Summary
ويهدف هذا البروتوكول لتقديم طريقة عامة لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدران الخلايا النباتية باستخدام رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات.
Abstract
تطبيق رامان التصوير إلى الكتلة الحيوية النباتية آخذ في الازدياد لأنه يمكن أن توفر المعلومات المكانية والتراكيب على المحاليل المائية. ولا يتطلب التحليل عادة إعداد عينات واسعة النطاق؛ يمكن الحصول على المعلومات الهيكلية والكيميائية دون وضع العلامات. ومع ذلك، كل صورة رامان يحتوي على آلاف الأطياف. وهذا يثير صعوبات عند استخراج المعلومات الخفية، وخاصة بالنسبة للمكونات ذات الهياكل الكيميائية مماثلة. يقدم هذا العمل تحليلا متعدد المتغيرات لمعالجة هذه المشكلة. بروتوكول يحدد طريقة عامة لتصور المكونات الرئيسية، بما في ذلك اللجنين والسليلوز، وهيميسيلولوز داخل جدار الخلية النباتية. في هذا البروتوكول، وصفت إجراءات لإعداد العينات، واكتساب الطيفية، ومعالجة البيانات. وهي تعتمد اعتمادا كبيرا على مهارة المشغل في إعداد العينات وتحليل البيانات. باستخدام هذا النهج، وتحقيق رامان يمكن أن يؤديها مستخدم غير متخصص لاكتساب هيغh- بيانات ذات جودة ونتائج ذات مغزى لتحليل جدار الخلية النباتية.
Protocol
1. إعداد العينة
- قطع كتلة الأنسجة الصغيرة (حوالي 3 مم × 3 مم × 5 مم) من عينة النبات (على سبيل المثال، الجذعية الحور).
- تزج الأنسجة في الماء المغلي منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة. نقل على الفور إلى الماء منزوع الأيونات في درجة حرارة الغرفة (رت) لمدة 30 دقيقة. كرر هذه الخطوة حتى يغسل الأنسجة إلى الجزء السفلي من الحاوية، مشيرا إلى أن الهواء في الأنسجة قد أزيلت وأن الأنسجة قد خففت.
ملاحظة: للعينات التي تغرق إلى أسفل قبل هذه الخطوة، عموما تكرار هذه الدورة 3-5 مرات. - إعداد 20، 50، 70، 90٪ (ت / ت) أليكوتس من البولي ايثيلين جلايكول (بيج) في الماء منزوع الأيونات، وكذلك بيج النقي، والحفاظ على الحلول عند 65 درجة مئوية.
- احتضان الأنسجة في سلسلة من حمامات بيج متدرج لتحل محل المياه والسماح لل بيج التسلل.
ملاحظة: عادة، يستخدم بيج مع الوزن الجزيئي 2،000 (PEG2000) للتضمين.- معالجة الأنسجة مع ز(أ) 20٪ بيج لمدة 1 ساعة، (ب) 50٪ بيج لمدة 1.5 ساعة، (ج) 70٪ بيج لمدة 2 ساعة، (د) 90٪ بيج لمدة 2 ساعة، و (ه) 100٪ بيج لمدة 10 ساعة.
- قبل الحارة كاسيت في 65 درجة مئوية في الفرن. صب بيج تحتوي على كتلة في الكاسيت ثم ضع كتلة الأنسجة في الموضع المطلوب باستخدام ملاقط ما قبل تحسنت أو الإبر.
- تبرد ببطء أسفل الكاسيت وتخزين الأنسجة في رت حتى الاستخدام.
- تشريح كتلة بيج تحتوي على الأنسجة المستهدفة في كتلة صغيرة (حوالي 1 سم × 1 سم × 2 سم) باستخدام شفرة حلاقة حادة وتركيبه على مشراح.
- قطع أجزاء رقيقة من كتلة بيج (عادة 3-10 ميكرون).
- شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات لإزالة بيج من الأنسجة.
- تزج المقاطع مع التولوين / الايثانول (2: 1، الخامس / الخامس) لمدة 6 ساعات لإزالة المواد الاستخراجية. إعداد السائل التفاعل عن طريق خلط 65 مل من الماء منزوع الأيونات، 0.5 مل من حمض الخليك، و 0.6 غرام من الصوديوم كلوشعيرة في كوب. إضافة قسم واحد و 3 مل من السائل رد فعل إلى قارورة 5 مل. المسمار على الجزء العلوي من القارورة.
- تسخين القارورة في حمام مائي في 75 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لإزالة اللجنين من الأنسجة. شطف القسم مع الماء منزوع الأيونات في ساعة الزجاج 10 مرات.
- نقل القسم غير المعالجة / ديليغنيفيد إلى شريحة المجهر الزجاجي. قم بتفكيك القسم بعناية باستخدام الفرش أو الإبر. إزالة الماء منزوع الأيونات اضافية مع ورقة الأنسجة.
- تزج القسم في D 2 O. تغطية العينة مع زلة غطاء الزجاج. ختم غطاء زلة مع طلاء الأظافر لمنع تبخر D 2 O.
2. اكتساب الطيفي
- فتح برنامج التشغيل الصك المجهر رامان مبائر. بدوره على الليزر (الطول الموجي = 532 نانومتر)، والتركيز على سطح السيليكون البلورية مع الهدف المجهر 100X، وانقر على زر المعايرة لمعايرة الصك.
- تبديل الصكإلى وضع المجهر الضوئي وتشغيل مصباح المجهر. جبل شريحة المجهر على خشبة المسرح، مع زلة غطاء تواجه الهدف.
- عرض العينة مع الهدف المجهر 20X وتحديد مجال الاهتمام. تطبيق زيت الغمر إلى ساترة والتبديل إلى الهدف المجهر الغمر (60X، الفتحة العددية نا = 1.35). التركيز على سطح العينة.
- تبديل الصك إلى وضع الاختبار رامان وإيقاف مصباح المجهر.
- اختر منطقة رسم الخرائط باستخدام أداة مستطيلة. تغيير حجم الخطوة لتحديد عدد الأطياف التي تم الحصول عليها.
ملاحظة: كن على بينة من حجم الخطوة (عادة أكبر من القطر بقعة يحسبها الفتحة العددية للهدف؛ نظريا 1.22λ / نا). الأحجام أدناه هذا سوف يؤدي إلى الإفراط. - وقم بتعيين المعلمات الطيفية المثلى للحصول على أفضل نسبة من الإشارة إلى الضوضاء (شنر) والجودة الطيفية في وقت اقتناء مناسب (عموما <8 h)، ديبندينغ على ملاءمة العينة. عموما، إدخال المعلمات التصوير في برنامج الصك على النحو التالي: ليزر (532 نانومتر)، تصفية (100٪)، حفرة (300)، شق (100)، مطياف (1،840 سم -1 )، الأخاديد (1200t)، الهدف ( 60X النفط)، ووقت الاستحواذ (2 ق).
- حفظ البيانات الطيفية قبل معالجة البيانات وتحويلها إلى شكل عالمي (على سبيل المثال، ملفات تكست).
3. تحليل البيانات
- تحميل البيانات الطيفية (ملفات تكست) في برنامج تحليل البيانات (على سبيل المثال، ماتلاب). تطبيق تقنية الحد من الضوضاء على مجموعة البيانات لتحسين شنر (على سبيل المثال، خوارزمية سافيتسكي غولاي أو خوارزمية المويجات)
- استخدام عينات غير المعالجة لإنتاج الصور من اللجنين والسكريات. لتصوير اللجنين، والنظر في الذروة الطيفية حوالي 1600 سم -1 بسبب العطرية متماثل تمتد الاهتزاز. لتصوير السكاريد (بما في ذلك السليلوز وهيميسيلولوز)، واستخدام الذروة الطيفية أجولة 2،889 سم -1 بسبب تش و تش 2 تمتد.
- استخدام عينات ديليغنيفيد لتوليد الصور من السليلوز وهيميسيلولوز. أداء الذاتي النمذجة منحنى القرار (سمكر) على أطياف المكتسبة للتمييز أطياف السليلوز وهيميسيلولوز وصورة توزيعاتها.
- إجراء تحليل المكون الرئيسي (يكا) وتحليل العنقودية على البيانات المكتسبة للتمييز بين أطياف رامان من مختلف طبقات جدار الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن نظام رامان نموذجي نموذجي لتصوير رامان من جدار الخلية النباتية. على سبيل المثال، أطياف رامان الأصلية من الحور ( بوبولوس نيغرا L.) لديها الانجرافات خط الأساس كبيرة والمسامير ( الشكل 2A ). بعد تنفيذ طريقة المعالجة المسبقة التلقائي لمجموعة بيانات التصوير رامان (أبري)، يتم إزالة هذه الملوثات الطيفية بنجاح ( الشكل 2B ). ويعرض الشكل 3 طيف رامان نموذجي من الحور، وترد مهام الفرقة الخاصة به في الجدول 1 . يتم إنشاء صورة رامان من اللجنين من خلال دمج المنطقة الطيفية من 1،550-1،650 سم -1 ، وهو ما يعزى إلى هيكل حلقة العطرية ( الشكل 4A ). الشكل 4D يعرض صورة رامان من السكريات، وويتحقق إش من خلال دمج الذروة في 2،889 سم -1 . إلى صورة السليلوز و هيميسيلولوز، يتم تنفيذ سمكر على بيانات التصوير رامان من عينة ديليغنيفيد. وتظهر الأطياف المقابلة والصور في الشكل 5 . ويعرض الشكل 6 النتائج التي حققها تحليل يكا والتحليل العنقودي.
الشكل 1: تخطيطي للرامان التصوير للجدار خلية النبات. يتم قياس عينة المقطع العرضي (الحور كمثال) من قبل نظام رامان الصغير الذي الأزواج المجهر الضوئي إلى رامان عالية الدقة مطياف مع جهاز كاشف جنبا إلى جنب (كسد) كاشف. في صورة حقل مشرق، يتم تنظيم جدار الخلية النباتية في الزاوية الخلية (سيسي)، لاميلا الأوسط المركب (سمل)، والجدار الثانوي (سو). تقليديا، يتم إنشاء صورة رامان من قبل ذروة واحدةالتكامل أو الكثافة. وهناك ملوثتان طيفيتان ( أي الانحرافات الأساسية والمسامير الكونية) موجودة في البيانات الأصلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رامان الأطياف قبل ( أ ) وبعد ( ب ) المعالجة المسبقة من قبل أبري. تمت إزالة اثنين من الملوثات الطيفية بنجاح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نموذجي رامان الطيف من جدار الخلية الحور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور رامان من اللجنين ( أ ) والسكاريد ( ب ) داخل جدار الخلية الحور. يتم إنشاء صورة اللجنين من خلال دمج الذروة حوالي 1،600 سم -1 . يتم إنتاج صورة السكاريد من خلال دمج الذروة حول 2،889 سم -1 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور رامان من السليلوز ( أ ) وهيميسيلولوز ( ب ) داخل جدار الخلية الحور. يتم تنفيذ سمكر على بيانات التصوير رامان من عينة محددة. تساهم إزالة اللدغة في التعرض للخصائص الطيفية للسليلوز والهيميسيلولوز. ويتركز السليلوز في الغالب في سو، في حين أن توزيع هيميسيلولوز هو تقريبا موحدة في جميع أنحاء جدار الخلية الحور. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يكا ونتائج التحليل تجميع لتحديد تلقائيا طبقات جدار الخلية المختلفة في جدار الخلية الحور. باستخدام Pكا وتحليل التجميع، وتنقسم الأطياف إلى أربعة أجزاء المقابلة ل تجويف الخلية، سيسي، سمل و سو. ويرد أدناه متوسط أطياف هذه الطبقات. وكشفت النتائج أن اللجنين يتركز على طول سمل وفي سيسي، في حين أن السكريات تتركز في الغالب في سو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وافنومبرز (سم -1 ) | المكونات | تعيينات |
| 1095 | السليلوز، هيميسيلولوز | ذرة ثقيلة سيسي و كو تمتد الاهتزاز |
| 1123 | السليلوز، هيميسيلولوز | ذرة ثقيلة سيسي و كو تمتد الاهتزاز |
| 1163 | السليلوز، هيميسيلولوز </ td> | ذرة ثقيلة سيسي و كو تمتد الاهتزاز بالإضافة إلى هك و هكو الانحناء الاهتزاز |
| 1275 | اللجنين | أريل-O من أريل أوه و أريل O-CH3؛ غاياسيل الدائري مع C = O المجموعة |
| 1331 | اللجنين، السليلوز، هيميسيلولوس | هك و هكو الانحناء الاهتزاز |
| 1378 | السليلوز، هيميسيلولوز | هك، هكو، و هوك الانحناء الاهتزاز |
| 1460 | اللجنين، السليلوز، هيميسيلولوس | هش و هوك الانحناء الاهتزاز |
| 1603 | اللجنين | حلقة أريل تمتد الاهتزاز، اهتزاز متناظرة |
| 1656 | اللجنين | حلقة مترافق C = C تمتد اهتزاز الكونيفريل الكحول. C = O تمتد اهتزاز كونيفيرالدهيد |
| 2889 | C، H | تش و تش 2 تمتد الاهتزاز |
| L، C، H | تش تمتد الاهتزاز في أوش 3 الاهتزاز غير المتماثلة |
الجدول 1: مواقع الذروة رامان والتعيينات الفرقة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جدار الخلية النباتية هو مركب الذي تم تنظيمه في عدة طبقات، بما في ذلك زاوية الخلية (سيسي)، الجدار الثانوي (سو، مع S1، S2، و S3 طبقات)، والمركبة لاميلا المتوسطة (سمل، لاميلا المتوسطة بالإضافة إلى الابتدائي المجاور الجدار)، مما يجعل من الصعب الحصول على سطح مستو أثناء إعداد العينة. وهكذا، عينات النبات، وخاصة العشب، والتي لديها بنية أكثر تعقيدا من الخشب، وغالبا ما تحتاج إلى أن تكون عززت للسماح ل سيكتيونينغ غرامة. بيج هو المصفوفة الصلبة مثالية لقطع وتحقيق رامان، لأنه قابل للذوبان في الماء. ويمكن إزالتها بسهولة عن طريق الشطف بالماء منزوع الأيونات. بيغ تستخدم لتضمين لها الأوزان الجزيئية المختلفة، وتتراوح بين 1،000-20،000. وارتفاع الوزن الجزيئي لل بيج هو، وانخفاض قدرة الاختراق 10 . سوف D 2 O تساعد على الحد من مضان اللجنين ولها ذروة ملحوظ في 2،490 سم -1 ، لكنه لن القضاء على تدخل مضان. اثنانإشارات الضجيج الرئيسية تمتد إلى القنوات، جنبا إلى جنب مع الإشارات الفعلية: 1) عينة ومضان الخلفية، فضلا عن التقلبات الحرارية لل كسد، يمكن أن يؤدي إلى الانجرافات الأساسية و 2) الأشعة الكونية يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ على أجهزة الكشف الحساسة، والتي تظهر في الأطياف كما ضيقة النطاق الترددي المسامير. وقد وضعت طريقة أبري لمعالجة هذه القضايا 11 . يتضمن أبري تكيفية تكرارية تكرارا يعاقب المربعات الصغرى (إيربلز) وتحليل المكون الرئيسي (يكا) للقضاء على الانجرافات الأساسية والمسامير الكونية باستخدام السمات الطيفية أنفسهم.
ولتحقيق صور التوزيع، ينبغي انتقاء كثافة الذروة / التكامل وأطوال الطيف الخطي حسب الأساليب المتعددة المتغيرات. الأول هو مناسبة للمكونات مع قمم رامان محددة (على سبيل المثال، اللجنين)، في حين أن هذا الأخير هو المناسب للمكونات مع التداخل الطيفي القوي (على سبيل المثال، السليلوز وهيميسيلولوز). ديستريصور البصل من اللجنين والسكاريد المتاحة عن طريق دمج قمم محددة حول 1،600 سم -1 و 2،889 سم -1 ، على التوالي (الشكل 4). ومع ذلك، فإن الصور من السليلوز وهيميسيلولوز من الصعب أن تولد مباشرة عن طريق التكامل الذروة بسبب التداخل الطيفي القوي. يسمح التحليل متعدد المتغيرات بتصنيف محتوى المعلومات الملتوية وفقا لفرضية إعادة بناء البيانات الأصلية من عدد محدود من العوامل الهامة 12 . وبالتالي يمكن تطبيقها على التمييز أطيافهم وإنتاج صور رامان المقابلة. لعينات النبات، وجود المستخلصات واللجنين يتداخل مع القدرة على إعادة بناء أطياف السليلوز وهيميسيلولوز. من الضروري إزالة هذه التداخلات قبل تحليل سمكر لبيانات التصوير. تم تقديم سمكر لأول مرة من قبل لوتون و سيلفستر باعتبارها تقنية متعددة المتغيرات وضعت خصيصا لحل عنصر نقي وروم مجموعة من الأطياف، دون أي اللجوء إلى مكتبة الطيفية، لتحليل بيانات التصوير 13 . تصنيف الطيفية مهم لمزيد من فهم الطبيعة الهيكلية والكيميائية للجدار الخلية النباتية. هنا، وقد تعرضت بيانات التصوير لتحليل العنصر الرئيسي (يكا) وتحليل العنقودية للتمييز رامان أطياف من مختلف طبقات جدار الخلية 14 .
ومع ذلك، هذه التقنية لديها اثنين من القيود. أولا، تأثير رامان ضعيفة - مجموع نموذجي رامان نثر المقطع العرضي هو ~ 10 -29 سم 2 لكل جزيء، مما يجعلها عرضة لمضان مكثفة 15 . وهناك طريقة ممكنة لتحسين العيب هو إعداد الأقسام بأقصى قدر ممكن وتطبيق خوارزمية تصحيح خط الأساس، ولكن من الصعب إزالة إشارات الفلورسنت. ثانيا، العلاج الكيميائي هو إجراء كبير عند تحقيق صور رامان من الخليةأولوس وهيميسيلولوز، وأنه قد يزيد من خطر تغيير المحتوى الكيميائي الأصلي. ولذلك، فمن الأفضل لإزالة المستخلصات واللجنين قدر الإمكان، من دون بنية جدار الخلية تبدو مختلفة جدا عن واحد غير المعالجة.
في الختام، هذا البروتوكول هو مناسبة لدراسة توزيع اللجنين، السليلوز، و هيميسيلولوز داخل جدار الخلية النباتية. باستخدام رامان التصوير للحصول على المعلومات المطلوبة تعتمد اعتمادا كبيرا على مهارة المشغل في إعداد العينات وتحليل البيانات. إعداد عينة جيدة أمر ضروري لجمع عالية الجودة أطياف رامان. يوفر تحليل البيانات المناسبة رؤى في أطياف واسعة النطاق ويستخرج المعلومات المخفية من الصورة. كطريقة أساسية، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتعقب التغيرات الديناميكية للمكونات الرئيسية خلال المعالجة الكيميائية أو الفيزيائية أو البيولوجية على المستوى الجزئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر وزارة العلوم والتكنولوجيا الصينية (2016YDF0600803) للحصول على الدعم المالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
