Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य रमन इमेजिंग और मल्टीवीरेट विश्लेषण के उपयोग से संयंत्र सेल की दीवारों में लिग्निन, सेल्यूलोज और हेमिसेलूलोज की कल्पना करने के लिए एक सामान्य विधि पेश करना है।
Abstract
बायोमास संयंत्र को रमन इमेजिंग का प्रयोग बढ़ रहा है क्योंकि यह जलीय समाधानों पर स्थानिक और रचनात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है। विश्लेषण में आमतौर पर व्यापक नमूना तैयार करने की आवश्यकता नहीं होती है; लेबलिंग के बिना संरचनात्मक और रासायनिक जानकारी प्राप्त की जा सकती है। हालांकि, प्रत्येक रमन छवि में हजारों स्पेक्ट्रा होते हैं; यह छिपी जानकारी निकालने में कठिनाइयों को जन्म देती है, खासकर समान रासायनिक ढांचे वाले घटकों के लिए। इस काम से इस मुद्दे को हल करने के लिए एक बहुभिन्नरूपी विश्लेषण का परिचय दिया गया है। प्रोटोकॉल, प्लांट सेल की दीवार के अंदर मुख्य तत्वों की कल्पना करने के लिए सामान्य विधि को स्थापित करता है जिसमें लिग्निन, सेल्यूलोज और हेमिसेल्यूलोज शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में, नमूना तैयार करने, वर्णक्रमीय अधिग्रहण, और डेटा प्रोसेसिंग की प्रक्रियाएं वर्णित हैं। यह नमूना तैयार करने और डेटा विश्लेषण में ऑपरेटर कौशल पर अत्यधिक निर्भर है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, एक रमन जांच को गैर-विशेषज्ञ उपयोगकर्ता द्वारा हिग प्राप्त करने के लिए किया जा सकता हैएच-क्वालिटी डेटा और प्लांट सेल वॉल विश्लेषण के लिए सार्थक परिणाम।
Protocol
1. नमूना तैयार करना
- पौधे के नमूनों से एक छोटा ऊतक ब्लॉक (लगभग 3 मिमी x 3 मिमी x 5 मिमी) कट करें ( जैसे, एक चिनार स्टेम)।
- ऊतक विआयनीकृत पानी में 30 मिनट के लिए विसर्जित करें तुरंत इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर विआयनीकृत पानी में स्थानांतरित करें ऊतक कंटेनर के नीचे तक डूबने तक इस चरण को दोहराएं, यह दर्शाता है कि ऊतक में हवा निकाल दी गई है और ऊतक नरम है।
नोट: इस चरण से पहले नीचे दिए गए नमूनों के लिए, आमतौर पर इस चक्र को 3-5 बार दोहराएं। - विआयनीकृत पानी में पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) के साथ-साथ शुद्ध पीईजी के 20, 50, 70, 90% (वी / वी) अल्कोट्स तैयार करें, और समाधान 65 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- पानी को विस्थापित करने और पीईजी को घुसपैठ करने की अनुमति देने के लिए श्रेणीबद्ध खूंटी स्नान की एक श्रृंखला में ऊतक को सेते हैं।
नोट: आमतौर पर, एडीडिंग के लिए एक आणविक भार 2,000 (पीईजी 2000) के साथ पीईजी का उपयोग किया जाता है- जी के साथ ऊतक की प्रक्रिया करेंनिम्नानुसार सूखने वाली ओवन में खूंटी वाले खूंटी: (ए) 1 घंटे के लिए 20% खूंटी, (बी) 1.5 एच के लिए 50% खूंटी, (सी) 2 घंटे के लिए 70% खूंटी, (घ) 2 घंटे के लिए (डी) 90% पीईजी, और (ई) 10 घंटे के लिए 100% खूंटी
- एक ओवन में 65 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रीसेट गर्म कैसेट कैसेट में ब्लॉक वाले खूंटी को डालें और फिर पूर्व-गर्म चिमटी या सुई का उपयोग करके ऊतक ब्लॉक को वांछित स्थान में रखें।
- धीरे-धीरे कैसेट शांत करें और उपयोग होने तक आरटी पर ऊतक को स्टोर करें।
- एक छोटे से ब्लॉक (लगभग 1 सेमी x 1 सेमी x 2 सेमी) में एक तेज धार वाले ब्लेड का उपयोग करते हुए लक्ष्य ऊतक युक्त पीईजी ब्लॉक काटना करना और उसे माइक्रोोटॉम पर माउंट करना।
- पीईजी ब्लॉक (आम तौर पर 3-10 माइक्रोन) से पतले वर्गों को काटें।
- ऊतक से खूंटी को हटाने के लिए 10 बार एक घड़ी का कांच में विआयनीकृत पानी के साथ अनुभाग को कुल्ला।
- एक्सट्रैक्टिव निकालने के लिए 6 घंटे के लिए टोल्यूनि / एथेनॉल (2: 1, वी / वी) वाले वर्गों को विसर्जित करें। 65 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी, 0.5 एमएल एसिटिक एसिड और 0.6 ग्राम सोडियम क्लो को मिलाकर प्रतिक्रिया तरल तैयार करें।एक बीकर में संस्कार एक 5 एमएल शीशी में एक खंड और प्रतिक्रिया तरल के 3 एमएल जोड़ें। शीशी के शीर्ष पर पेंच
- ऊतक के लिग्निन को हटाने के लिए 2 घंटे के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में शीशी को गरम करें। एक घड़ी के गिलास में विआयनीकृत पानी के साथ 10 गुना अनुभाग को कुल्ला।
- एक गिलास सूक्ष्मदर्शी स्लाइड में अनुपचारित / सुगम अनुभाग को स्थानांतरित करें। ब्रश या सुई का उपयोग करके सावधानी से अनुभाग को खोलना टिशू पेपर के साथ अतिरिक्त विआयनीकृत पानी निकालें।
- डी 2 ओ में अनुभाग को विसर्जित करें। ग्लास आवरण पर्ची के साथ नमूना को कवर करें। डी 2 ओ के वाष्पीकरण को रोकने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची सील करें।
2. स्पेक्ट्रल अधिग्रहण
- कन्फोकल रमन माइक्रोस्कोप के उपकरण ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर को खोलें। लेजर चालू करें (तरंगलांबी = 532 एनएम), क्रिस्टलीय सिलिकॉन की सतह पर 100x माइक्रोस्कोप उद्देश्य पर फ़ोकस करें, और उपकरण को कैलिब्रेट करने के लिए कैलिब्रेशन बटन पर क्लिक करें।
- उपकरण स्विच करेंऑप्टिकल माइक्रोस्कोप मोड में और माइक्रोस्कोप दीपक चालू करें। मंच पर सूक्ष्मदर्शी स्लाइड माउंट, उद्देश्य का सामना करना पड़ कवर पर्ची के साथ।
- एक 20 एक्स माइक्रोस्कोप उद्देश्य के साथ नमूना देखें और ब्याज के क्षेत्र का पता लगाएं। कवर लिप पर विसर्जन तेल लागू करें और विसर्जन माइक्रोस्कोप उद्देश्य (60 एक्स, संख्यात्मक एपर्चर एनए = 1.35) पर स्विच करें। नमूना की सतह पर ध्यान दें।
- उपकरण को रमन परीक्षण मोड में स्विच करें और माइक्रोस्कोप दीपक बंद करें।
- एक आयताकार उपकरण का उपयोग करके मैपिंग क्षेत्र चुनें। प्राप्त स्पेक्ट्रा की संख्या निर्धारित करने के लिए चरण आकार बदलें।
नोट: स्टेप साइज के बारे में अवगत रहें (आमतौर पर उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर द्वारा गणना स्थान व्यास की तुलना में बड़ा; सैद्धांतिक रूप से 1.22 एल / एनए) इस प्रकार के आकार के परिणामस्वरूप ओएससाप्लाइंग हो जाएगा। - एक उपयुक्त अधिग्रहण समय (आमतौर पर <8 घंटे), डेप में सर्वोत्तम संकेत-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) और वर्णक्रमीय गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए इष्टतम वर्णक्रमीय पैरामीटर सेट करेंनमूना उपयुक्तता पर nding। आमतौर पर, उपकरण सॉफ़्टवेयर में इमेजिंग पैरामीटर इनपुट निम्नानुसार है: लेजर (532 एनएम), फिल्टर (100%), छेद (300), भट्ठा (100), स्पेक्ट्रोमीटर (1,840 सेमी -1 ), ग्रूव्स (1200t), उद्देश्य ( 60 एक्स तेल), और अधिग्रहण का समय (2 एस)।
- डेटा प्रसंस्करण से पहले वर्णक्रमीय डेटा को सहेजें और उन्हें एक सार्वभौमिक स्वरूप ( जैसे, TXT फ़ाइलें) में परिवर्तित करें।
3. डेटा विश्लेषण
- डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में वर्णक्रमीय डेटा (TXT फ़ाइलें) लोड करें ( जैसे, मैटलब)। SNR में सुधार करने के लिए डेटा सेट पर शोर-कमी तकनीक लागू करें ( उदाहरण के लिए, सेविज़स्की-गोले एल्गोरिथम या तरंगिका एल्गोरिदम)
- लिग्निन और पॉलीसेकेराइड्स की छवियों का उत्पादन करने के लिए अनुपचारित नमूनों का उपयोग करें। लिग्निन इमेजिंग के लिए, सुगंधित रिंग सममित खींचने वाली कंपन के कारण 1,600 सेमी -1 के आसपास वर्णक्रमीय चोटी पर विचार करें। पॉलीसेकेराइड इमेजिंग (सेल्युलोज और हेमीलेलोूस सहित) के लिए, वर्णक्रमीय चोटी का उपयोग करें aसीएच और सीएच 2 के फैलाव के कारण 2,88 9 सीएम -1 का दौर
- सेल्युलोज और हेमिसेल्यूलोज की छवियों को उत्पन्न करने के लिए डिलीग्रेट किए गए नमूनों का उपयोग करें। स्वयं-मॉडलिंग वक्र रिज़ोल्यूशन (एसएमसीआर) को अधिग्रहित स्पेक्ट्रा पर पेश करने के लिए सेल्यूलोज और हेमीलेलोस के स्पेक्ट्रा को भेदभाव करना और उनके वितरण को चित्रित करना।
- विभिन्न सेल दीवार परतों से रमन स्पेक्ट्रा को भेद करने के लिए अधिग्रहीत डेटा पर मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) और क्लस्टरिंग विश्लेषण करना।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 चित्रा 1 एक संयंत्र सेल दीवार के रमन इमेजिंग के लिए एक विशिष्ट सूक्ष्म रमन प्रणाली का अवलोकन प्रस्तुत करता है। एक उदाहरण के रूप में, चिनार के मूल रमन स्पेक्ट्रा (पॉपुलस निग्रा एल।) में महत्वपूर्ण आधारभूत परत और स्पाइक्स ( चित्रा 2 ए ) हैं। रमन इमेजिंग डेटा सेट (एपीआरआई) के लिए स्वत: पूर्व-प्रसंस्करण विधि को निष्पादित करने के बाद, इन दो वर्णक्रमीय संदूषक सफलतापूर्वक हटा दिए गए हैं ( चित्रा 2 बी )। पॉप्लर का एक ठेठ रमन स्पेक्ट्रम चित्रा 3 में प्रदर्शित होता है, और इसके बैंड के कामकाज तालिका 1 में सूचीबद्ध होते हैं। लिग्निन की रमन की छवि 1,550-1,650 सेमी -1 से वर्णक्रमीय क्षेत्र के एकीकरण से उत्पन्न होती है, जो सुगन्धित रिंग संरचना ( चित्रा 4 ए ) के कारण होती है। चित्रा 4 डी पॉलिसेकेराइड की रमन इमेज दिखाता है, कICH 2,889 सेमी -1 में चोटी को एकीकृत करके प्राप्त किया जाता है। छवि सेल्युलोज और हेमीलेलोोज़ के लिए, एसएमसीआर एक डिग्विनेंटेड नमूने के रमन इमेजिंग डेटा पर किया जाता है। संबंधित स्पेक्ट्रा और चित्र चित्र 5 में दिखाए गए हैं। 6 चित्रा पीसीए और क्लस्टरिंग विश्लेषण द्वारा प्राप्त परिणाम प्रस्तुत करता है।
चित्रा 1: प्लांट सेल वॉल के लिए रमन इमेजिंग का एक योजनाबद्ध। क्रॉस-सेक्शन नमूना (एक उदाहरण के रूप में चिनार) एक सूक्ष्म-रमन प्रणाली द्वारा मापा जाता है, जो एक चार्ज युग्मित डिवाइस (सीसीडी) डिटेक्टर के साथ रमन उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्पेक्ट्रोमीटर को ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप जोड़ता है। उज्ज्वल क्षेत्र की छवि में, प्लांट सेल दीवार को सेल कोने (सीसी), कम्पाउंड मध्य लेमेला (सीएमएल), और द्वितीयक दीवार (एसडब्ल्यू) में व्यवस्थित किया जाता है। पारंपरिक रूप से, एक रमन छवि एकल पीक द्वारा उत्पन्न होती हैएकीकरण या तीव्रता दो वर्णक्रमीय संदूषक ( यानी, बेसलाइन ड्रिफ्ट और कॉस्मिक स्पाइक) मूल आंकड़ों में पाए जाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: रमन स्पेक्ट्रा से पहले ( ए ) और बाद ( बी ) एपीआरआई द्वारा पूर्व प्रसंस्करण। दो वर्णक्रमीय contaminants सफलतापूर्वक हटा रहे हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: चिनार सेल दीवार की एक विशिष्ट रमन स्पेक्ट्रम। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: चिनार सेल दीवार के भीतर लिग्निन ( ए ) और पोलीसेकेराइड ( बी ) के रमन छवियां लिग्निन छवि लगभग 1,600 सेमी -1 के आसपास चोटी को एकीकृत करके उत्पन्न होती है। पॉलिसेकेराइड छवि का उत्पादन लगभग 2,88 9 सेमी -1 के आसपास शिखर को एकीकृत करके किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: पोलार सेल वाल के भीतर सेलूलोज़ ( ए ) और हेमिसेलूलोज़ ( बी ) के रमन चित्र। एसएमसीआर एक डिलाइज्ड नमूने के रमन इमेजिंग डेटा पर किया जाता है। तालमेल सेलूलोज़ और हेमिसेल्यूलोज की वर्णक्रमीय विशेषताओं के जोखिम में योगदान देता है। सेलूलोज़ ज्यादातर एसडब्ल्यू में केंद्रित है, जबकि हेमिसेल्यूलोज का वितरण कुल चिनार सेल की दीवार के बीच लगभग समान है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 6: पॉपलर सेल दीवार में विभिन्न सेल वॉल परतों की पहचान करने के लिए पीसीए और क्लस्टरिंग विश्लेषण परिणाम। पी का उपयोग करकेसीए और क्लस्टरिंग विश्लेषण, स्पेक्ट्रा सेल लुमेन, सीसी, सीएमएल और एसडब्ल्यू के मुताबिक चार भागों में बांटा गया है। इन परतों का औसत स्पेक्ट्रा नीचे दिया गया है परिणाम बताते हैं कि लिग्निन सीएमएल और सीसी में केंद्रित है, जबकि पॉलीसेकेराइड ज्यादातर एसडब्ल्यू में केंद्रित हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
| वेवेनमेंट्स (सीएम -1 ) | अवयव | कार्य |
| 1,095 | सेल्युलोज, हेमिसलेलोस | भारी परमाणु सीसी और सीओ कंपन खींच |
| 1123 | सेल्युलोज, हेमिसलेलोस | भारी परमाणु सीसी और सीओ कंपन खींच |
| 1,163 | सेलूलोज़, हेमिस्टिकलोज </ Td> | भारी परमाणु सीसी और सीओ कंपन से अधिक एचसीसी और एचसीओ झुकने कंपन |
| 1,275 | लिग्निन | एरिल ओएच और एरिल ओ-सीएच 3 के एरिल-ओ; सी = ओ समूह के साथ गौसील अंगूठी |
| 1331 | लिग्निन, सेलूलोज़, हेमीलेकुलोज | एचसीसी और एचसीओ झुकने कंपन |
| 1,378 | सेल्युलोज, हेमिसलेलोस | एचसीसी, एचसीओ, और एचओसी झुकने कंपन |
| 1,460 | लिग्निन, सेलूलोज़, हेमीलेकुलोज | एचसीएच और एचओसी झुकने कंपन |
| 1,603 | लिग्निन | एरील अंगूठी कंपन, सममित कंपन |
| 1,656 | लिग्निन | अंगूठी conjugated सी = सी शंकु शराब की कंपन खींच; सी = ओ कन्फेरहाल्डिहाइड की कंपन को फैलाना |
| 2,889 | सी, एच | सीएच और सीएच 2 कंपन खींच रहा है |
| एल, सी, एच | सीएच ओच 3 असममित कंपन में कंपन खींच रहा है |
तालिका 1: रमन पीक की स्थिति और बैंड असाइनमेंट
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
प्लांट सेल दीवार एक समग्र है जिसे सेल कोने (सीसी), सेकंडरी वॉल (एसडब्ल्यू, एस 1, एस 2, और एस 3 परतों के साथ) में कई परतों में व्यवस्थित किया गया है, और कम्पाउंड मध्य लैम्मेल (सीएमएल, मध्यम लाम्बला प्लस, आसन्न प्राथमिक दीवार), जो नमूना तैयार करने के दौरान एक सपाट सतह को प्राप्त करना मुश्किल बनाता है। इस प्रकार, पौधे के नमूनों, विशेष रूप से घास, जो लकड़ी की तुलना में अधिक जटिल संरचना है, को अक्सर ठीक सेक्शन करने की अनुमति देने के लिए दृढ़ होना चाहिए। पीईजी कटिंग और रमन जांच के लिए एक आदर्श हार्ड मैट्रिक्स है, क्योंकि यह पानी में घुलनशील है विआयनीकृत पानी से धोकर इसे आसानी से हटाया जा सकता है एम्बेडेड के लिए उपयोग किए जा रहे पीईजी में अलग-अलग आणविक वजन हैं, जो 1,000-20,000 से अलग हैं। पीईजी का आणविक वजन अधिक है, प्रवेश क्षमता 10 कम है। डी 2 ओ लिग्निन के प्रतिदीप्ति को कम करने में मदद करेगा और 2,490 सेमी -1 पर एक चिन्हित शिखर होगा, लेकिन यह प्रतिदीप्ति हस्तक्षेप को समाप्त नहीं करेगा। दोवास्तविक संकेतों के साथ-साथ, प्रमुख शोर संकेत चैनलों में फैले हुए हैं: 1) नमूना और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति, साथ ही सीसीडी के थर्मल उतार-चढ़ाव के परिणामस्वरूप बेसलाइन ड्रॉव हो सकते हैं और 2) कॉस्मिक किरण संवेदनशील संवेदनशील डिटेक्टरों को प्रभावित कर सकते हैं, जो इन में प्रकट होते हैं स्पेक्ट्रा के रूप में संकीर्ण-बैंडविड्थ स्पाइक एपीआरआई पद्धति इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए विकसित की गई थी 11 एपीआरआर में वर्णक्रमीय फीचर्स स्वयं का इस्तेमाल करके मूलभूत धाराओं और ब्रह्मांडीय स्पाइक्स को खत्म करने के लिए एपीआरआई में अनुवांशिक पुनरावर्तित दंडित कम से कम वर्गों (एयरपीएलएस) और मुख्य घटक विश्लेषण (पीसीए) शामिल हैं।
वितरण छवियों को हासिल करने के लिए, चोटी की तीव्रता / एकीकरण और मल्टीवीरेट विधियों द्वारा पूरे स्पेक्ट्रा रैखिक फिटिंग का चयन किया जाना चाहिए। पूर्व विशिष्ट रमन चोटियों ( उदाहरण के लिए, लिग्निन) के साथ घटकों के लिए उपयुक्त है, जबकि बाद में मजबूत वर्णक्रमीय ओवरलैप वाले घटकों के लिए उपयुक्त है ( उदाहरण के लिए, सेल्युलोज और हेमीलेलोूस)। वितरणलिग्निन और पॉलीसेकेराइड्स के बटियन छवियां क्रमशः 1600 सेमी -1 और 2,88 9 सेमी -1 के आसपास विशिष्ट चोटियों को एकीकृत करके उपलब्ध हैं (चित्रा 4)। हालांकि, मजबूत वर्णक्रमीय ओवरलैप की वजह से सेलूलोज़ और हेमीलेलोोज़ की छवियों को सीधे पीक एकीकरण द्वारा उत्पन्न करना मुश्किल है। मल्टीवीएट विश्लेषण की सहायता से जटिल डेटा की सामग्री को अवधारणा के आधार पर क्रमबद्ध किया जा सकता है कि मूल डेटा को 12 महत्वपूर्ण कारकों की सीमित संख्या से खंगाला गया है। इस प्रकार उनके स्पेक्ट्रा को भेदभाव करने के लिए लागू किया जा सकता है और इसी तरह रमन चित्रों का निर्माण किया जा सकता है। संयंत्र के नमूनों के लिए, एक्स्ट्रेक्टिव्स और लिग्निन की उपस्थिति सेलूलोज़ और हेमिसेल्यूलोज़ के स्पेक्ट्रा के पुनर्निर्माण की क्षमता के साथ हस्तक्षेप करती है। इमेजिंग डेटा के एसएमसीआर विश्लेषण से पहले इन अंतरणों को दूर करना आवश्यक है। एसएमसीआर को पहली बार लॉटन और सिल्वेस्टर द्वारा पेश किया गया था, जो एक बहुभिन्नरूपी तकनीक के रूप में विशेष रूप से शुद्ध घटक एफ को हल करने के लिए विकसित किया गया थाइमेजिंग डेटा 13 का विश्लेषण करने के लिए, स्पेक्ट्रा का एक सेट, वर्णक्रमीय पुस्तकालय के लिए कोई सहारा के बिना, प्लांट सेल दीवार की संरचनात्मक और रासायनिक प्रकृति को समझने के लिए स्पेक्ट्रल वर्गीकरण महत्वपूर्ण है। यहां, इमेजिंग डेटा को विभिन्न सेल दीवार परतों से रमन स्पेक्ट्रा में अंतर करने के लिए प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और क्लस्टरिंग विश्लेषण के अधीन किया गया है।
हालांकि, इस तकनीक में दो सीमाएं हैं सबसे पहले, रमन का प्रभाव कमजोर है- आम तौर पर कुल रमन छितराया हुआ क्रॉस-सेक्शन ~ 10 -29 सेंटीमीटर 2 प्रति अणु होता है-जो तीव्र प्रतिदीप्ति 15 के लिए कमजोर बनाता है। दोष को सुधारने का एक संभावित तरीका यह है कि अनुभागों को यथासंभव कम से कम तैयारी कर और एक आधारभूत सुधार एल्गोरिदम लागू किया जाए, लेकिन फ्लोरोसेंट संकेतों को हटाने में मुश्किल है। दूसरा, रासायनिक उपचार एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है जब सेल की रमन छवियां प्राप्त करनाउले और हेमिसेललोज़, और यह मूल रासायनिक सामग्री को बदलने का जोखिम बढ़ा सकता है। इसलिए, बिना किसी इलाज के अलग-अलग हिस्सों से सेल दीवार की संरचना के बिना एक्स्ट्रेक्टिव्स और लिग्निन को जितना संभव हो उतना दूर करना सबसे अच्छा है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल पौधों की कोशिका की दीवार के भीतर लिग्निन, सेलूलोज़, और हेमिसेल्यूलोज के वितरण का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। वांछित जानकारी प्राप्त करने के लिए रमन इमेजिंग का उपयोग नमूना तैयार करने और डेटा विश्लेषण में ऑपरेटर कौशल पर निर्भर है। उच्च गुणवत्ता वाले रमन स्पेक्ट्रा को इकट्ठा करने के लिए अच्छी नमूना तैयार करना आवश्यक है उचित डेटा विश्लेषण बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और छवि से छिपी जानकारी निकालता है। मूलभूत विधि के रूप में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग सूक्ष्म-स्तर पर रासायनिक, शारीरिक या जैविक उपचार के दौरान प्रमुख घटकों के गतिशील परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
वित्तीय सहायता के लिए हम चीन विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2016 YDF0600803) का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al.
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
