 µL av silane og la glasset i vakuum staten (1-10 mbar) i minst 2 h.
3. Utarbeidelse av PDMS maler
Merk: standardisere den formen og størrelsen på de endelige enhetene og lette justeringen av hovedtrekkene i de to halvdelene, to separate PDMS maler ble brukt, som definerer geometrien av enheten, plasseringen av vinduet gjennomsiktig og i - og post-ut - let tilkoblinger. Malen for første PDMS hjelpemidler fabrikasjon av mønstret halvparten av enheten, mens andre hjelper å lette fabrikasjon av den flate delen av enheten.
- Design maler bruker en dataassistert konstruksjon (CAD) programvare. Figur 3 en viser sette opp og dimensjonene på malen som brukes til å fabrikkere mønstret halvparten av enheten. For å utvikle den flate delen av enheten, fjerne 1,5 mm diameter hull fra design.
- Kjøpe maler fra en ekstern leverandør eller en intern mekanisk verksted hvis tilgjengelig.
Merk: Akryl ble brukt som malen materiale på grunn av brukervennlighet fabrikasjon og lave kostnader oppnåelig i alle standard workshop. Det finnes alternative alternativer, for eksempel 3D utskrift. - Bland PDMS elastomer og herding agent 10:1, husk å forberede en tilstrekkelig mengde PDMS til helt dykke malene.
- Etter grundig blanding, degas blandingen ved å la det i et vakuum krukke i vakuum staten (1-10 mbar) i ca 15 min eller til det er ingen synlige bobler (som er senere), og dette er å fjerne alle fanget i blandingen.
- Hell PDMS blandingen på akryl malene til deres øverste overflate er neddykket ca 1 mm under flytende overflaten. Degas PDMS du vil fjerne alle innestengte luften med de samme innstillingene som 3.4. Varme dette ved 60 ° C i 2 timer på en flatet kokeplate å kurere blandingen.
- Fjerne herdet PDMS fra kokeplate og la den avkjøles til romtemperatur. Med et barberblad kuttet PDMS langs kantene på akryl malene.
- Med et par pinsett, knip ett hjørne av kuttet PDMS og nøye skrelle PDMS av akryl malene.
Merk: Figur 3 b viser sette opp og dimensjoner i PDMS replikasettet brukes å dikte mønstret halvparten av enheten. - Forberede andre PDMS replikaen fabrikere flat halvparten av enheten ved å gjenta trinn 3.3 til 3,7 men ved hjelp av malen akryl uten 1,5 mm diameter hull.
4. Microfluidic apparat fabrikasjon
- fabrikasjon av mønstret halvdel av enheten (dvs. med enheten layout)
- behandler CaF 2 vinduet med oksygen plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm av oksygen. Dette gjøres for å forbedre flyten av NOA under følgende fabrikasjon.
Merk: Dette trinnet er ikke obligatorisk. - Sted nøye første PDMS malen (ett med 1,5 mm diameter søyler) på et flatt underlag, f.eks, en brus kalk plate ( Figur 4 en). Plasser en CaF 2 window sentrert på PDMS pluggen og trykk forsiktig vinduet slik at det er god kontakt med pluggen ( Figur 4 b).
- Ta PDMS mold laget i trinn 2, og Plasser en tynn UV-gjennomsiktige plate (i dette tilfellet, kvarts plate, 500 µm tykk og 1,5 cm x 1,5 cm i størrelse) på baksiden av mold, justert med plasseringen av sentrale kammeret ( Figur 4 c). Kontroller at kvarts platen er god kontakt med PDMS mold.
Merk: The kvarts plate hindrer uønskede området av mold lett komme i kontakt med vinduet CaF 2. - Forsiktig plassere denne PDMS mold forsiden ned mot vinduet CaF 2 med fluidic kammeret midtjustert i vinduet CaF 2. Kontroller at alle elementene (mal, mold og vinduet) i god kontakt og linje ( Figur 4 c-4 d).
- Gradvis dispensere dråper NOA på i-La av malen PDMS og la den sakte fylle hulrom. Når harpiks kommer i kontakt med kanten av vinduet, kapillære flyten vil fylle tynn gapet (~ 10 µm) mellom PDMS mold og CaF 2-vinduet ( Figur 4 e-4f).
- Etter at hulrommet er fylt, kurere NOA ved eksponering for UV-lys (f.eks med en UV-LED eksponering system, Figur 4 g).
Merk: Eksponeringstid kan variere tilsvarende med energi av UV-kilde. UV-LED eksponering systemet, som gir en tetthet av 24 mW/cm 2, krever rundt 90 s 100% strøm og kontinuerlig eksponeringsmodus. - Fjern forsiktig tynne kvarts platen fra baksiden av PDMS mold og deretter Skrell forsiktig PDMS mold fra toppen av NOA laget ( Figur 4 h). Til slutt fjerner NOA laget fra malen PDMS ( Figur 4 jeg).
Merk: Resulterende enheten oppsettet kurert NOA ville ha samme polariteten til mønsteret i primære silisium mold.
- behandler CaF 2 vinduet med oksygen plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm av oksygen. Dette gjøres for å forbedre flyten av NOA under følgende fabrikasjon.
- Fabrikasjon av den flate delen av enheten (dvs. uten enhet oppsett)
- Behandle CaF 2 vinduet med oksygen plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm av oksygen.
Merk: Dette trinnet er ikke obligatorisk. - Legg nøye andre PDMS malen (en uten 1,5 mm diameter søyler) på et flatt underlag, f.eks, en brus lime plate. Plasser en CaF 2 window sentrert på PDMS pluggen og trykk forsiktig vinduet slik at det er god kontakt med pluggen.
- Sted et 1 mm tykt PDMS ark med 5 cm x 3,5 cm størrelse på vinduet CaF 2 med det PDMS arket justert med midten av malen PDMS. Kontroller at PDMS arket er god kontakt med vinduet.
- Gradvis dispensere dråper NOA på i-La av malen PDMS og la den sakte fylle hulrom.
- Etter at hulrommet er fylt, kurere NOA ved eksponering for UV-lys (f.eks med en UV-LED eksponering).
Merk: Eksponeringstid kan variere tilsvarende med UV energikilden. Med UV-LED eksponering system, som gir en tetthet av 24 mW/cm 2, dette krever rundt 50 s 100% strøm og kontinuerlig eksponeringsmodus. - Skallet av PDMS arket fra toppen av NOA laget og forsiktig fjerne herdet NOA laget fra malen PDMS.
- Behandle CaF 2 vinduet med oksygen plasma på 60 W for 30 s med 20 sccm av oksygen.
- Bonding av de to halvdelene av enheten
- justere de to halvdelene av enheten slik at både CaF 2 windows er justert. Forsiktig finger trykk halvdel på hjørnet av NOA lagene slik at plasseringen av de to halvdelene er faste.
- Cut to sirkulære plater av et 1 mm tykt PDMS ark med en 8 mm diameter puncher ( figur 5 en).
- Cut to rektangler med samme størrelse på enheten (4 cm x 2,5 cm) fra et 1 mm tykt PDMS ark. På begge PDMS rektangler, kutt åpninger tilsvarer kanalene og i-La/post-ut-let enheten.
Merk: Pre-cut åpningene i PDMS rektanglene er ment å hindre kanalene kollapset under presserende. - Stabel i følgende rekkefølge fra bunnen: ett PDMS rektangel med pre-cut åpninger, en PDMS plate (kontakt med bunnen vindu, kuttet i trinn 4.3.2), de to finger trykket halvdelene av enheten, andre PDMS platen (sitter på det øverste vinduet), og til slutt andre PDMS rektanglet med pre-cut åpninger ( figur 5 b).
- Sett denne samlingen i vakuum trykk oppsettet slik at det er klemt mellom 2 plater og forsegle plastposen ( figur 5 c). Aktivere vakuumpumpe og evakuere forsamlingen. La vakuumpumpe nå base trykket eller bruke vakuum i minst 10 min.
Merk: Base trykket oppnådd avhenger vakuumpumpe brukes og kvalitet for plastposen. - Avsløre at evakuert samlingen UV med bredbånd Hg gass lampe på 270 W for 15 min. slå av vakuum pumpe og la forsamlingen sakte vent til lufttrykk før den endelige enheten fra forsamlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 presenterer transmisjon spektra av en helt ny CaF2 vinduet mønstret halvparten av enheten, og hele enheten. Alle tre spectra utstilling optimalt gjennomblikk til midten av IR med transmisjon større enn 80%. Forstyrrelsen mønsteret i spekteret av hele enheten (gul kurve i figuren) er forårsaket av luft gapet mellom 9-10 µm mellom de to vinduene. Disse spectra viser at fabrikasjon tilnærming presenteres her ikke endrer gjennomsiktighet CaF2 i midten av IR området.
Figur 7 en viser et eksempel på god replikering i NOA av PDMS sekundær mold med microfluidic lay-out. Strukturen på vinduet CaF2 er korrekt utformet på grunn av ren peeling av NOA laget fra PDMS formen etter at den er delvis UV kureres. Ingen NOA bør forbli på mold eller vinduet overflaten i kontakt med de utstikkende deler som formen. Noen NOA stakk til mold oversettes mangler NOA struktur på vinduet som ville forårsake lekkasjer under flyt eksperimenter av den endelige enheten. I tillegg for å oppnå god tetting av de to halvdelene, bør NOA fortsatt være klebrig etter UV eksponering av halv lag. NOA er over kurert hvis det ikke-klebrig. Eksponering dosen skal være optimalisert for å oppnå slike utfall.
Figur 7 b i stedet viser mislykkede replikering i NOA der mønsteret i vinduet CaF2 ikke er riktig definert. Det er hovedsakelig forårsaket av utilstrekkelig UV eksponering dose, dvsunder-herding av NOA. I slike tilfeller er fortsatt NOA litt våt, forårsaker noen av det å holde seg til PDMS mold. Men hvis NOA fremdeles holder seg til PDMS mold selv om korrekt eksponering dosen er gitt, dette kan være et symptom på silane belegg (dvs., anti-stick lag) blir degradert over tid. PDMS er en myk mold, er det ikke så langvarig som silisium primære mold. Må skiftes ut etter en rekke bruksområder.
Figur 1: Fabrikasjon prosessen av plast microfluidic enheter: (a-e) Skjematisk av fabrikasjon prosessen. (f) bilde av en faktisk enhet og skjematisk av sin tverrsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oversikt photomask, silisium primære mold og PDMS sekundære mold replikert fra silicon formen: (en) Photomask med lyse feltet polaritet (øverst til venstre); Lay-out av mønsteret i photomask (høyre) som består av: i-La og ut la med 2 mm diameter (1 og 2) og avstand på 3 cm mellom dem, kanaler med 300 µm bredde (3), to refererer kamre med 5,5 x 0.75 mm størrelse (4), sentrale kammer med 5 x 2,5 mm størrelse ( 5), Diffraksjon rister som en visuell veiledning med linjer 10 µm bredt og 20 µm gap (6); Zoome inn lay-out av sentrale kammeret viser Diffraksjon grating (nederst til venstre). (b) bilde av silisium primære mold med mønster definert i SU-8 photoresist. (c) bilde av PDMS sekundær mold med omvendt polaritet forhold til primære mold. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Templating verktøyene forberedt å lette apparat fabrikasjon: (en) akryl mal: faktiske mal (øverst) og dens skjematisk tverrsnittvisningen (nederst). (b) PDMS kopi av malen akryl: faktiske kopi (øverst) og dens skjematisk tverrsnittvisningen (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Prosessen flyt til fabrikasjon av mønstret halvparten av enheten: (en) sted PDMS mal på en flat overflate. Her brukte vi soda-lime glass. (b) CaF2 plasseres sentrert på PDMS pluggen. (c-d) PDMS mold er plassert ansiktet ned mot CaF2 med fluidic kammeret justert til midten av vinduet. Kontroller at alle elementene i god kontakt og justert. (e-f) Støping av NOA via i-La og la det sakte fylle hulrom. (g) NOA er kurert ved å utsette det under UV-lys. Eksponering dose kan variere avhengig av energien i UV-kilden som ble brukt. (h) nøye skrelle PDMS mold og mal å frigjøre herdet NOA. (jeg) fullført enheten laget med microfluidic strukturer i NOA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Vakuum trykk oppsett for å trykke på de to halvdelene av enheten å danne en fullstendig enhet: (en) PDMS sirkulær plate (8 mm diameter) og PDMS rektangel (4 x 2,5 cm) med pre-cut åpninger. Begge er kuttet fra et 1 mm tykt PDMS ark. (b) oversikt over lagstabelen før trykke. (c) oversikt over vakuum pressen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Midt-IR t ransmittance spektra av nakne CaF 2 vinduet (rød), en mønstret halvparten av enheten (blå), og en komplett enhet (gul). Alle tre spectra utstillingen optimalt gjennomblikk til midten av IR med transmisjon større enn 80% Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Mønster halvparten av enheten: (en) eksempel på en velformede microfluidic struktur i NOA. Mørkere område i vinduet viser en veldefinert struktur, viser tydelig den sentrale kammeret, to referanse kamre og kanalene. (b) eksempel på en dårlig utformet microfluidic struktur i NOA på grunn av undercuring. Det er flyt av NOA som indikeres av røde piler. En av referanse kamre mangler også (grønn pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Microfluidic jig enhetet fabrikkerte til eksterne fluidic kretsene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Plassering av PDMS mold under fabrikasjon av mønstret halvdel av enheten: (en) eksempel på god plassering av PDMS formen i vinduet CaF2 . Vinduet er i kontakt med bare protrusion på PDMS mold, viser tydelig den sentrale kammeret, to referanse kamre og kanalene (angitt med mørkere området). Diffraksjon rister rundt enheten og i midten av sentrale kammeret er ment for en visuell veiledning under plassering av PDMS mold. (b) eksempel på en dårlig plassering av PDMS mold i vinduet CaF2 . Mørkere området viser at det er også en uønsket område av mold, som er i kontakt med vinduet som angitt av den røde piler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å vurdere og optimalisere fabrikasjon protokollen, vi brukte en enkel layout på microfluidic mønsteret med en stor rektangulær kammer (5 x 2,5 mm størrelse) i sentrum, to små rektangulære kamre (5,5 x 0.75 mm størrelse) atskilt fra hoved kretsen på den øvre og nedre sider, og 300 µm bredt i-La/post-ut-let kanaler. Den sentrale kammeret brukes for det seeding og observasjon av celler, mens atskilt mindre kinesere brukes til å måle bakgrunnen air under FTIR eksperimenter som en referanse kammer, som omtalt i en tidligere publikasjon13. I La og ut la koble sentrale kammeret til eksterne fluidic.
Her er templating verktøy (se protokollen trinn 3) introdusert for å lette fabrikasjon prosessen. Tidligere var det vanskelig å konsekvent plasserer CaF2 windows nøyaktig i midten av den endelige enheten, som forårsaket problemer når justere de to halvdelene av enheten. Bruk av malen gir en visuell veiledning for å plassere vinduet og sikrer at plasseringen er alltid lik. Som geometriske kravene for disse malene ikke er svært strenge, kan standard og billig teknologi brukes. I dette tilfellet vi gjorde dem av akryl plast gjennom maskinering i en workshop, men et like levedyktig og billig alternativ er 3D-utskrift.
Utformingen av akryl malene er slik at de har følgende (Figur 3et): (a) en malen er utformet med to små hull på hver side, mens andre er uten hull; hullene er 1,5 mm diameter i størrelse og 1,5 mm i dybde, (b) både maler har runde hull med 8 mm diameter og 500 µm dybde i midten, og (c) begge maler har en rektangulær protrusion definere størrelse, form og tykkelsen på halv enheten. rektangelet er 4 cm x 2,5 cm i lengden og bredden og 1,5 mm tykkelse.
De resulterende PDMS malene replikert fra akryl maler har motsatt polaritet (Figur 3b): (a) en mal må to pilarer på hver side med 1,5 mm diameter og 1,5 mm høyde form i-La og la ut av den mønstret halvparten av enheten etter NOA avstøpning; den andre utformingsmalen vil være uten søyler, (b) begge maler har en 500 µm høye pilar i sentrum for å lette plasseringen av vinduene CaF2 ; Denne funksjonen vil bli referert til som "PDMS plugg", og (c) begge malene er med et hulrom, som definerer den endelige formen og størrelsen på hver halvdel av enheten: et rektangel form med 4 cm x 2,5 cm størrelse og 1,5 mm tykkelse i dette tilfellet.
Ytterligere forenkle fabrikasjon prosessen, ble Diffraksjon rister innlemmet i utformingen av photomask for den primære silicon formen. I den PDMS kopi av denne silicon formen er de grunne utstikkende deler (som er mindre enn 10 µm i høyden) vanskelig å se på grunn av optisk gjennomsiktigheten til PDMS. Men generere grunne utstikkende deler hvis ordnet i en rist av 10 µm bred linjer med 20 µm gap en lett synlig interferens mønster16. Denne forstyrrelsen mønsteret ble utnyttet som en visuell guide til å definere plasseringen av microfluidic lay-out i PDMS mold. Utformingen av mold inkorporerer en ramme laget av grating å definere generelle geometrien av enheten. Et annet risten ble videre lagt i sentrale Mysteriekammeret oppsettet microfluidic for å forenkle innretting med vinduet CaF2 . Det er verdt å merke seg at grating i sentrale kammer ikke vil blir gjengitt i den endelige enheten som består av en rekke kort hulrom som ikke er koblet til kanten av sentrale kammeret. Derfor ville den flytende NOA ikke kunne få tilgang til disse hulrom.
For celle injeksjon og middels exchange må hver enhet sin i La og ut la manuelt slått før tetting. Dette resulterte i ikke-reproduserbar plasseringen av hullene. Dette ikke begrense driften av hver enhet siden tilkoblingen ble oppnådd ved liming en liten metallisk pin på en av åpningene og knytter en plast reservoaret i den andre enden som avfall samler. Derfor er varierende stillinger av hullene ikke bekymring unntatt på bekostning av en mer kompleks fabrikasjon ordningen. Å forenkle og standardisere testing og siste bruken av hver enhet, en skreddersydd fluidic gigg med fast i-La/post-ut-let steder fjerner introdusert (se Figur 8), behovet for å koble pin og reservoaret. Derfor, i-La/post-ut-let hull med inkonsekvente posisjoner ville presentere et problem her. Ved å innlemme to 1,5 mm diameter hull i fabrikkerte akryl malen (protokollen trinn 3), som vil bli søylene i PDMS mold, fjernes måtte manuelt hull på endene av microfluidic kanalene. Videre deres posisjon er fast og det samme for hver enhet.
Fravær av lekkasjer i enheten kan kontrolleres med samme prosedyre som nevnt13 dvsav fôring enheten med en løsning av fluorescein i de-ionisert vann.
Avgjørende skritt i protokollen
Under fabrikasjon av mønstret halvdel av enheten, bør plassering av PDMS mold over CaF2 vinduet være nøye gjennomført. De eneste strukturene på mold som tillates å kontakte vinduet er de 10 µm høy utstikkende-deler. Når det er en uønsket kontakt området, bør mold plassering trinn gjøres. For å illustrere, viser figur 9en forsiktig plassering av mold vinduet mens figur 9b viser et eksempel på dårlig plassering, der en uønsket område av mold er i kontakt med vinduet. Figur 9 b vil resultere i en manglende NOA struktur på vinduet. Liten kvarts platen nevnt i protokollen (trinn 4.1.3, figur 2c) hjelper mold plasseringen som det hindrer at uønskede området av mold lett komme i kontakt med vinduet CaF2 . Både kvarts plate og PDMS mold er også tynne slik at de er tilstrekkelig lett og synlig for UV17,18.
Finne den riktige UV eksponering dosen for halv lagene er også avgjørende for fabrikasjon prosessen. Når NOA er utsatt med et lite dose, vil den uherdet NOA flyt under peeling, forårsaker tap av definisjonen på strukturen og muligens overfylte på CaF2 overflaten. På den annen siden, for høyt en eksponering dose resultater i over herding av NOA, snu NOA i en ikke-klebrig tilstand. Senere liming av de to halvdelene ville lide fordi ikke-klebrig NOA på mønstret halve laget ikke ville bånd til vinduet CaF2 på flat halve laget. Ideelt sett bør den riktige dosen være den korteste eksponeringendose som lar NOA replikere strukturen pålitelig samtidig opprettholde tilstanden tacky. Foruten å avgjøre det korrekte eksponering dosen, bør liming av de to halvdelene gjøres så snart som mulig, innen 30 min, som stickiness av NOA gradvis avtar med tid før det ikke er mulig for binding.
Andre ting å merke seg er når du bruker vakuum trykk systemet for binding. Samsvar lagene (dvs., tynne PDMS ark sandwiching enheten) bør ha relativt ensartet tykkelse for uniform lufttrykket distribusjon på enheten. For dette formålet, ble en skreddersydd akryl gigg med en definert spacer tykkelse brukt å avgi slike PDMS ark. Samsvar arkene skal også rene for å unngå å innføre lokal press, spesielt på sprø CaF2 vinduet.
Fordelene med metoden sammenlignet med eksisterende metoder
Vår fabrikasjon viste produksjon av plast enheter som er kompatible med FTIR mål. Fordi mikro-fabrikasjon teknikk gir god kontroll over dimensjonen av funksjonen, er oppnåelig kontrollen over høyden på microfluidic kanaler mye mer presis enn hva kan fås med andre fabrikasjon tilnærminger (f.eks, plast avstandsstykker).
En viktig fordel med denne protokollen er at det resulterer i en plast enhet med UV-Vis-IR gjennomsiktig visning-porter; alle tidligere vist microfluidic enheter for FTIR ble produsert på et stort IR gjennomsiktig substrat krever litografi trinnene for hver enhet10,11,12. I den nåværende tilnærmingen, er kostnadene og kompleksiteten av fabrikasjon redusert siden bare produksjon av Si mold krever litografi.
Til slutt, bruke en UV kureres harpiks (NOA73 i denne demonstrasjonen) som plast hoveddelen forenkler tilkobling av enheten til et eksternt flytende levering system, enten ved liming eller knytter tilkoblinger til plast kroppen eller med en fluidic gigg for raskere enheten produksjon eller bruk.
Fremtidige anvendelser av metoden
Mulig forbedringer og utvikling som kan utforskes, er to den mest umiddelbare og viktig. Først foreslår bredbånd optisk gjennomsiktigheten av utsikt-porten koblingen av FTIR med høy oppløsning fluorescens mikroskopi på samme plattform. Dette kan gjennomføres lett ved å redusere tykkelsen på en CaF2 Vinduer for å overholde kravene til en arbeidsavstand med høy numeriske blenderåpning og forstørring mål. Andre kan denne fabrikasjon ordningen gi mer komplekse fluidic oppsett. Flere observasjon kamre og funksjonelle elementer koble dem som miksere og sorters, kan implementeres som deres geometri definerer åpne hulrom under windows.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner takknemlig MBI økonomisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
