Summary
Ett protokoll för tillverkning av plast mikroflödessystem enheter med transparent vy-portar för synligt och infrarött ljus avbildning beskrivs.
Abstract
Infraröd (IR) spectro-mikroskopi av levande biologiska prover hämmas av att absorptionen av vatten i intervallet mitten-IR och av bristen på lämplig mikroflödessystem enheter. Här demonstreras ett protokoll för tillverkning av plast mikroflödessystem enheter, där mjuka litografiska tekniker används för att bädda in transparent kalciumfluorid (CaF2) Visa-portar i samband med observation chamber(s). Metoden är baserad på en replika gjutning strategi, där ett Polydimetylsiloxan (PDMS) mögel produceras genom litografiska standardförfaranden och används sedan som mall för att producera en plast enhet. Plast enheten har Ultraviolett/synligt/infraröda (UV/Vis/IR) - transparenta fönster gjorda av CaF2 för direkt observation med synliga och IR ljus. Fördelarna med den föreslagna metoden är: ett minskat behov för åtkomst till en anläggning för mikro-tillverkning av rena rum, flera Visa-portar, en lätt och mångsidig anslutning till en extern pumpsystemets genom plast kroppen, flexibiliteten i utformningen, t.ex. , öppen/stängd kanaler konfiguration och möjlighet att lägga till sofistikerade funktioner såsom nanoporösa membran.
Introduction
Fourier Transform infraröd Spectro-mikroskopi (FTIR) har använts flitigt som en etikett-fri och icke-invasiv imaging teknik att ge detaljerad kemisk information av ett urval. Detta möjliggör utvinning av biokemiska information att studera kemi av biologiska prover, med ett minimum av förberedelser eftersom absorptionsspektrum av exemplaret bär inneboende fingeravtryck på dess kemiska sammansättning1 , 2. nyligen, FTIR alltmer kopplats till studiet av levande biologiska prover, t.ex., celler3. Vatten, vilket är mediet för levande celler i de flesta fall, visar dock en stark absorbansen i regionen mid-IR. Även som ett tunt skikt, kan dess närvaro helt överväldiga den viktiga strukturella informationen av exemplar.
Under många år var den gemensamma strategin fastställande eller torkning prover för att helt utesluta vatten absorption signalen i spektrumet. Dock tillåter detta tillvägagångssätt inte realtid mätningar på levande celler, vilket är viktigt att studera förändringen av deras kemiska sammansättning och cellulära processer med tiden. Ett sätt att erhålla tillförlitlig Absorptionsspektra från levande biologiska prover, är att begränsa den totala optiska ljuspassagelängden medium för IR-strålen till mindre än 10 µm4.
En väl etablerad metod i levande cell experiment har varit hittills, försvagade Total reflektion (ATR)-FTIR imaging, som möjliggör mätningar oberoende av provets tjocklek, vilket gör att cellerna att upprätthållas i ett tjockare lager av vattenhaltigt medium. Dock begränsar små djup penetration av flyktig wave mätningar av prover till endast de första några mikrometer från ytan av ATR crystal5.
Alternativt, vatten absorption begränsningen har kringgåtts med uppkomsten av olika mikroflödessystem system, som delas generellt in i två stora grupper: Öppna kanalen (där en av vätska ytorna utsätts för atmosfären) och stängd kanal (där två IR-genomskinliga fönster är åtskilda med ett mellanlägg med en definierad tjocklek).
Loutherback et al. utvecklat en öppna-kanal membran enhet som möjliggör lång sikt kontinuerliga IR mätningar av levande celler för upp till 7 dagar6. Metoden kräver hög luftfuktighet i miljön för att förhindra avdunstning av medium från cellytan. Systemet fungerar bäst med celler som växer naturligt på luft-vätska gränssnitt, till exempel epitelial vävnader i hud, lunga, och ögon, eller mikrobiell biofilmer7.
En stängd-kanal konfiguration syftar till att skapa en enhetlig, tunna lager mellan två parallella IR-transparenta fönster, där cellerna bibehålls i sin vattenmedium. Tjockleken på denna hålighet är sådan att vatten absorption signalen är nedanför mättnad. Vatten bakgrund kan sedan subtraheras för att få den rätta prov spectra. De flesta av stängd-kanal metoder använda en Plastdistans separera de två fönstren för att bilda en demonterbar vätskekammaren3,8,9. En fördel med denna metod är att det inte kräver mikrofabrikation; strukturer som är mer komplex än en mätkammaren med in - och ut - let kanaler är dock mycket svårt att realisera i tunn mellanlägget. Det finns också ett problem med reproducerbarheten av sökvägen längd mellan IR mätningar på grund av beroendet av mekanisk fastspänning. För att uppnå en mer exakt kontroll av avståndet för en mer tillförlitlig spektrum förvärv, har optisk litografi metoder genomförts till mönster fotoresist ovanpå IR substratet att definiera de spacer9,10 , 11 , 12. även om detta gör det möjligt för mer komplexa strukturer definieras i distansen, metoden kräver tillgång till en mikrofabrikation anläggning för att producera mönstret på varje substrat.
I detta papper presentera vi en enkel fabrication teknik av en IR-kompatibel mikroflödessystem enhet, med syftet att minska tillverkning kosta och kravet på att öppna en mikrofabrikation anläggning. Metoden presenteras här (se figur 1) använder en etablerad process som kallas mjuka litografi. Två formar krävs i detta fall. Den primära formen är tillverkad av en 4-tums kisel wafer med en standard UV litografi process. Sekundära mögel är dess replik av PDMS, som har en polvändning av mönstret i silicon primära mögel och fungerar som master mögel för efterföljande enhet fabrication.
Enheten har två separata lager: en första lagret med mikroflödessystem layout (som i presenterade fall består av mikrofabricerade kanalen, i-låt/out-låt och en observation kammare med en CaF2 vyport) och ett andra lager med en plan yta ( som består av endast en CaF2 vyport).
Här används en UV-härdande optiska adhesiv Norland optiska självhäftande 73 (NOA73, förkortat NOA hädanefter), att bilda plast huvuddelen av enheten. Det finns flera fördelar med att använda detta optiska bindemedel: låg fabrication kostnad, enkel anslutning till externa system, bra optisk transparens, låg viskositet och viktigast av allt, biokompatibilitet13. CaF2 är ett lämpligt val som visningsområdet på grund av dess biokompatibilitet och utmärkt IR-öppenhet14.
Med detta nya tillvägagångssätt krävs tillgång till en mikrofabrikation anläggning strikt endast för tillverkning av primära mögel. Efterföljande tillverkning processer för plast mikroflödessystem enheten kan utföras i ett laboratorium som är utrustad med en UV-belysning källa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av kisel primära mögel
Obs: en photomasken krävs för beredning av primära mögel. Photomasken kan antingen köpas från oberoende leverantörer eller påhittade internt genom standard optisk mask fabrication förfaranden. En photomasken med ljusa fält polaritet används i detta fall ( figur 2 en).
- Mönster definition
- Spin rock en 4 tums kisel wafer med SU-8 3010 negativa fotoresist vid 2 300 rpm för 30 s.
- Soft-baka fotoresist på en värmeplatta vid 65 ° C i 2 min och sedan vid 95 ° C i 8 min.
- Exponera fotoresist för UV-ljus (i-line, 365 nm) genom photomasken under den mask aligner för total energi dos 100-120 mJ/cm 2; den hårda kontakta läget föredras att uppnå en bättre upplösning.
- Ta bort rånet och tillämpa en post exponering baka vid 65 ° C i 1 min och sedan vid 95 ° C i 2 min.
- Utveckla den fotoresist med en SU-8 developer vid rumstemperatur, sedan skölj med isopropylalkohol och blås försiktigt torr med kväve; uppmätta mönster tjockleken bör vara 10 µm och nedan. Se figur 2 b för bild av faktiska silikon mögel.
- Silanisering av kisel mögel
- unna kisel mögel med syre plasma på 60 W för 30 s med 20 sccm syre flöde. Ställ in kammare trycket 1-10 mbar under processen.
- Placera formen i en vakuum burk med 50 µL av silan och lämna burken i tillståndet vakuum (1-10 mbar) för minst 2 h.
Obs: Silanisering processen skapar en vattenavvisande ytbeläggning som förhindrar PDMS fastnar till mögel 15. Observera att primär mögel kan också vara fabricerade med hjälp av en alternativ metod, vilket innebär torr etsning av kisel. I det här fallet photomasken kommer att vara av motsatt polaritet (mörka fält), och mönstret definitionen i steg 1.1 kommer att använda en positiv fotoresist.
2. Beredning av PDMS sekundära mögel
- PDMS blandning
- blanda PDMS elastomer och härdare, 10:1, det totala beloppet är sådan att den resulterande PDMS tjockleken är ca 1 till 1,5 mm.
- Efter omsorgsfull blandning, lufta blandningen genom att lämna det i en vakuum burk i tillståndet vakuum (1-10 mbar) för ca 15 min eller tills det finns inga synliga bubblor; detta är att ta bort någon instängd luft i blandningen.
- Mögel replikering
- Häll PDMS blandningen på kisel mögel fabricerade i steg 1 och lufta blandningen för att ta bort någon instängd luft med samma inställningar som i steg 2.1.2. Värme vid 70 ° C i 2 h på en värmeplatta att bota blandningen.
- Bort det härdade PDMS från värmeplattan och låt den svalna ner till rumstemperatur. Med ett rakblad, skär PDMS längs kanterna av kisel mögel.
- Med en pincett, nypa ett hörn av snittet PDMS och dra försiktigt PDMS repliken av kisel mögel; resulterande mikroflödessystem mönstret på denna sekundära mögel är en utstick, som är den primära mögel (motsatt polaritet figur 2 c).
- silanisering av PDMS repliken (samma som i steg 1.2)
- behandla PDMS mögel med syre plasma på 60 W för 30 s med 20 sccm syre flöde. Ställ in kammare trycket 1-10 mbar under processen.
- Placera formen i ett vakuum burk med 50 µL av silan och lämna burken i tillståndet vakuum (1-10 mbar) för minst 2 h.
3. Beredning av PDMS mallar
Obs: vill standardisera formen och storleken av de slutliga enheterna och underlätta anpassningen av huvuddragen i de två halvorna, två separata PDMS mallar användes, som definierar geometri av enheten, placeringen av det transparenta fönstret och i - och ut - let anslutningarna. Den första PDMS-mallen underlättar tillverkning av den mönstrade hälften av enheten, medan de andra hjälper till att underlätta tillverkning av den platta delen av enheten.
- Utforma mallar med en datorstödd konstruktion (CAD) programvara. figur 3 en visar lay-out och dimensioner av mallen används för att tillverka den mönstrade hälften av enheten. För att fabricera den platta delen av enheten, ta bort 1,5 mm diameter hål från design.
- Förvärva mallar från en extern leverantör eller genom en intern mekanisk verkstad om tillgängliga.
Obs: Akryl användes som mallen material på grund av användarvänlighet fabrication och låg kostnad kan uppnås i någon standard verkstad. Det finns alternativ, såsom 3D-utskrifter. - Blanda PDMS elastomer och härdare 10:1; se till att förbereda en tillräcklig mängd av PDMS att helt dränka mallar.
- Efter omsorgsfull blandning, lufta blandningen genom att lämna det i en vakuum burk i vakuum staten (1-10 mbar) i ca 15 min eller tills det finns inga synliga bubblor (infaller senare), det är att ta bort någon instängd luft i blandningen.
- Häll PDMS blandningen på akryl mallar tills deras översta yta är nedsänkt ca 1 mm under vätskeytan. Avlufta PDMS igen för att ta bort någon instängd luft med samma inställningar som i 3.4. Värm detta vid 60 ° C för 2 h på en planat värmeplatta att bota blandningen.
- Bort det härdade PDMS från värmeplattan och låt den svalna ner till rumstemperatur. Med ett rakblad, skär PDMS längs kanterna av akryl mallar.
- Med en pincett, nypa ett hörn av snittet PDMS och dra försiktigt PDMS av akryl mallar.
Obs: Figur 3 b visar lay-out och dimensioner av PDMS repliken används för att tillverka den mönstrade hälften av enheten. - Förbereda andra PDMS repliken för fabricera lägenheten hälften av enheten genom att upprepa steg 3.3 till 3,7 men använder mallen akryl utan 1,5 mm diameter hål.
4. Mikroflödessystem enhet Fabrication
- tillverkning av mönstrade hälften av enheten (dvs. med enhet layout)
- behandla fönstret CaF 2 med syre plasma på 60 W för 30 s med 20 sccm syre flöde. Detta görs för att förbättra flödet av NOA under den följande fabrication.
Obs: Detta steg är inte obligatoriska. - Plats noga första PDMS mallen (en med 1,5 mm diameter pelarna) på en plan yta, t.ex., en natronkalk plattan ( figur 4 en). Placera ett CaF 2 fönster centrerad ovanpå PDMS pluggen och tryck försiktigt på fönstret så att det är bra kontakt med proppen ( figur 4 b).
- Ta PDMS mögel gjort i steg 2 och placera en tunn UV-genomskinlig platta (i detta fall, en kvarts platta, 500 µm tjock och 1,5 cm x 1,5 cm i storlek) på baksidan av mögel, i linje med placeringen av den centrala kammaren ( figur 4 c). Kontrollera att kvarts plåten är i god kontakt med PDMS mögel.
Obs: The kvarts platta förhindrar oönskade området av mögel från att enkelt komma i kontakt med fönstret CaF 2. - Försiktigt placera detta PDMS mögel ansikte ner mot fönstret CaF 2 med fluidic kammare anpassas till mitten av fönstret CaF 2. Kontrollera att alla element (mall, mögel och fönster) har bra kontakt och linje ( figur 4 c-4 d).
- Gradvis ta droppar av NOA i-låt av PDMS mallen och låt det långsamt fyller hålrummet. När kådan kommer i kontakt med kanten av fönstret, kapillära flödet kommer att fylla den tunna lucka (~ 10 µm) mellan PDMS mögel och CaF 2 fönster ( figur 4 e-4f).
- Efter hålrummet fylls helt, bota NOA genom UV-ljus (t.ex., med en UV-LED exponering system, figur 4 g).
Obs: Exponeringstiden kan variera med detta med energi av UV källan. UV-LED exponering systemet, som ger en effekttäthet 24 mW/cm 2, kräver runt 90 s på 100% effekt och kontinuerlig exponeringsläge. - Försiktigt tunn kvarts plattan från baksidan av PDMS mögel och sedan dra försiktigt PDMS mögel från toppen av lagrets NOA ( figur 4 h). Slutligen, ta bort NOA lagret från mallen PDMS ( figur 4 i).
Obs: Den resulterande enhet layouten på den härdade NOA skulle ha samma polaritet av mönstret i primära silikon mögel.
- behandla fönstret CaF 2 med syre plasma på 60 W för 30 s med 20 sccm syre flöde. Detta görs för att förbättra flödet av NOA under den följande fabrication.
- Tillverkning av platta hälften av enheten (dvs. utan enhet layout)
- behandla fönstret CaF 2 med syre plasma vid 60 W för 30 s med 20 sccm av syreflödet.
Obs: Detta steg är inte obligatoriska. - Placera försiktigt den andra PDMS-mallen (en utan pelarna med 1,5 mm i diameter) på en plan yta, t.ex., en soda lime tallrik. Placera ett CaF 2 fönster centrerad ovanpå PDMS pluggen och tryck försiktigt på fönstret så att det är bra kontakt med kontakten.
- Placera ett 1 mm tjockt PDMS blad med 5 x 3,5 cm storlek ovanpå fönstret CaF 2 med PDMS arket i linje med mitten av mallen PDMS. Kontrollera att bladet PDMS är i bra kontakt med fönstret.
- Gradvis ta droppar av NOA i-låt av PDMS mallen och låt det långsamt fyller hålrummet.
- Efter hålrummet fylls helt, bota NOA genom UV-ljus (t.ex., med ett system för exponering av UV-LED).
Obs: Exponeringstiden kan variera därför med UV energikällan. Med UV-LED exponering system, som ger en effekttäthet 24 mW/cm 2, detta kräver runt 50 s på 100% effekt och kontinuerlig exponeringsläge. - Peel off PDMS bladet från toppen av lagrets NOA och ta försiktigt bort det härdade NOA lagret från mallen PDMS.
- behandla fönstret CaF 2 med syre plasma vid 60 W för 30 s med 20 sccm av syreflödet.
- Limning av de två halvorna av enheten
- rikta in de två halvorna av enheten så att både CaF 2 windows är linje. Försiktigt finger-press båda halvorna i hörnet av NOA lagren så att positionen för de två halvorna korrigeras.
- Skär två cirkulära skivor ur en 1 mm tjock PDMS bladet med en 8 mm där hålslag mellan diameter är ( figur 5 en).
- Klipp två rektanglar med samma storlek på enheten (4 x 2,5 cm) från ett 1 mm tjockt PDMS blad. På både PDMS rektanglar, skära öppningar motsvarar kanalerna och i-låt/ut-let enhetens.
Obs: Färdigskurna öppningar i PDMS rektanglarna är avsedda att förhindra kanalerna från att kollapsa under pressning. - Stack i följande ordning från botten: en PDMS rektangel med färdigskurna öppningar, en PDMS skiva (i kontakt med det nedre fönstret, skära i steg 4.3.2), de två finger-pressande halvorna av enheten, den andra PDMS skivan (sitter på det övre fönstret), och slutligen andra PDMS rektangeln med färdigskurna öppningar ( figur 5 b).
- Placera denna församling i vakuum tryck setup så att det är inklämt mellan 2 plattor och förslut plastpåsen ( bild 5 c). Slå på vakuumpumpen och evakuera församlingen. Låt vakuumpump når dess bastrycket eller tillämpa vakuum i minst 10 min.
Obs: Bastrycket uppnåtts beror på vakuumpump används och kvaliteten på tätning av plastpåsen. - Utsätta den evakuerade församlingen UV-med en bredband Hg gaslampa på 270 W för 15 min. Vänd av vakuumpump och låt församlingen vent långsamt till atmosfärstryck innan du tar bort den sista enheten från församlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6 presenterar transmittans spektra av ett helt nytt CaF2 fönster, den mönstrade halvan av enheten, och den kompletta anordningen. Alla tre spektra uppvisar utmärkt insyn till mid IR med transmittans större än 80%. Interferensmönstret synliga i spectrumen av hela enheten (gula kurvan i figuren) orsakas av luftspalten i intervallet 9-10 µm mellan de två fönstren. Dessa spektra visar att metoden fabrication presenteras här inte påverkar insynen i CaF2 i mellanregistret IR.
Figur 7 en visar ett exempel på bra replikering i NOA av PDMS sekundära mögel med mikroflödessystem lay-out. Strukturen på toppen av fönstret CaF2 bildas väl på grund av ren peeling av lagrets NOA från PDMS mögel efter är det delvis UV-härdad. Ingen NOA bör förbli på mögel eller fönster ytan vid de utskjutande delarna mögel. Någon NOA som fastnat på mögel översätter till saknas NOA struktur på fönstret som skulle orsaka läckor under flöde experiment av den sista enheten. Dessutom för att uppnå god tätning av de två halvorna, bör NOA fortfarande vara klibbig efter UV-exponering av hälften lager. NOA är alltför botas om det är icke-klibbig. Exponering dosen bör optimeras för att nå sådana resultat.
Figur 7 b i stället visar misslyckad replikering i NOA där mönstret på fönstret CaF2 ordentligt inte definieras. Det är oftast orsakas av otillräcklig UV exponeringsdos, dvsunder-härdning av NOA. I sådana fall är NOA fortfarande något vått, orsakar en del av det att hålla sig till PDMS mögel. Dock om NOA fastnar fortfarande PDMS mögel även om rätt exponering dosen har givits, detta kan vara ett symptom av silan beläggning (dvs, anti stick lager) att vara försämras över tid. PDMS är en mjuk mögel, är det inte så lång hållbarhet som kisel primära mögel. Den behöver bytas efter ett antal användningsområden.
Figur 1: Tillverkningsprocessen av plast mikroflödessystem enheter: (a-e) Schematisk bild av tillverkningsprocessen. (f) bild av en faktisk enhet och Schematisk bild av dess tvärsnitt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Översikt av fotomask, kisel primära mögel och PDMS sekundära mögel replikeras från silicon formen: (en) photomasken med ljusa fält polaritet (vänster överkant); Lay-out av mönstret i photomasken (höger) bestående av: i-låt och ut låt med 2 mm diameter (1 och 2) och avståndet mellan dem, kanaler med 300 µm bredd 3 3 cm, två referera kammare med 5,5 mm x 0,75 mm storlek (4), centrala kammaren med 5 x 2,5 mm storlek ( 5), diffraktion galler som en visuell guide med linjerna 10 µm breda och 20 µm gap (6). Zooma in lay-out av den centrala kammaren visar diffraktion gallret (nedre vänstra). (b) bild av kisel primära formen med det mönster som definierats i den SU-8 fotoresist. (c), bild av PDMS sekundära formen med Omvänd polaritet med avseende på den primära formen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Verktygen mallhantering beredd att underlätta enhet tillverkning: (en) akryl mall: faktiska mall (överst) och dess Schematisk tvärsnittsvyn (nederst). (b), PDMS replika av mallen akryl: faktiska replika (överst) och dess Schematisk tvärsnittsvyn (nederst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Processflöde för tillverkning av den mönstrade hälften av enheten: (en) plats till PDMS mall på en plan yta. Här använde vi soda lime glas. (b) CaF2 placeras centrerad ovanpå PDMS kontakten. (c-d) PDMS mögel placeras ansikte ner mot den CaF2 med fluidic kammare anpassas till mitten av fönstret. Säkerställa att alla delar har bra kontakt och arrangera i rak linje. (e-f) Gjutning av NOA via i-låt och låter det sakta fylla hålrummet. (g), NOA botas genom att exponera det i UV-belysning. Exponering dosen kan variera beroende på energin av den UV-källa som används. (h) försiktigt skala PDMS mögel och mall att släppa den härdade NOA. (jag) slutfört enhet skikt med mikroflödessystem strukturer i NOA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Vakuum tryck på setup för att trycka på de två halvorna av enheten för att bilda en komplett enhet: (en) PDMS cirkulär skiva (8 mm diameter) och PDMS rektangel (4 x 2,5 cm) med färdigskurna öppningar. Båda är klippt från ett 1 mm tjockt PDMS blad. (b) Översikt över lager-stacken innan du trycker. (c) Översikt över vakuum pressen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Mid-IR t ransmittance spektra av kala CaF 2 fönster (röd), en mönstrad hälften av enheten (blått), och en komplett enhet (gul). Alla tre spektra uppvisar utmärkt insyn till mid IR med transmittans större än 80% Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: Mönstrad hälften av enheten: (en) exempel på en välformad mikroflödessystem struktur i NOA. Mörkare området i fönstret visar en väl definierad struktur, visar tydligt den centrala kammaren, två referens kammare och kanaler. (b) exempel på en dåligt bildade mikroflödessystem struktur i NOA på grund av undercuring. Det finns återflöde av NOA som anges med röda pilar. En av avdelningarna referens saknas också (grön pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 : Mikroflödessystem jig ansluta fabricerade enheten till externa fluidic kretsar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Placering av PDMS mögel under tillverkning av mönstrade hälften av enheten: (en) exempel på bra placering av PDMS mögel på CaF2 fönster. Fönstret är i kontakt med endast utsticket på PDMS mögel, visar tydligt den centrala kammaren, två referens kammare och kanalerna (indikeras av området mörkare). Diffraktion gallerdurken runt enheten och i mitten av den centrala kammaren är avsedda för en visuell guide under placeringen av PDMS mögel. (b) exempel på en dålig placering av PDMS mögel på CaF2 fönster. Det mörka området visar att det finns ett oönskat område av mögel, som är i kontakt med fönstret, som indikeras av de röda pilarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att bedöma och optimera fabrication protokollet, vi använde en enkel layout för mikroflödessystem mönster med en stor rektangulär kammare (5 x 2,5 mm storlek) på center, två små rektangulära kammare (5,5 x 0,75 mm storlek) separeras från den stora kretsen på den övre och nedre sidorna och 300 µm breda i-låt/ut-let kanaler. Den centrala kammaren används för odling och observation av cellerna, medan de två separerade mindre kammarna används för att mäta luft bakgrunden under FTIR experiment som en referens kammare, som diskuterats i en tidigare publikation13. Den i-låt och ut låt förbinda den centrala kammaren till externa fluidic system.
Här introduceras mallhantering verktyg (se protokollet steg 3) för att underlätta tillverkningsprocessen. Tidigare var det svårt att konsekvent placera CaF2 Fönstren exakt i mitten av den sista enheten, som orsakat problem när rikta in de två halvorna av enheten. Användning av mallen ger en visuell guide för att placera fönstret och säkerställer att platsen alltid är liknande. De geometriska kraven för dessa mallar är inte mycket stränga, kan standard och billig produktionsteknik användas. I det här fallet, vi gjorde dem av akrylplast genom bearbetning i en workshop, men lika livskraftig och billigt alternativ är 3D-utskrifter.
Utformningen av akryl mallarna är sådan att de har följande (figur 3en): (a) en mallen är utformad med två små hål på varje sida, medan andra är utan hål; hålen är 1,5 mm i diameter i storlek och 1,5 mm i djup, (b) både mallar har ett cirkulärt hål med 8 mm diameter och 500 µm djup i mitten, och (c) båda mallarna har en rektangulär utstick att definiera storlek, form och tjocklek av halva enheten; rektangeln är 4 x 2,5 cm i längd och bredd och 1,5 mm i tjocklek.
De resulterande PDMS mallar replikeras från akryl mallarna kommer att ha motsatt polaritet (figur 3b): (a) en mall kommer att ha två pelare på varje sida med diameter 1,5 mm och 1,5 mm höjd att bilda den i-låt och ut låt av den mönstrad hälften av enheten efter NOA gjutning. den andra mallen kommer att vara utan pelare, (b) båda mallarna har en 500 µm lång pelare i mitten för att underlätta placeringen av CaF2 Fönstren; Denna funktion kommer att benämnas ”PDMS plug”, och (c) båda mallarna är med en hålighet, som definierar den slutliga formen och storleken på varje halva av enheten: en rektangel form med 4 x 2,5 cm storlek och 1,5 mm tjocklek i detta fall.
För att ytterligare underlätta tillverkningsprocessen, införlivades diffraktion galler i utformningen av photomasken för primära silikon mögel. I PDMS replika av detta silikon mögel är ytlig utskjutande delar (som är mindre än 10 µm i höjd) svårt att se på grund av optisk transparens av PDMS. Däremot generera grunt utskjutande delar om ordnade i ett galler av 10 µm breda linjer med 20 µm gap en väl synlig störningar mönster16. Detta interferensmönstret var utnyttjade som en visuell guide för att definiera positionen för mikroflödessystem lay-out i PDMS mögel. Den har en ram av gallret att definiera övergripande geometri av enheten av mögel. En annan gallerdurk lades ytterligare i mitten av den centrala kammaren av mikrofabricerade layouten för att underlätta anpassningen till fönstret CaF2 . Det är värt att notera att gallret i den centrala kammaren inte kommer att reproduceras i den sista enheten eftersom den består av en serie korta hål som inte är anslutna till kanten av den centrala kammaren. Den flödande NOA skulle därför inte kunna komma åt dessa håligheter.
För cell injektionen och utbyte av datamedium behöver varje enhet dess i-låt och ut låt manuellt stansas innan tätning. Detta resulterade i icke-reproducerbara positionering av hålen. Detta inte begränsa driften av varje enhet eftersom anslutningen uppnåddes genom limning ett litet metalliska stift på en av öppningarna och fästa en plast reservoar i andra änden som en insamlare. Därför är varierande positioner av hålen inte berör utom på bekostnad av en mer komplex tillverkning-systemet. Att förenkla och standardisera testning och slutliga användningen av varje enhet, en skräddarsydd fluidic jigg med fasta platser för i-låt/ut-let är infördes (se figur 8), att ta bort behovet av att bifoga pin och reservoar. Därav, i-låt/ut-let hål med inkonsekvent positioner skulle presentera en fråga här. Genom att införliva två 1,5 mm diameter hål i fabricerade akryl mallen (protokoll steg 3), som kommer att bli pelare i PDMS mögel, tas behovet av att manuellt stansa hål i ändarna på de mikroflödessystem kanalerna bort. Dessutom deras position är fast och samma för varje enhet.
Avsaknad av läckor i enheten kan kontrolleras med samma procedur som diskuteras på annat håll13 dvs, genom att mata enheten med en lösning av fluorescein i avjoniserat vatten.
Kritiska steg i protokollet
Under tillverkning av mönstrade hälften av enheten, bör placering av PDMS mögel ovanpå fönstret CaF2 noggrant utföras. De enda strukturer på mögel som får kontakta fönstret är 10 µm hög utskjutande delar. När det finns ett oönskat kontaktyta, bör steget mögel placering göras. För att illustrera, visar figur 9en noggrann placering av mögel på fönstret, medan figur 9b visar ett exempel på dålig placering, där ett oönskat mögel är i kontakt med fönstret. Figur 9 b skulle resultera i en saknas NOA struktur på fönstret. Den små kvartar plattan nämns i protokollet (steg 4.1.3, figur 2c) hjälper mögel placering eftersom den förhindrar oönskade området av mögel från att enkelt komma i kontakt med fönstret CaF2 . Både kvarts platta och PDMS mögel är också tunna så att de är tillräckligt lätta och transparenta till UV17,18.
Att hitta rätt UV exponeringsdos för halva lagren är också avgörande för tillverkningsprocessen. När NOA exponeras med en otillräcklig dos, kommer den ohärdade NOA flöda under peeling off, vilket orsakar en förlust av definition av strukturera och eventuellt överfyllda på CaF2 yta. Å andra sidan, för hög av en exponering dosen resulterar i alltför bota den NOA, NOA förvandlas med ett icke-klibbig tillstånd. Efterföljande limning av de två halvorna skulle lida eftersom icke-klibbig NOA på mönstrade hälften lager inte skulle bond till fönstret CaF2 platta hälften i lagret. Helst bör den korrekta dosen vara den kortaste exponeringendosen som tillåter NOA att replikera strukturen på ett tillförlitligt sätt fördriva tiden stilla uppehållande dess tacky tillstånd. Förutom att bestämma korrekt exponering dosen, bör limning av de två halvorna ske så snart som möjligt, inom 30 min, som klibbighet av NOA minskar gradvis med tiden tills det inte längre möjligt för limning.
Andra punkter att notera är att använda vakuum tryck för limning. Överensstämmelse lagren (dvs., tunna PDMS blad sandwiching enheten) bör ha relativt enhetlig tjocklek för jämn tryckfördelning på enheten. För detta ändamål användes en skräddarsydd akryl jigg med en definierad spacer tjocklek att kasta sådana PDMS ark. Överensstämmelse arken bör också vara rena för att undvika att införa lokala tryck, särskilt på det sköra CaF2 fönstret.
Fördelarna med metoden jämfört med befintliga metoder
Vår tillverkning strategi visat produktion av en plast enhet som är kompatibel med FTIR mätningar. Eftersom micro-fabrication tekniken ger god kontroll över dimensionen av funktionen, är kan uppnås kontroll över höjden av mikrofabricerade kanalerna mycket mer exakt än vad kan erhållas med andra fabrication-metoder (t.ex., plast distanser).
En avgörande fördel av detta protokoll är att det resulterar i en plast enhet med UV-Vis-IR transparent vy-portar; alla tidigare påvisade mikroflödessystem enheter för FTIR producerades ovanpå en stor IR genomskinliga substrat, som kräver litografi steg för varje enhet10,11,12. I den nuvarande metoden minskar kostnaden och komplexiteten av tillverkning eftersom endast produktion av Si mögel kräver litografi.
Slutligen, med hjälp av en UV-härdande resin (NOA73 i denna demonstration) som plast huvuddel underlättar anslutning av enheten till en extern flytande leveranssystem, antingen genom limning eller fästa anslutningarna till plast kroppen eller med hjälp av en fluidic Jigg för snabbare enheten produktion eller användning.
Framtida tillämpningar av metoden
Av möjliga förbättringar och utveckling som kan utforskas, är två den mest omedelbara och viktigt. Först föreslår den bredband optisk transparensen av Visa-porten kopplingen av FTIR med högupplöst fluorescensmikroskopi på samma plattform. Detta kan lätt uppnås genom att minska tjockleken på en av CaF2 Fönstren för att uppfylla kraven i en arbetsavstånd med hög numerisk bländare och hög förstoringsgrad. För det andra kan detta fabrication system för mer komplexa fluidic layouter. Flera observation chambers och funktionselement som ansluter dem till exempel blandare och sorterare, kan genomföras så länge deras geometri definierar den öppna hålrummen nedanför Fönstren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner tacksamt MBI ekonomiskt stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical | |||
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane 97% | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS | |
| Norland Optical Adhesive 73 | Norland Products Inc. | 7304 | |
| SU8 3010 photoresist | MicroChem | Y311060 | |
| SU8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| Material | |||
| Silicon wafer, 4 inch, prime grade | Bonda Technology Pte Ltd | ||
| CaF2 IR-grade windows | Crystran, UK | CAFP10-1 | 10 mm diameter, 1 mm thickness |
| Acrylic templates | Custom made | ||
| Equipment | |||
| UV-KUB 2 (UV LED exposure system) | KLOE | Emission spectrum 365nm ± 5nm | |
| Newport UV lamp | Newport | Model 66902 | 50-500 Watt Hg arc lamp |
| CEE Spin coater | Brewer Science | Model 200x | |
| MJB4 mask aligner | SUSS MicroTec | ||
| Precision digital hot plate | Harry Gestigkeit GmbH | 2860SR | |
| Plasma Surface Technology | Diener Electronic GmbH + Co. KG | For O2 plasma treatment | |
| IDP-3 Dry Scroll Vacuum Pump | Agilent Technologies | ultimate pressure 3.3 x 10-1 mbar | |
| Bruker IFS 66v/s FTIR Spectrometer | Bruker |
References
- Holman, H. -Y. N., et al. Synchrotron infrared spectromicroscopy as a novel bioanalytical microprobe for individual living cells: cytotoxicity considerations. BIOMEDO. 7 (3), 417-424 (2002).
- Liu, K. Z., Xu, M., Scott, D. A. Biomolecular characterisation of leucocytes by infrared spectroscopy. Br J Haematol. 136 (5), 713-722 (2007).
- Moss, D. A., Keese, M., Pepperkok, R. IR microspectroscopy of live cells. Vibrational Spectroscopy. 38 (1-2), 185-191 (2005).
- Rahmelow, K., Hubner, W. Infrared Spectroscopy in Aqueous Solution: Difficulties and Accuracy of Water Subtraction. Appl Spectrosc. 51 (2), 160-170 (1997).
- Kazarian, S. G., Chan, K. L. ATR-FTIR spectroscopic imaging: recent advances and applications to biological systems. Analyst. 138 (7), 1940-1951 (2013).
- Loutherback, K., Chen, L., Holman, H. Y. Open-channel microfluidic membrane device for long-term FT-IR spectromicroscopy of live adherent cells. Anal Chem. 87 (9), 4601-4606 (2015).
- Loutherback, K., Birarda, G., Chen, L., Holman, H. -Y. Microfluidic approaches to synchrotron radiation-based Fourier transform infrared (SR-FTIR) spectral microscopy of living biosystems. Protein Pept Lett. 23 (3), 273-282 (2016).
- Dousseau, F., Therrien, M., Pézolet, M. On the Spectral Subtraction of Water from the FT-IR Spectra of Aqueous Solutions of Proteins. Appl Spectrosc. 43 (3), 538-542 (1989).
- Tobin, M. J., et al. FTIR spectroscopy of single live cells in aqueous media by synchrotron IR microscopy using microfabricated sample holders. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 34-38 (2010).
- Birarda, G., et al. Infrared microspectroscopy of biochemical response of living cells in microfabricated devices. Vibrational Spectroscopy. 53 (1), 6-11 (2010).
- Vaccari, L., Birarda, G., Businaro, L., Pacor, S., Grenci, G. Infrared microspectroscopy of live cells in microfluidic devices (MD-IRMS): toward a powerful label-free cell-based assay. Anal Chem. 84 (11), 4768-4775 (2012).
- Mitri, E., et al. SU-8 bonding protocol for the fabrication of microfluidic devices dedicated to FTIR microspectroscopy of live cells. Lab Chip. 14 (1), 210-218 (2014).
- Birarda, G., et al. IR-Live: fabrication of a low-cost plastic microfluidic device for infrared spectromicroscopy of living cells. Lab Chip. 16 (9), 1644-1651 (2016).
- Wehbe, K., Filik, J., Frogley, M. D., Cinque, G. The effect of optical substrates on micro-FTIR analysis of single mammalian cells. Anal Bioanal Chem. 405 (4), 1311-1324 (2013).
- Helmut, S., et al. Controlled co-evaporation of silanes for nanoimprint stamps. Nanotechnology. 16 (5), 171 (2005).
- Loewen, E. G., Popov, E. Diffraction Gratings and Applications. , Taylor, Francis. (1997).
- Technical Note: Optical Materials. , Available from: https://www.newport.com/n/optical-materials (2017).
- Cai, D., Neyer, A., Kuckuk, R., Heise, H. M. Raman, mid-infrared, near-infrared and ultraviolet-visible spectroscopy of PDMS silicone rubber for characterization of polymer optical waveguide materials. J Mol Struc. 976 (1-3), 274-281 (2010).
