Summary
Denne protokol har til formål at fremlægge en generel metode til visualisering af lignin, cellulose og hemicellulose i plantecellevægge ved anvendelse af Raman-billeddannelse og multivariatanalyse.
Abstract
Anvendelsen af Raman-billeddannelse til plantebiomasse er stigende, fordi den kan tilbyde rumlige og sammensatte oplysninger om vandige opløsninger. Analysen kræver normalt ikke omfattende prøvepræparation; Strukturelle og kemiske oplysninger kan opnås uden mærkning. Imidlertid indeholder hvert Raman-billede tusindvis af spektre; Dette rejser vanskeligheder ved udtrækning af skjulte oplysninger, især for komponenter med lignende kemiske strukturer. Dette arbejde introducerer en multivariabel analyse for at løse dette problem. Protokollen etablerer en generel metode til visualisering af hovedkomponenterne, herunder lignin, cellulose og hemicellulose inden i plantecellevæggen. I denne protokol beskrives procedurer til prøveudarbejdelse, spektraloptagelse og databehandling. Det er stærkt afhængig af operatør færdigheder ved prøve forberedelse og data analyse. Ved at anvende denne fremgangsmåde kan en Raman-undersøgelse udføres af en ikke-specialist bruger til at erhverve higH-kvalitetsdata og meningsfulde resultater til analyse af plantecellevægge.
Protocol
1. Prøveforberedelse
- Skær en lille vævsblok (ca. 3 mm x 3 mm x 5 mm) fra planteprøven ( f.eks. En poppelstamme).
- Dyp vævet i kogende deioniseret vand i 30 minutter. Overfør straks det til deioniseret vand ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter. Gentag dette trin, indtil vævet synker til bunden af beholderen, hvilket indikerer at luften i vævet er fjernet, og at vævet er blødgjort.
Bemærk: For de prøver, der synker til bunden forud for dette trin, gentages denne cyklus 3-5 gange. - Tilbered 20, 50, 70, 90% (vol / vol) alikvoter af polyethylenglycol (PEG) i deioniseret vand såvel som ren PEG, og hold opløsningerne ved 65 ° C.
- Inkuber vævet i en række sorterede PEG-bad for at fortrænge vandet og lade PEG infiltrere.
Bemærk: Typisk anvendes PEG med en molekylvægt på 2000 (PEG2000) til indlejring.- Behandle vævet med gRaded PEG i en tørreovn som følger: (a) 20% PEG i 1 time, (b) 50% PEG i 1,5 timer, (c) 70% PEG i 2 timer, (d) 90% PEG i 2 timer og (E) 100% PEG i 10 timer.
- Forvarm en kassette ved 65 ° C i en ovn. Hæld PEG'en indeholdende blokken i kassetten, og læg derefter vævsblokken i en ønsket position ved hjælp af forvarmede pincet eller nåle.
- Sæt langsomt ned kassetten og opbevar vævet ved stuetemperatur indtil brug.
- Dissect PEG-blokken indeholdende målvævet i en lille blok (ca. 1 cm x 1 cm x 2 cm) ved hjælp af et skarpt knivblad og monter det på mikrotomen.
- Skær tynde sektioner fra PEG-blokken (typisk 3-10 μm).
- Skyl sektionen med deioniseret vand i et urglas 10 gange for at fjerne PEG fra vævet.
- Sænk sektionerne med toluen / ethanol (2: 1, vol / vol) i 6 timer for at fjerne ekstraktionsstoffer. Forbered reaktionsvæsken ved at blande 65 ml deioniseret vand, 0,5 ml eddikesyre og 0,6 g natriumchlorRite i et bæger. Tilsæt en sektion og 3 ml reaktionsvæske til et 5 ml hætteglas. Skru på toppen af hætteglasset.
- Opvarm hætteglasset i vandbad ved 75 ° C i 2 timer for at fjerne ligninet af vævet. Skyl sektionen med deioniseret vand i et urglas 10 gange.
- Overfør det ubehandlede / delignificerede afsnit til et glasmikroskop dias. Udfold sektionen omhyggeligt ved brug af børster eller nåle. Fjern det ekstra deioniserede vand med vævspapir.
- Dyp sektionen ind i D 2 O. Dæk prøven med et glasdæksel. Tæt dækslet med neglelak for at forhindre fordampning af D 2 O.
2. Spektral erhvervelse
- Åbn instrumentets driftssoftware i det konfokale Raman-mikroskop. Tænd for laseren (bølgelængde = 532 nm), fokus på overfladen af det krystallinske silicium med et 100X mikroskopmål og klik på kalibreringsknappen for at kalibrere instrumentet.
- Skift instrumentetTil optisk mikroskop-tilstand og tænd for mikroskoplampen. Monter mikroskopglaset på scenen, med dækslet hen imod målet.
- Se prøven med et 20X mikroskopmål og lokaliser området. Påfør nedsænkningsolie til dækslip og skift til immersionsmikroskopens mål (60X, numerisk blænde NA = 1,35). Fokus på overfladen af prøven.
- Skift instrumentet til Raman-testfunktionen og sluk for mikroskoplampen.
- Vælg et kortlægningsområde ved hjælp af et rektangulært værktøj. Ændre trinstørrelsen for at bestemme antallet af opnåede spektre.
Bemærk: Vær opmærksom på trinstørrelsen (normalt større end spotdiameteren beregnet ved målets numeriske apertur; teoretisk 1,22λ / NA). Størrelser under dette vil resultere i oversampling. - Indstil de optimale spektrale parametre for at opnå det bedste signal / støjforhold (SNR) og spektralkvalitet i en passende opkøbstid (generelt <8 timer), depeNding på prøve egnethed. Indstil billeddannelsesparametrene i instrumentsoftwaren som følger: laser (532 nm), filter (100%), hul (300), slids (100), spektrometer (1,840 cm -1 ), riller (1200t), mål 60X olie) og opkøbstid (2 s).
- Gem de spektrale data før databehandling og konverter dem til et universalformat ( f.eks. TXT-filer).
3. Data analyse
- Indlæs spektraldata (TXT-filer) i dataanalyseprogrammet ( f.eks. Matlab). Anvend en støjreduktionsteknik på datasættet for at forbedre SNR ( fx Savitzsky-Golay-algoritmen eller wavelet-algoritmen)
- Brug ubehandlede prøver til fremstilling af billeder af lignin og polysaccharider. Ved lignin billeddannelse skal du overveje spektral toppen omkring 1600 cm -1 på grund af den aromatiske ringsymmetriske strækvibration. Til polysaccharid billeddannelse (herunder cellulose og hemicellulose), brug spektral toppen aRunde 2.889 cm -1 på grund af CH og CH2 strækningerne.
- Brug delignified prøver til at generere billeder af cellulose og hemicellulose. Udfør selvmodellerende kurveopløsning (SMCR) på de erhvervede spektre for at diskriminere spektrolerne af cellulose og hemicellulose og for at billedet deres distributioner.
- Udfør hovedkomponentanalyse (PCA) og klyngningsanalyse på de overtagne data for at skelne Raman-spektrene fra forskellige cellevægslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et overblik over et typisk mikro-Raman-system til Raman-billeddannelsen af en plantecellevæg. Som et eksempel har de oprindelige Ramanspektre af poppel ( Populus nigra L.) betydelige baseline drift og pigge ( figur 2a ). Efter at have udført den automatiske forbehandlingsteknik for Raman-billeddatasæt (APRI) fjernes disse to spektrale forureninger med succes ( figur 2b ). Et typisk Raman-spektrum af poppel er vist i figur 3 , og dets bandopgaver er angivet i tabel 1 . Ramanbilledet af lignin genereres ved integrationen af spektralområdet fra 1.550-1.650 cm- 1 , som tilskrives den aromatiske ringstruktur ( Figur 4a ). Figur 4d viser Raman-billedet af polysaccharider, whDet opnås ved at integrere toppen ved 2,889 cm -1 . Til billedcellulose og hemicellulose udføres SMCR på Raman-billeddata fra en delignificeret prøve. De tilsvarende spektre og billeder er vist i figur 5 . Figur 6 viser resultater opnået ved PCA og clustering analyse.
Figur 1: En skematisk af Raman Imaging for plantecellevæggen. Tværsnitprøven (poppel som et eksempel) måles ved hjælp af et mikro-Raman-system, der kobler et optisk mikroskop til et Ramans højopløsnings spektrometer med en CCD-detektor. I lysfeltbilledet er plantecellevæggen organiseret i cellehjørnet (CC), sammensatte midterplader (CML) og sekundærvæg (SW). Konventionelt genereres et Raman billede af single-peakIntegration eller intensitet. To spektrale forurenende stoffer ( dvs. baseline drift og kosmiske spidser) findes i de oprindelige data. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Raman Spectra Før ( a ) og Efter ( b ) Forbehandling af APRI. To spektrale forurenende stoffer fjernes med succes. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et typisk Raman Spektrum af Poplar Cell Wall. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ramanbilleder af Lignin ( a ) og Polysaccharider ( b ) i Poplar Cell Wall. Ligninbilledet genereres ved at integrere toppen omkring 1600 cm -1 . Polysaccharidbilledet fremstilles ved at integrere toppen omkring 2,889 cm -1 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Ramanbilleder af cellulose ( a ) og hemicellulose ( b ) i populærcellevæggen. SMCR udføres på Raman-billeddata fra en delignificeret prøve. Delignifikation bidrager til eksponeringen af spektralegenskaber af cellulose og hemicellulose. Cellulose er hovedsagelig koncentreret i SW, mens fordeling af hemicellulose er næsten ensartet i hele poppercellevæggen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Resultater af PCA og Clustering Analyse til automatisk Identifikation af forskellige Cell Wall Layers i Poplar Cell Wall. Ved at bruge PCA og clustering analyse, spektrene er opdelt i fire dele svarende til cellelumen, CC, CML og SW. De gennemsnitlige spektre af disse lag er angivet nedenfor. Resultaterne viste, at lignin er koncentreret langs CML og CC, mens polysacchariderne hovedsageligt er koncentreret i SW. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Wavenumbers (cm -1 ) | komponenter | Afleveringer |
| 1095 | Cellulose, hemicellulose | Tungt atom CC og CO strækker vibrationer |
| 1.123 | Cellulose, hemicellulose | Tungt atom CC og CO strækker vibrationer |
| 1163 | Cellulose, hemicellulose </ Td> | Tunge atom CC og CO strækker vibrationer plus HCC og HCO bøjningsvibrationer |
| 1.275 | lignin | Aryl-O af aryl OH og aryl-O-CH3; Guaiacylring med C = O-gruppe |
| 1.331 | Lignin, cellulose, hemicellulose | HCC og HCO bøjningsvibrationer |
| 1.378 | Cellulose, hemicellulose | HCC, HCO og HOC bøjningsvibrationer |
| 1.460 | Lignin, cellulose, hemicellulose | HCH og HOC bøjning vibrationer |
| 1.603 | lignin | Aryring strækker vibrationer, symmetrisk vibration |
| 1656 | lignin | Ringkonjugeret C = C strækningsvibration af coniferylalkohol; C = O strækker vibrationer af coniferaldehyd |
| 2889 | C, H | CH og CH 2 strækker vibrationer |
| L, C, H | CH strækker vibrationer i OCH 3 asymmetrisk vibration |
Tabel 1: Raman Peak-positioner og båndopgaver
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Planten cellevæg er en sammensætning, der er organiseret i flere lag, herunder cellehjørne (CC), sekundærvæg (SW, med S1, S2 og S3 lag), og sammensatte midter lameller (CML, midter lamell plus tilstødende primær Væg), hvilket gør det vanskeligt at opnå en flad overflade under prøvefremstilling. Således skal planteprøver, især græs, som har en mere kompliceret struktur end træ, ofte størkne for at muliggøre fint snitning. PEG er en ideel hård matrix til skæring og Raman undersøgelse, da den er opløselig i vand. Det kan let fjernes ved skylning med deioniseret vand. PEG anvendt til indlejring har forskellige molekylvægte, varierende fra 1.000 til 20.000. Jo højere molekylvægten af PEG er, jo lavere er penetrationsevnen 10 . D 2 O vil bidrage til at reducere fluorescensen af lignin og har en markeret top ved 2.490 cm -1 , men det vil ikke eliminere fluorescensinterferensen. ToStørre støj signaler spredes over i kanalerne sammen med de faktiske signaler: 1) prøve- og baggrundsfluorescens samt termiske udsving i CCD kan resultere i baseline drift og 2) kosmiske stråler kan markant påvirke de følsomme detektorer, hvilket manifesterer sig i Spektre som smalle båndbredder. APRI-metoden blev udviklet for at løse disse problemer 11 . APRI indbefatter de adaptive iterativt reweighted penalized least squares (airPLS) og hovedkomponentanalysen (PCA) for at eliminere basislinjedriften og kosmiske spidser ved at bruge de spektrale egenskaber selv.
For at opnå distributionsbilleder skal der vælges topintensitet / integration og helspektre lineær montering ved multivariate metoder. Den førstnævnte er egnet til komponenterne med specifikke ramantoppe ( f.eks. Lignin), mens sidstnævnte er passende for komponenterne med stærk spektral overlapning ( f.eks. Cellulose og hemicellulose). DistriButionbilleder af lignin og polysaccharider er tilgængelige ved at integrere de specifikke toppe omkring henholdsvis 1600 cm -1 og 2,889 cm -1 (figur 4). Imidlertid er billederne af cellulose og hemicellulose vanskelige at generere direkte ved maksimal integration på grund af den stærke spektrale overlapning. Multivariat analyse gør det muligt at sortere det sammenfaldne informationsindhold i henhold til den hypotese, at de oprindelige data rekonstrueres fra et begrænset antal væsentlige faktorer 12 . Det kan således anvendes til at diskriminere deres spektre og at producere tilsvarende Raman-billeder. Til planteprøver interfererer tilstedeværelsen af ekstrakter og lignin med evnen til at rekonstruere spektrene af cellulose og hemicellulose. Det er nødvendigt at fjerne disse interferenser forud for SMCR analysen af billeddannelsesdataene. SMCR blev først introduceret af Lawton og Sylvester som en multivariativ teknik, der er udviklet specifikt til løsning af en ren komponent fRom et sæt spektre uden at anvende et spektralbibliotek til at analysere billeddannelsesdataene 13 . Spektral klassificering er vigtig for yderligere at forstå den strukturelle og kemiske natur af plantecellevæggen. Her er billeddannelsesdataene blevet udsat for hovedkomponentanalyse (PCA) og klyngningsanalyse for at skelne Raman-spektre fra forskellige cellevægslag 14 .
Denne teknik har imidlertid to begrænsninger. For det første er Raman-effekten svag. Det typiske samlede Raman-sprednings-tværsnit er ~ 10-29 cm2 pr. Molekyle, hvilket gør det sårbart over for intens fluorescens 15 . En mulig måde at forbedre defekten på er at forberede sektionerne så tyndt som muligt og anvende en baseline korrektion algoritme, men fluorescerende signaler er vanskelige at fjerne. For det andet er kemisk behandling en vigtig procedure, når man opnår Raman-billeder af cellenUlose og hemicellulose, og det kan øge risikoen for at ændre det oprindelige kemiske indhold. Derfor er det bedst at fjerne ekstraktionsstoffer og lignin så meget som muligt, uden at cellevægsstrukturen ser for forskellig ud fra den ubehandlede.
Som konklusion er denne protokol egnet til at studere fordelingen af lignin, cellulose og hemicellulose inden i plantecellevæggen. Brug af Raman-billeddannelse til opnåelse af den ønskede information er stærkt afhængig af operatorens dygtighed ved prøvefremstilling og dataanalyse. God prøveudarbejdelse er afgørende for at indsamle højkvalitetsraman-spektre. En passende dataanalyse giver indsigt i de store spektre og uddrag de skjulte oplysninger fra billedet. Som en grundlæggende metode kan denne protokol bruges til at spore de dynamiske ændringer af hovedkomponenter under kemisk, fysisk eller biologisk behandling på mikroniveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Kina Ministeriet for Videnskab og Teknologi (2016YDF0600803) for den økonomiske støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Thermo Scientific | Microm HM430 | |
| Confocal Raman microscope | Horiba Jobin Yvon | Xplora | |
| Oven | Shanghai ZHICHENG | ZXFD-A5040 |
References
- Gonzalo, G. D., et al. Bacterial Enzymes Involved in Lignin Degradation. J. Biotechnol. 236, 110-119 (2016).
- Rosatella, A. A., Afonso, C. A. M. Chapter 2. Ionic Liquids in the Biorefinery Concept: Challenges and Perspectives. , Wiley. 38-64 (2016).
- Sun, L., et al. Understanding tissue specific compositions of bioenergy feedstocks Through hyperspectral Raman imaging. Bio. 108 (2), 286-295 (2009).
- Tolstik, T., et al. Classification and prediction of HCC tissues by Raman imaging with identification of fatty acids as potential lipid biomarkers. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 141 (3), 407-418 (2015).
- Schrader, B. Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. , John Wiley and Sons. (2008).
- Gierlinger, N., et al. Imaging of plant cell walls by confocal Raman microscopy. Nat. Protoc. 7 (9), 1694-1708 (2012).
- Luca, A. C. D., et al. Online fluorescence suppression in modulated Raman spectroscopy. Anal. Chem. 82 (2), 738-745 (2009).
- Schlücker, S., et al. Raman microspectroscopy: a comparison of point, line, and wide-field imaging methodologies. Anal. Chem. 75 (16), 4312-4318 (2003).
- Cooper, J. B. Chemometric analysis of Raman spectroscopic data for process control applications. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 46 (2), 231-247 (1999).
- Cheng, H. J., Hsiau, S. S. The study of granular agglomeration mechanism. Powder Technol. 199 (3), 272-283 (2010).
- Zhang, X., et al. Method for removing spectral contaminants to improve analysis of Raman imaging data. Sci. Rep. 6, 39891 (2016).
- Shinzawa, H., et al. Multivariate data analysis for Raman spectroscopic imaging. J. Raman Spectrosc. 40 (12), 1720-1725 (2009).
- Lawton, W. H., Sylvestre, E. A. Self modeling curve resolution. Technometrics. 13, 617-633 (1971).
- Zhang, X., et al. Method for automatically identifying spectra of different wood cell wall layers in Raman imaging data set. Anal. Chem. 87 (2), 1344-1350 (2015).
- Kudelski, A. Analytical application of Raman spectroscopy. Talanta. 76 (1), 1-8 (2008).
