Summary
모 세관 기반 immunoassay 상용 플랫폼을 사용 하 여 총 단백질 준비에서 대상 단백질을 측정 하는 보여 줍니다. 또한, 노출 시간, 단백질 농도, 및 항 체 희석의 분석 결과 매개 변수 셀 문화 모델 시스템 최적화 되어 있다.
Abstract
모 세관 기반 immunoassays 활용 하는 새로운 기술이 전통적인 immunoassays에 비해 빠르고 더 정량적 단백질 평가 약속. 그러나, 유사한 다른 항 체 기반 단백질 분석 실험, 단백질 농도, 항 체 희석, 노출 시간 등의 모 세관 기반 immunoassay 매개 변수의 최적화는 의미 있고 신뢰할 수 있는 생성에 중요 한 전제 조건 데이터입니다. 측정 신호에 변화는 변화 lysate 농도에 직접 비례 분석 결과의 선형 범위 내에서을 해야 합니다. BEAS-2B, 인간 기관지 상피 세포 라인에 적절 한 lysate 농도, 항 체 희석, 및 노출 시간을 선택 하는 과정은 여기에 설명 했다. 분석 결과 선형성 p53 및 α-tubulin 항 체와 전체 셀 추출 단백질 농도의 범위 표시 됩니다. 긴 노출 시간, 최고 농도에서 볼 신호 소진의 예 고는 α-tubulin 항 체 희석 곡선 채도 보여주는 표시 됩니다. 또한, 실험 결과 예 최적화 된 매개 변수를 사용 하 여 독 소 루비 치료 셀에 대 한 보고 됩니다.
Introduction
모 세관 전기 이동 immunoassays 크기 또는 충전 분리 시스템을 사용 하 여 세포 lysates의 단백질 발현을 측정 하 고 전통적인 immunoassays 이상의 몇 가지 장점을 제공. 예를 들어 자동화 된 모 세관 기반 프로시저 젤, 전송 장치, 필요 없다 서쪽 오 점에 비해, 그리고 수동 세척. 또한, 필요한 단백질의 절대 금액은 약 10 배, 모 세관 기반 시스템 희귀 세포 유형 또는 제한 된 샘플1,2와 함께 사용 하기 위해 이상적. 결과 자동화 된 시스템을 사용 하 여 3 h 만큼 적게 하 고 이전 보다 양적 하 고 기존의 서양 보다 재현할 수 입증 되었습니다 절차3,,45오 점. 크기 기반 분석에 대 한 프로세스 및 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), dithiothreitol (DTT)를 포함 하는 샘플을 로드 이루어져 붙일 분리 및 매트릭스를 포함 하는 모 세관 컬럼으로 분자량 마커를 표시. 모세 혈관에 적용 하는 전압 크기, 견본에서 단백질 분리 그리고 자외선 움직이게 모 세관 벽에 분리 된 단백질. 모 세관은 다음 특정 대상 1 차 항 체와 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 면역 조사-활용 된 이차 항 체. Luminol 그리고 과산화 수소 촉매 충전 결합된 장치 (CCD) 카메라에 의해 측정 하 고 단백질을 quantitate 분석 chemiluminescent 가벼운 발생.
단백질 농도, 항 체 희석, 노출 시간 등 분석 결과 조건의 최적화 상대적 용이성 및 자동화 된 모 세관 기반 전기 이동 immunoassay 플랫폼의 속도도 불구 하 고 정확 하 고 재현성을 얻기 위해 중요 하다 결과입니다. 일반적으로, 이러한 시스템에 대 한 분석 결과 최적화 하기 위해 다음 절차를 수행 합니다.
화면 1)을 평가 하 고 신호 및 특이성 단백질 대상에 대 한 항 체를 선택 수행 되어야 한다. 가능한 경우, 순화 된 단백질 또는 대상 epitope 특이성;을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 아직도 모델 시스템에서 공급 하는 총 단백질의 잠재적인 일반적인 신호 들을 평가 하는 것이 중요입니다.
2) 다음, 분석 결과의 동적 범위는 결정 될 필요가 있다. 이상적인 상황에서 신호 배로 (피크 영역을 사용 하 여 측정)는 관찰 샘플 농도 두배로 된다; 그러나, 실제로, 예측 가능한 방식으로 (예를 들어, 선형 적합) 입력 신호에 비례 변화는 단백질 정량화에 대 한 충분 한. 또한,이 최적화는 단백질 농도 높은 신호 하지만 여전히 실험 모델에 대 한 선형 범위 내에서 정의 합니다.
3) 최적화 단계 2에서에서 선택한 고정된 단백질 농도 사용 하 여 최적의 항 체 농도 결정 합니다. 항 체 농도 증가, 신호 채도에서 정점까지 증가 한다. 이 채도 레벨 항 체 농도 단백질 농도의 정확한 측정을 위해 필요 합니다.
단백질 농도, 항 체 희석, 및 자동화 된 모 세관 기반 크기 분석 결과6 에 대 한 노출 시간을 최적화 하는 데 사용 하는 프로세스는 전체 셀 추출 BEAS-2B의 기관지는 SV 40 변형 인간에서 격리를 사용 하 여 보여 줍니다. 상피 세포 라인입니다. 셀 또는 조직 추출에서 단백질 격리 게시 프로토콜7,,89 의 숫자를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 여기 적용 되지 않습니다. 최적화 된 조건을 사용 하 여 시험 실험의 결과 또한 총에 대 한 보고 및 phosphorylated 1.2, 독 소 루비 (일반적인 화학요법 에이전트 유도 세포 apoptosis10)에 노출 하는 문화에서 (15, 20 떠들고 떠들고) p53 1.8, 그리고 2.4 µ g/mL 미디어 수확 전에 h 4에 대 한. P53 피크 넓이에 ɑ-tubulin, 로드 제어로 사용 되는 정규화 됩니다.
Protocol
참고: 모든 시 약 및 샘플 제조 업체에 따라 준비가 확인 ' s 프로토콜을 아래에 설명 된. 이 절차 동안, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 폐쇄 터진 신발, 및 안전 고글 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하십시오. 특정 재료, 시 약 및 장비 필요한 테이블은 별도로 제공 됩니다. Bradford 분석 결과 11와 같은 사용 하 고, lysate 버퍼와 호환 되는 설립된 방법론을 사용 하 여 미리 샘플의 총 단백질 농도 결정 한다.
1. 샘플 및 시 약으로 제조 업체에 의해 제공 된 표준 팩에서의 준비
- dithiothreitol (DTT)의 400 m m 작업 솔루션을 준비, 추가 40 µ L 이온된 물 맑은 튜브를 포함 하는 제조업체에서 제공합니다. 솔루션을 소개 하 고 느리고 부드러운 pipetting으로 솔루션을 혼합 하 여 거품을 방지 하는 것이 중요 하다.
- 추가 20 µ L 10 배 샘플 버퍼와 분홍색 튜브 형광 5 X를 포함 하는 준비 된 400 m m DTT 솔루션의 20 µ L 믹스 마스터 (재료의 표 참조).
참고: 마스터 믹스 (MM) 포 일 덮개와 제조 업체에 의해 밀봉 하 고 피 펫 팁으로는 피어 싱 해야 합니다. DTT는 피 펫에 splashing 피하기 위해 느린 pipetting으로 부드럽게 혼합. - 그런 다음 16 µ L 이온된 물 추가, 2 µ L의 샘플 버퍼, 그리고 제조업체에서 제공 하는 백색 biotinylated 사다리 튜브를 준비 400mm DTT 솔루션의 2 µ L X 10 제공. 부드럽게 혼합 하 고 변성 시키기 위한 0.6 mL 튜브로 전송.
- 준비 0.1 샘플 버퍼 제공 된 10 물으로 솔루션 1: 100 배 희석 하 여 x. 모든 샘플을 희석 샘플 버퍼 x 0.1 충분 한 준비.
- 총 단백질의 최종 원하는 농도에 따라 달라 집니다 샘플에 추가 되는 0.1 x 샘플 버퍼의 양을 계산 합니다. 믹스 1 5 부 형광 m M x 4 부분과 원하는 최종 단백질 농도 달성 하기 위해 샘플을 희석.
다음과 같이
- 계산 볼륨: (i) 형광 m M x 볼륨 5 (Desired 최종 단백질 농도) = / 5; (ii) 단백질의 양 = (총 볼륨 필요한 x 원하는 최종 단백질 농도) / 단백질 농도; 주가 (iii) 볼륨 0.1 샘플 버퍼 x 총 볼륨-5 m M 볼륨 x-단백질 재고량 =.
2. 샘플 및 사다리의 변성
- 장소 준비 샘플 및 biotinylated 사다리, 부 화 직후 5 분 소용돌이 튜브 95 ° C 열 블록에 실행 ~ 5 회전 탁상 원심 분리기 및 얼음에 있는 s
참고: 일부 단백질 단백질 집단을 방지 하 고 모 세관 매트릭스에서 마이그레이션 향상을 gentler 변성 조건 (예를 들어, 70 o C 10 분)를 요구할 수 있습니다. 경우 높은 분자 무게 무거운 번짐 (예를 들어 비디오 참조)이이 옵션을 고려 하십시오.
3. 항 체의 준비
- 최적화 정한 (대표 결과 비디오 참조), 제공된 항 체에서 1 차적인 항 체 (예, 1:50, 1: 100)의 원하는 dilution(s)을 준비 희석제 2.
참고: 항 체는 일반적으로 사용 높은 농도에서 모 세관 기반 immunoassay 보다 전통적인 서 부 럽 대. 제공 된 이차 항 체는 희석 하지 않고 사용 가능.
4. Luminol S 및 과산화 수소 준비
- luminol S와 과산화 수소의 1:1 혼합물 준비.
- 혼합 하 고 얼음에 저장 소용돌이
참고:이 혼합물 각 실험 분석 결과 대 한 신선한 준비는 중요 하다.입니다. 250ul 총 믹스 전체 접시를 실행 하는 데 필요한.
5. 분석 결과 접시의 준비
- 그림 1에서 같이 로드 샘플 및 시험 접시에 위의 준비 시 약. 각 행에 대 한 자세한 내용은 아래를 참조 하십시오. 우물에서 증발을 최소화 하기 위해 접시 뚜껑 시 추가 사이 대체 됩니다 확인 하십시오.
- 행 A, Biotinylated 사다리의 피펫으로 5 µ L 잘 a 1에. 나머지 행에 대해 피펫으로 우물 A2-A25에 샘플 (5 µ L 각)을 준비.
참고: 그것은 필수적입니다는 A1 잘 항상 사다리, 포함 카트리지에서 첫 번째 모 세관이이 표준 실행을 위한 최적화 된. - 행 B, 각 잘 (B1-B25)에 항 체 희석제 2 피펫으로 10 µ L.
- 행 C, 항 체 희석제 2 피펫으로 10 µ L 잘 c 1에에. 나머지 행에 C 우물, 1 차적인 항 체 (C2-C25 우물)의 피펫으로 10 µ L.
- 잘 d 1에 D, 피펫으로 10 µ L Streptavidin HRP의 행에서. 나머지 행에 D 우물, 이차 항 체 (웰 스 D2-D25)의 피펫으로 10 µ L.
- 행 E, 각 잘 (E1-E25)에 갓된 luminol 과산화 수소 혼합의 피펫으로 10 µ L.
- 마지막으로 추가 구획 당 500 µ L 워시 버퍼 버퍼 우물의 상위 3 행의 각.
참고: 그것은 부드럽게 pipetting 고 거품 로드 모 세관을 방해할 수 있습니다로 실행 하지 팁에서 최종 볼륨을 추방 하 여 거품 형성을 최소화 하는 것이 중요. - 모든 웰 스는 로드 되 면, 거품을 제거 하 고 우물의 바닥에 액체가 하 실 온에서 5 분 ~ 1000 x g에서 격판덮개 원심. 작은 피 펫 팁 또는 깨끗 한 바늘 표시 모든 거품을 팝업 (예를 들어, 25 게이지 무 균 " 담당자 상단 " 바늘).
그림 1 . 분석 결과 접시 pipetting 서식 파일. 컬러 코딩 적절 한 시 약 및 샘플 (최대 24 총) 분석 결과 판에 추가 된 나타냅니다. A25까지 A2 우물에서 샘플 준비 잘 A1 (오렌지)에 biotinylated 사다리를 추가 (라이트 블루), 항 체 희석제 2 웰 스 B25 B1 및 C1 (밝은 녹색), 웰 스 C2 (blue) C25, streptavidin HRP 잘 D1 최대에 1 차적인 항 체 (다크 핑크), 이차 항 체에 D25까지 D2 우물 (짙은 녹색), 그리고 웰 스 E1 E25 (보라색)까지 luminol 과산화 수소 혼합. 워시 버퍼 큰 중간 접시의 처음 세 행에 추가 우물 (진한 파란색). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
6. 모 세관 immunoassay 악기를 시작
- 악기와 함께 컴퓨터에 설정 되어 있는지 확인. 아무 워밍업 시간이 필요 하다.
- 는 컴퓨터에 계측 소프트웨어를 엽니다. 먼저, 선택은 " 분석 결과 " 윈도우의 오른쪽에 탭 및 " 새로운 분석 결과 " 아래는 " 파일 메뉴 " 왼쪽에. 크기, 크기 범위 (예를 들어, 12-230 kDa), 및 카트리지 선택 특정 분석 결과에 사용 된 형식 (예를 들어, 25 모 세관).
참고: 한 5 월도 입력 분석 결과 매개 변수를 원하는 경우 단백질 농도, 항 체 종류와 희석를 포함 하 여, 하지만 이러한 분석 결과 시작할 필요가 없습니다. - 오렌지 패널 위에 버튼을 누르면 악기에 문을 열고.
- 신중 하 게 포장에서 모 세관 카트리지를 제거합니다. 유리 모 세관을 건드리지 않고, 카트리지 홀더에 카트리지를 놓습니다. 카트리지 좌석 실내 빛 파랑 오렌지에서 변화를 관찰 하 여 확인 합니다.
- 벤치에 단단히 접시를 보유 하 고 신중 하 게는 플레이트의 하단 부분에서 증발 인감을 벗기다. sm으로 이러한 분리 매트릭스 우물에서 모든 거품을 팝업모든 피펫으로 팁 또는 깨끗 한 바늘 (예를 들어, 25 게이지 무 균 " 담당자 상단 " 바늘).
- 분석 결과 접시 접시 홀더, 완전히 장착 보장에 놓고 악기 문 닫습니다.
- 클릭 합니다 " 시작 " 소프트웨어에 단추.
참고: 없음 시작 단추가 나타나면, 악기와 연결이 손실 되었습니다. 왼쪽된 상단 메뉴에서 도구를 선택한 다음 연결. 악기의 시리얼 번호로; 팝업 표시 이 선택한 다음 연결을 클릭 합니다. 시작 단추를 이제 나타납니다. - 실행 완료 되 면 삭제 접시. 카트리지를 제거 하 고 폐기, 팝업 거품을 사용 되었을 수 있는 모든 바늘 함께 sharps 용기에 배치. 악기를 정기적으로 사용 하는 경우 연결 문제를 방지 하려면에 힘을 두고 (예를 들어, 적어도 매주).
7. 분석 실험
- 분석 하기 전에 다음과 같은 품질 검사를 수행 하는 것을 확인.
- 선택 하 여 확인 형광 표준
- 는 " 표시 표준 " 아이콘. 기준에서 올바르게 식별 된 체크는 " 그래프 보기 " 탭. 그들은 올바르지 않은 경우에 서는 " 단일 보기 " 아이콘을 정확한 피크를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 " 힘 표준 ", 또는 잘못 된 피크를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 " 하지 표준 ". 각 새로운 모 세관이이 검사 수행.
- 확인 클릭 하 여 biotinylated 사다리는 " 샘플 " 및 " 단일 보기 " 아이콘. 실험 탭에서 사다리를 선택 합니다. 피크는 잘못 식별 된 경우에 그것에 오른쪽 클릭 " 그래프 보기 " 선택 " 제거 피크 ".
참고: 예를 들어 biotinylated 사다리 12-230 kDa 키트 사용 한다 표시 12, 40, 66, 116, 180, 및 230 kDa 크기 봉우리. 이 단계는 수행 하지 경우 샘플 봉우리의 크기 조정 것입니다 제대로 계산 하지, 가짜 결과 생산. - 보기 샘플 봉우리를 분석. 실험적인 계산에 필요에 따라 분자량, 피크 면적, 피크 높이 및 신호 잡음 (S/N)를 포함 하 여 봉우리 테이블에서 데이터를 파생.
Representative Results
노출 시간 - 결정 신호 났
신호 났을 때 luminol 및 과산화 기판 너무 빨리 소진 되 면 발생할 수 있습니다. 이 다른 화학 노출 시간에 데이터를 검토 하 여 확인할 수 있습니다. 분석 소프트웨어에서 "편집-> 분석-> 이미지"로 이동 합니다. 노출 범위는 5에서 480 s. 그래서 각 노출에서 데이터 있어야 비슷한 신호/시간 계수는 electropherogram에 y 축 신호/시간, 보고 합니다. 이 계수 감소 순차적으로 더 이상 노출 경우에 luminol 고갈 된다 p53 할-1 항 체 (그림 2)에서 볼 수 있듯이. 기판 고갈 때문이 분석 결과 여겨질 수 있다 5-30의 노출에만 0.2 µ µ g/L 농도까지 측정. 따라서,이 예에서 15 s p53에 대 한 최적의 데이터 분석 노출 시간을 결정 했다.
Lysate 적정 - 선형 동적 범위를 결정
최대 영역에 의해 측정 된 신호에 변화는 샘플에서 단백질의 양을 변화에 비례 각 분석 결과의 선형 동적 범위 내 측정 촬영는 중요 하다. 15 s의 최적의 노출 시간을 사용 하 여 이전 섹션에서 분석 결과 선형성 농도 (그림 3)의 15 범위 보다 큰 이상의 p53 및 ɑ tubulin 설명 된다. 우리의 경험에서는, R2 값 > 적합 선형 회귀의 0.9 간주 됩니다 알려진 (해당 되는 경우 분석 결과 절대 양적 측정) 또는 샘플의 순화 된 단백질의 희석 범위에 대 한 허용 알 수 없는 대상 단백질의 lysate (경우 분석 결과 상대 정량 측정이 이다).
항 체 희석의 최적화
포화 농도에서 항 체를 사용 하 여 사용 하면 측정 신호 변경만 단백질에 변화 예정 이다. 데모, 두 BEAS 2B 셀 라인 (0.2 µ g / µ L 총 단백질 분석 결과에 로드)를 추출 하는 전체 셀 직렬 희석된 ɑ tubulin 항 체 농도가 1:25-1:800 (그림 4)까지 조사 했다. Chemiluminescent 신호 (여기, 피크 영역으로 측정 되는) 항 체 희석에 대 한 표시 했다. 채도 1시 50분 가까이 관찰 되었다 희석 곡선에서 눈에 띄는 고원을 시작 하는 위치.
실험적인 예 심-독 소 루비 치료 BEAS 2B 셀에
최적화 된 분석 결과 조건을 사용 하 여, BEAS 2B 세포 배양 독 소 루비의 3 개의 다른 농도와 대우 되었다 (1.2, 1.8, 2.4 µ g/mL) 4 h (그림 5, 표 1). 활성화 포스트 번역 상 수정 p53의 세포 주기 검거, 노화, 및 apoptosis12를 포함 하 여 여러 가지 세포 응답 중재. 특히, 떠들고 15의 인 산화는 독 소 루비 치료13후 apoptosis 결과 p53의 transcriptional 활성화에 기인 했다. 이 데모에서는 ɑ tubulin 정규화 피크 영역 컨트롤의 겹으로 제공 됩니다. 흥미롭게도, 3.5 떠들고에서 p53 인 산화 4-fold 증가 15 2-fold 떠들고 20에 phosphorylated p53의 수준 증가 독 소 루비에 4 h 노출 후 관찰 되었다. 이러한 결과 p53;의 활성화를 나타냅니다. 그러나, 아무 복용량 응답 선택 농도 대 한 볼 수 있다 (반대로, 가장 낮은 복용량 테스트 elicited 가장 높은 응답). 총 p53이 모델 시스템에서 명확한 치료 응답을 설명 하지 않았다. 우리는 이전 BEAS 2B 셀 아연 처리14비슷한 조건에서 총 p53의 증가 수준의 부재에서 p53 인 산화의 활성화를 관찰.
그림 2 . 검출 신호 소진 노출 이미지 비교. 레인 플레이 쇼 1: 500 희석에서 p53 할-1 항 체와 조사 BEAS 2B lysates의 단백질 농도 감소. 화학 신호 계수, 피크 높이 악기 소프트웨어에서으로 보고 겹쳐 있다. 피크 높이 달리 비주얼 밴드 농도 자동으로 생성 하 고 밴드와는 다른 하나의 패널에서 하지 비교의 원조 악기에 의해 조정. 신호와 사라질 시작 (분할 피크) 기판 소모를 나타내는 두 개의 긴 노출에 노출 시간이 증가할수록 감소 화학 신호에 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 레인 플레이 보여주는 lysate 적정. 차선을 보여주는 lysate 적정 플레이 BEAS-2B 1: 500 p53 할-1 또는 1시 50분 ɑ-tubulin와 조사 때 lysate의 (A) . 피크 면적 값과는 달리 비주얼 밴드 농도 자동으로 생성 하 고 밴드와는 다른 하나의 패널에서 하지 비교의 원조 악기에 의해 조정. 선형 회귀 분석 (B)는 분석 실험은 각각 0.20 µ g / µ L를 0.025 0.40 µ g / µ L, R2 의 값 0.999 및 0.985, 0.01에서 테스트 하는 전체 범위 선형 확인 합니다. 선형 범위 가운데 총 단백질 농도 (예를 들어, α-tubulin 위한 µ 0.2 µ g/L)에서 잠재적인 대상 단백질 변이 수용 하기 위해 선정 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 두 개의 별도 BEAS 2B 단백질 lysates 기준선 정규화 없이 대 한 α-tubulin 항 체 희석 곡선. 명확한 depar선형성에서 진짜 야 1:50 (0.02)에서 본 희석, 채도 나타내는. 1시 50분 그러므로이 항 체에 대 한 최적의 희석으로 선택 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5. 총에 떠들고 4 h 독 소 루비 (DXN) 치료의 효과 phosphorylated BEAS 2B 세포의 p53 단백질 표정. 피크 넓이 α-tubulin 정규화 되며 제어 (CTL)의 겹으로 꾸몄다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1입니다. 총에 떠들고 4 h 독 소 루비 (DXN) 치료의 효과 phosphorylated BEAS 2B 세포의 p53 단백질 표정. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
수십 년 동안, 계속 있다 모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 방법의 개발에 지속적인된 관심 비용 때문에 낮은 샘플 및 시 약, 감소 처리 전통적인 방법에 비해 시간과 높은 호환성 절차4,15를 자동화 합니다. 모 세관 전기 이동, electrokinetic, 폴리머 체질, 및 (각각 다른 속성에 의해 단백질 분리, 전자 방법 등을 활용 하는 단백질의 분리에 대 한 서로 다른 프로토콜의 수가 있다 정전기, 파티션 평형, 체질 분리 행렬 및 pH의 속성)16. 여기, 우리는 체질 분리, 자동화 된 폴리머를 사용 하 여 항 체 (또는 immunoassay) 모 세관 전기 이동 법 방법 및 상업적으로 채택된3설명 합니다. 이 시스템의 장점은 사용 및 운영, 표준화 및 상용 시 약 및 시 약 및 샘플 서쪽 오 점, 같은 전통적인 단백질 분석 실험에 비해 덜 요구 하는 안정적이 고 민감한 측정의 용이성을 포함 효소 연결 된 immunoassay 그리고 다른3,,45형식. 그러나 그것은 지적 하고있다이 기술 이전 평가에서 평가 될 수 있다 단백질의 크기 범위는 사용 가능한 분리 매트릭스4, 최근 제품 440 kDa17 2에서 측정 범위 확대에 의해 제한 되어 . 또한, 일부 lysate 버퍼 분석 결과18과 호환 되도록 알려져 있다, 따라서 실험 시 약 사용의 선택을 고려해 야 합니다 미리.
상업적으로 사용할 수 있는 구성 요소와 자동화 된 절차의 주요 장점은 표준화 된 방법 및 시 약을 통해 결과의 일관성입니다. 이 프로시저 내에서 중요 한 단계를 자동화 하 여 시험 실패의 가능성을 최소화 합니다. 그러나, 그것은 모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 문제를 최소화 하기 위해 프로토콜 중 특정 관행을 준수 해야 합니다는 것을 주의 하는 것이 중요. 첫째, 그것은 중요 하 luminol-S/과산화 수소 혼합물 준비 신선 하 고 즉시 플레이트 로드 하기 전에입니다. 산화 제 추가 분석 결과 후 특정 항 체 분석 결과 대 한 일관 된 측정 결과 일관 된 타이밍 일관 된 발광 높아집니다. 또한,는 주로 산화 에이전트의 힘에 영향을 미치는 만료 되지 않은 시 약 사용 되는 중요 하다. 또한, 그 샘플, 항 체, 및 다른 시 약의 로드 순서 엄격 하 게 따라 ( 그림 1참조) 중요 하다. 모든 시 약 장소 pipetted 분석 결과 실패와 낭비 실행 발생 합니다.
이러한 중요 한 단계 외 기법으로 기본 문제 일반적으로 최적화를 통해 극복할 수 있습니다. 사실, 이러한 조건을 각 모델 시스템/항 체 결합 하 고 그러므로 각 새로운 분석 결과 대 한 경험적으로 결정 한다. 이 문서에서는, 우리는 세 가지 일반적인 최적화 절차에 초점: 노출 시간, lysate 적정 및 1 차적인 항 체 희석. 측정 결과 생성 하는 기능 때 luminol 기질 하지 되 고 급속 하 게 고갈, 신호 손실에 기판 고갈 결과 노출 시간 분석에 따라 달라 집니다. Lysate 적정도 동일한 단백질 대상에 대 한 다른 항 체로 서 다른 모델 시스템, 다 수 각 분석 결과의 선형 동적 범위를 결정 합니다. 항 체 희석 또는 포화 농도 근처 선택 신호에 변화 것입니다 영향을 받지 않을 무료 항 체의 부족 하지만 서로 다른 양의 사용 가능한 단백질 대상 epitope에 의해서만 확인 합니다. 항 체 외피 시간과 스태킹/샘플 로딩 시간 최적화 과정에서 다른 고려 사항이 포함할 수 있습니다. 대부분의 경우 악기에 대 한 기본 설정에서에서 해상도 감도의 좋은 균형을 제공 합니다. 그러나, 경우에 따라 가난한 해상도나 감도 개선할 수 있습니다 이러한 매개 변수를 조정 하 여.
모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 메서드는 빠르고, 효율적, 재현할 수 단백질 측정을 제공합니다. 이러한 방법을 연구 및 개발에서 주로 이용 되었습니다, 이러한 기술의 일관성 규제 및 임상 응용 프로그램에 잠재적인 유틸리티가 있다. 예를 들어 질병의 진행과 환경 유독 또는 환자 취약 부분 모집단의 식별 액세스할 수 행렬, 혈액, 소변, 타 액 등에서 측정 단백질 바이오 마커 기반 될 수 있습니다. 시 약 및 작업 비용 드롭 샘플 및 평가 동시에 증가 될 수 있는 대상의 수, 우리가 가능성이 이러한 종류의 응용 프로그램에 사용 되는 모 세관 전기 이동 기반 immunoassay 방법 볼 것 이다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다. 이 원고는 국민 건강 및 환경 효과 연구 실험실에 의해 검토 하 고 게시에 대 한 승인. 콘텐츠는 반드시 미국 EPA의 의견을 반영 하지 않는 않습니다 상표명 또는 상용 제품의 언급 구성 승인 또는 사용을 위해 추천.
Acknowledgments
저자는 키스 Tarpley는 미국 EPA 사무실의 개발을 위한 연구와 개발-연구 삼각형 공원 (RTP 오드) 그래픽 및 미디어 팀의 녹화, 그리고 교육용 비디오의 편집을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 우리의 데이터. 의 최적화에 관한 유용한 대화에 대 한 ProteinSimple에서 데보라 Pritchett를 감사 하 고 싶습니다. JM Guynn 했다 오크 리 지 연구소 과학 및 미국 환경 보호국에서 교육 연구/참여 프로그램에 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
| P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
| phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
| phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
| alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
| Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
| 12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
| www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
| BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
| keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
| keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
| Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
| Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
| INCLUDES: | |||
| Lysis Buffer AM1 | |||
| 1M dithiothreitol (DTT) | |||
| Protease Inhibitor Cocktail | |||
| 10X PBS | |||
| Phosphatase Inhibitors |
References
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- Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways. Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).
- Chen, J. Q., et al. Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system. Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. J Transl Med. 13, 182 (2015).
- Liu, S., et al. The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized & Translational Medicine Research. J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).
- ProteinSimple Western. Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).
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- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. J Vis Exp. (84), e51149 (2014).
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- Shintani, H. Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , 1, Springer. Netherlands. (1997).
- Wes reagents and consumables :: ProteinSimple. , https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html (2017).
- Simple Western Size Assay Buffer Compatibility. , http://www.proteinsimple.com/documents/SW_Buffer_Compatibility_Table_rev_D.pdf (2017).
