Summary
Hedef proteinler üzerinden toplam protein ürünleri ölçmek için bir ticari platformu kullanarak bir kılcal tabanlı immunoassay gösterilmiştir. Buna ek olarak, pozlama süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltme tahlil parametreleri bir hücre kültür modeli sistemi için optimize edilmiştir.
Abstract
Uzun kılcal tabanlı kullanmak yeni teknolojiler için geleneksel uzun kıyasla daha hızlı ve daha nicel protein değerlendirme söz veriyorum. Ancak, benzer şekilde diğer protein antikoru tabanlı deneyleri, protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi kılcal tabanlı immunoassay parametrelerinin Optimizasyonu önemli bir anlamlı ve güvenilir nesil önkoşuldur veri. Ölçümleri sinyal değişiklikleri lysate konsantrasyon değişiklikleri doğrudan orantılı nerede tahlil doğrusal aralık içinde olmalıdır. Uygun lysate konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri insan bronş epitel hücre hat, BEAS-2B, seçme işlemi burada gösterilmiştir. Tahlil doğrusallık tüm cep telefonu özü protein konsantrasyonları p53 ve α-tübülin antikorları ile bir dizi üzerinden gösterilir. Sinyal tükenmişlik örneği uzun pozlama süreleri ile en yüksek konsantrasyonlarda görülür ve doygunluk gösteren bir α-tübülin antikor seyreltme eğrisi gösterilir. Ayrıca, örnek deneysel sonuçlar en iyi duruma getirilmiş parametrelerini kullanarak doksorubisin tedavi hücreler için raporlanır.
Introduction
Kapiler elektroforetik uzun boyutu veya şarj ayırma sistemleri kullanarak hücre lysates ifadede protein ölçmek ve geleneksel uzun çeşitli avantajlar sağlar. Örneğin, Batı leke için karşılaştırıldığında, kılcal tabanlı otomatik işlemleri jelleri, aktarım cihazları, gereksinimini ortadan kaldırır ve manuel yıkar. Buna ek olarak, mutlak gerekli protein yaklaşık 10 kat daha az, kılcal tabanlı sistemler nadir hücre tipleri veya sınırlı örnek1,2ile kullanmak için idealdir miktarıdır. Sonuçlar az 3 h otomatik sistemler kullanarak olarak elde edilen ve daha önce daha nicel ve geleneksel Batı daha tekrarlanabilir gösterilmiştir yordamlar3,4,5leke. Işlem boyutu tabanlı deneyleri için Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), dithiothreitol (DTT), içeren örnekleri yükleme oluşur ve fluorescently molekül ağırlığı işaretleri istifleme ve ayırma matrisler içeren kapiller sütunlara etiketli. Kılcal damarlar için uygulanan gerilim büyüklüğüne göre örneklerinde proteinler ayırır ve UV ışığı kapiller duvarı için ayrılmış proteinlerin immobilizes. Kılcal sonra IMMUNO probed-hedef özgü birincil antikor ve horseradish peroksidaz ile (HRP)-konjüge ikincil antikor. Luminol ve peroksit bir ücret eşleşmiş cihaz (CCD) kamera tarafından ölçülen ve protein quantitate için analiz chemiluminescent ışık nesil katalizler.
Göreli kolaylık ve hız bir kılcal tabanlı otomatik elektroforetik immunoassay platformu rağmen tahlil koşulları protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi duruma getirilmesi doğru tekrarlanabilir elde etmek için önemlidir sonuçlar. Genel olarak, bir tahlil bu sistemler için en iyi duruma getirmek için aşağıdaki yordamları yapılmalıdır:
1) bir ekran değerlendirmek ve antikorlar sinyal ve özgüllük protein hedef seçmek için yapılmalıdır. Varsa, saf protein veya hedef epitope özgüllük değerlendirmek için kullanılabilir; Ancak, toplam protein modeli sisteminden kaynaklı olası belirsiz sinyal değerlendirmek hala önemlidir.
2) sonra tahlil dinamik aralığını belirlenmesi gerekiyor. Örnek toplama iki katına gibi ideal bir sinyal (pik alanı kullanarak ölçülen) iki katına görülmektedir; Ancak, uygulamada, tahmin edilebilir bir şekilde (uygunörneğin, doğrusal) giriş için sinyal orantılı bir değişiklik protein miktar için yeterlidir. Ayrıca, bu iyileştirme protein konsantrasyonu yüksek sinyal ile ama hala deneysel model için doğrusal aralık içinde tanımlayabilirsiniz.
3) en iyi duruma getirme adım 2'de seçilen sabit protein konsantrasyonu kullanarak en uygun antikor konsantrasyonu belirlemek. Antikor konsantrasyonu artırır, sinyal o doygunluk yaylalar kadar artar. Bu doygunluk düzeyi yakınındaki bir antikor konsantrasyonu protein konsantrasyonu doğru ölçüm için gereklidir.
Protein konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri bir kılcal tabanlı otomatik boyut tahlil6 için en iyi duruma getirmek için kullandığı işlem bütün hücre özleri BEAS-2B bir SV-40 dönüştürülmüş insan bronş izole kullanarak gösterilmiştir epitel hücre satırı. Hücre veya doku özleri protein izolasyon çok sayıda yayımlanan protokolleri7,8,9 kullanarak gerçekleştirilebilir ve burada yer almaz. En iyi duruma getirilmiş koşullar kullanarak bir deneme deneme sonuçlarını da için toplam bildirdi ve fosforile (serin 15, serin 20) p53 1,2, doksorubisin (hücre apoptosis10ikna bir ortak kemoterapötik Ajan) maruz kültürlerde 1.8, ve 2.4 µg/mL medya 4 hasat öncesinde s için. P53 en yüksek alanlarda yükleme denetimi olarak kullanılan ɑ-tübülin için normalleştirilmiş.
Protocol
Not: tüm reaktifler ve örnekleri üretici göre hazır sağlamak ' s protokolü, ana hatlar aşağı. Lütfen uygun bireysel koruma araçları nitril eldiven, önlük, kapalı parmaklı ayakkabılar ve koruyucu gözlük içerir Bu yordam sırasında giymek. Bir tablo belirli malzemeler, reaktifler ve gerekli ekipman ayrı olarak sağlanır. Örnekleri toplam protein konsantrasyonu-var belirlenen Bradford tahlil 11 gibi kullanılan, lysate arabellek ile uyumlu olan kurulan yöntemleri kullanılmadan önce.
1. örnekleri ve Kimyasalları olarak üretici tarafından sağlanan standart paketinde hazırlanması
- dithiothreitol (DTT) 400 mM çalışma çözüm hazırlamak için açık tüp içeren 40 µL deiyonize su ekleyin Stok üretici tarafından sağlanan. Kabarcıklar çözümü çözüm yavaş ve yumuşak pipetting ile karıştırılarak tanıtımı önlemek önemlidir.
- Ekle 20 µL 10 X örnek arabellek ve floresan 5 X içeren pembe tüp için hazırlanan 400 mM DTT çözümün 20 µL master mix (Tablo reçetesi görmek).
Not: Master Mix (MM) bir folyo kapak ile üretici tarafından mühürlenmiş durumda ve pipet ucu tarafından deldi. DTT pipet sıçramasına önlemek için yavaş yavaş pipetting tarafından Mix. - Sonra 16 µL deiyonize su ekleyin, 10 X örnek arabellek ve 2 µL hazırlanan 400 mM DTT çözüm için üretici tarafından sağlanan beyaz biotinylated merdiven tüp, 2 µL sağlanan. Karışımı yavaşça ve denaturing için bir 0.6 mL tüp içine transfer.
- Hazırlama 0.1 x tarafından sağlanan 10 su ile çözüm 1: 100 X sulandrarak örnek arabellek. Yeterli 0.1 x tüm örneklerini sulandırmak için örnek arabellek hazırlayın.
- Son istenen toplam protein konsantrasyonu bağlı olacak bir örnek eklenir 0.1 x örnek arabellek miktarını hesaplamak. Mix 1 Bölüm 5 floresan MM x 4 parça ile istenen son protein konsantrasyonu elde etmek için örnek seyreltilmiş.
- Hesaplama birimleri aşağıdaki gibi: (i) Cilt 5 x floresan MM (istenilen son protein konsantrasyonu) = / 5; (ii) protein stok hacmi (istenilen son protein konsantrasyonu x Toplam hacim gerekli) = / Protein hisse senedi toplama; (iii) birim 0.1 x örnek arabellek Toplam hacim - 5 MM birim x - Protein stok hacmi =.
2. Denatürasyon örnekleri ve merdiven
- hazırlanan yer örnekleri ve biotinylated merdiven 5 dk. girdap tüpler kuluçka, hemen sonra bir 95 ° C ısı bloğundaki yürütmek bir spin için ~ 5 s bir masa üstü santrifüj ve buz üzerinde yer
Not: Bazı proteinler, protein toplama önlemek ve göç kılcal matrisindeki geliştirmek için nazik denaturing koşulları (örneğin, 70 o C 10 dk) gerektirebilir. Eğer ağır yüksek moleküler ağırlık vasıl bulaşması (örneğin video bakınız) bu seçeneği düşünün.
3. Antikorların hazırlanması
- optimizasyonu ile saptanan
- (Temsilcisi sonuçları ve video bakınız), birincil antikor (örneğin, 1:50, 1: 100) istenen dilution(s) sağlanan antikor hazırlamak Dilüent 2.
Not: Antikorlar genellikle daha yüksek konsantrasyonları immunoassay kılcal tabanlı geleneksel Batı kurutma için kullanılır. Sağlanan ikincil antikor seyreltme kullanıma hazırdır.
4. Luminol-S ve peroksit hazırlanması
- luminol-S ve peroksit 1:1 karışımı hazırlayın.
- Girdap karışımı ve buz üzerinde depolamak için
Not: Bu karışımı taze deneysel her tahlil için hazırlanır önemlidir. 250ul toplam karışımı tam bir tabak çalıştırmak için gerekli.
5. Tahlil plaka hazırlanması
- şekil 1 ' de gösterildiği gibi yük örnekleri ve yukarıda tahlil plaka hazırlanan Kimyasalları. Her satır için aşağıda ayrıntılı talimatlara bakın. Plaka kapak reaktif eklemeler arasında değiştirilir kuyulardan buharlaşma en aza indirmek için emin olun.
- İyi A1 içine A, damlalıklı 5 µL Biotinylated merdivenin satırda. İçin kalan satır, damlalıklı hazırlanan örnekleri (5 her µL) kuyu A2-A25.
Not: Kartuş ilk kılcal bu standart çalıştırmak için optimize edildiğinden bu A1 de her zaman merdiveni, içerir zorunludur. - Satır B, antikor Dilüent 2 damlalıklı 10 µL her kuyuya (B1-B25).
- İyi C1 içine C, damlalıklı 10 µL antikor Dilüent 2 satırda. Kalan satır C kuyuları, birincil antikor (kuyu C2-C25) damlalıklı 10 µL.
- Satır D, damlalıklı 10 µL Streptavidin-HRP, iyi D1 içine. Kalan satırda D kuyuları, ikincil antikor (kuyu D2-D25) damlalıklı 10 µL.
- E, damlalıklı 10 µL her kuyuya (E1-E25) taze hazırlanmış luminol-peroksit karışımı satırdaki.
- Son olarak, Ekle yuvası başına 500 µL yıkama arabellek her top 3 satır arabellek Wells.
Not: Kabarcık oluşumu hafifçe pipetting ve kabarcıklar yükleme kılcal ile müdahale ve çalıştırabilirsiniz ucundan son hacim kovmak değil en aza indirmek önemlidir.
Bir kez tüm wells yüklü, - ~ 1000 x g kabarcıklar kaldırmak ve kuyu dibinde sıvı olduğundan emin olmak için oda sıcaklığında 5 min için plaka santrifüj kapasitesi. Bir küçük pipet ucu veya temiz iğne ile herhangi bir görünür baloncuklar pop (örneğin, 25 göstergesi steril " rep üst " iğne).
Resim 1 . Tahlil plaka için pipetting şablon. Renk kodlamasını uygun reaktifler ve tahlil plakasına eklendi örnekleri (24 toplam) temsil eder. Biotinylated merdiven örnekleri kuyulardan A2 A25 kadar hazırlanan iyi A1 (turuncu), Ekle (açık mavi), antikor Dilüent 2 kuyu B1-B25 ve C1 ' (açık yeşil), kuyu C2 C25 (mavi), streptavidin-HRP iyi D1 için kadar birincil antikor (koyu pembe), ikincil antikor D2 D25 kadar Kuyu yapımı (koyu yeşil) ve kuyu E1 E25 (mor) kadar luminol-peroksit karışımı. Yıkama arabellek daha büyük orta plaka ilk üç sıra eklendi wells (koyu mavi). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
6. kılcal immunoassay enstrüman başlayan
- araç ve eşlik eden bilgisayarın açık olduğundan emin olun. Hiçbir ısınma zamanı gereklidir.
- Bilgisayar araçları yazılımını açın. Önce seçin " tahlil " pencerenin sağ sekmesini ve " yeni tahlil " altında " Dosya menüsü " solda. Boyut, boyut aralığı (örneğin, 12-230 kDa) ve kartuş seçin özel tahlil için kullanılan türü (örneğin, 25 kılcal).
Not: Bir de giriş Mayıs tahlil parametrelerini, protein konsantrasyonu, antikor türü ve seyreltme, eğer dahil olmak üzere istenen ama bunlar tahlil başlatmak için gerekli değil. - Turuncu panelinin üstüne düğmeye basarak kapıyı cihazda.
- Dikkatli bir şekilde onun paketinden kapiller kartuşu çıkarın. Cam kılcal kendilerini dokunmadan, kartuş, kartuş tutucusuna koyun. Mavi ve turuncu değiştirmek iç ışık gözlemleyerek kartuş oturma doğrulayın.
- Plaka sıkıca kenarda tutun ve buharlaşma mühür plaka alt bölümünden dikkatle akasındaki. Bu ayrılık matris wells bir sm ile görülen herhangi bir baloncuklar popBütün damlalıklı ipucu veya temiz iğne (örneğin, 25 göstergesi steril " rep üst " iğne).
- Tahlil plaka yer tam olarak oturduğundan, sağlanması plaka tutucu üzerinde ve enstrüman kapıyı kapat.
- Tıklama " başlangıç " yazılımında butonunu.
Not: Başlat düğmesi görünüyorsa araç ile bağlantı kesildi. Araç üst sol menüden seçin, ardından bağlayın. Bir pop-up araç seri numarası ile görünmelidir; Bu seçin ve sonra Bağlan'ı tıklatın. Başlat düğmesini şimdi görünmelidir.
Çalışma tamamlandıktan sonra - plaka atmak. Kartuşu ve elden çıkarma, pop baloncuklar için kullanılan herhangi bir iğne ile birlikte "Sharps" kapsayıcısı yer. Güç aracı düzenli olarak kullanılıyorsa, bağlantı sorunlarını önlemek için bırakın (örneğin, en az haftalık).
7. Deneme analiz
- analiz daha önce aşağıdaki kalite kontrolleri yapılmaktadır emin olun.
- Seçerek doğrula floresan standartları " göstermek standartları " simgesi. Standartlara doğru olarak tanımlanan onay " grafiği " sekme. Onlar doğru değilse, gidin " tek görünüm " simgesi, doğru tepe üzerinde sağ tıklayın ve seçin " kuvvet standart ", ya da yanlış tepe üzerinde sağ tıklayın ve seçin " standart değil ". Her yeni kılcal için bu denetimi yap. Yanında tıkırtı üstünde
- Doğrula biotinylated merdiven " örnekleri " ve " tek görünüm " simgeler. Merdiveni deney sekmesinde seçin. Bir tepe yanlış teşhis, doğru içinde tıkırtı üstünde " grafik görünümü " ve seçin " Kaldır tepe ".
Not: Örneğin, 12, 40, 66, 116, 180 ve 230 kDa boyutlandırma doruklarına 12-230 kDa teçhizat için kullanılan biotinylated merdiven göstermelidir. Eğer bu adım gerçekleştirilmez, örnek doruklarına boyutlandırma yanlış hesaplanır, sahte sonuç. - Görünümü ve örnek doruklarına analiz. Molekül ağırlığı, pik alanı, pik yüksekliği ve sinyal-gürültü (S/N), deneysel hesaplamalar için gerektiği gibi de dahil olmak üzere zirveleri tablosundan veri türetmek.
Representative Results
Çekim hızı - Belirleme sinyali tükenmişlik
Luminol ve peroksit substrat çok hızlı bir şekilde boşaldığında sinyal tükenmişlik oluşabilir. Bu verileri farklı Kemiluminesan pozlama zaman tarafından belirlenebilir. Analiz yazılımı düzenleme - > analiz - > "resimler" için gidin. Pozlama aralığı 5 ila 480 s. Her poz verilerden benzer bir sinyal/saat katsayısı olmalıdır böylece sinyal/saat, y ekseni bir electropherogram içinde bildirir. Luminol tükenmiş olur bu katsayısının sırayla uzun pozlama ile p53-1 antikor (Şekil 2) ile görülen azalır. Substrat tükenmesi nedeniyle, bu tahlil ölçülebilir 0.2 µg/µL konsantrasyonu sadece 5-30 s Etkilenmeler kadar kabul edilebilir. Bu nedenle, bu örnekte 15 s p53 en uygun veri analizi pozlama zaman olmaya kararlıydım.
Lysate titrasyon - Doğrusal dinamik aralığı belirleme
Bu ölçümler her tahlil doğrusal dinamik aralığı içinde en yüksek bölgelere göre ölçülen sinyal değişiklikleri değişiklikleri örnekteki protein miktarı ile orantılı nerede alınması önemlidir. 15 s seçilmiş en uygun çekim hızı kullanarak önceki bölümde, tahlil doğrusallık p53 ve ɑ-tübülin için konsantrasyon (şekil 3) 15-fold bir dizi daha büyük üzerinde gösterilmiştir. Bizim deneyim, R2 değeri > 0,9 bir doğrusal regresyon uygun olarak kabul edilir (tahlil mutlak bir nicel ölçüm ise) bilinen miktar veya örnek saf protein bir seyreltme aralığı için kabul edilebilir bilinmeyen hedef protein lysate (eğer tahlil göreli bir nicel ölçüm) olduğunu.
Antikor seyreltme duruma getirilmesi
Konsantrasyonları doyurarak antikorları kullanarak ölçülen herhangi bir sinyal değişiklikleri sadece protein miktarı değişikliklere bağlı olduğundan emin olun yardımcı olur. Gücümüzü, Bütün hücre (tahlil içine yüklenen 0.2 µg/µL toplam protein) ayıklar iki BEAS-2B hücre satır 1:25 - 1:800 (şekil 4) arasında değişen seri olarak seyreltilmiş ɑ-tübülin antikor konsantrasyonları ile probed. Chemiluminescent sinyal (burada, pik alanı olarak ölçülür) karşı antikor seyreltme çizildi. Doygunluk 1:50 gözlenen eğri göze çarpan bir plato başladığı seyreltme.
Deneysel deneme - BEAS-2B hücrelerdeki doksorubisin tedavi
En iyi duruma getirilmiş tahlil koşul kullanma, BEAS-2B hücre kültürü doksorubisin üç farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi (1,2, 1.8 ve 2.4 µg/mL) için 4 h (5 rakam, Tablo 1). P53 translasyonel modifikasyonlar ile aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama, yaşlanma ve Apoptozis12de dahil olmak üzere çeşitli hücresel yanıt aracılık eder. Özellikle, Apoptozis doksorubisin tedavi13den sonra sonuçlanan p53, transkripsiyon aktivasyonu için serin 15 fosforilasyon sanılıyor. Bu gösteride, ɑ-tübülin alanları kontrol kat sunulan en yüksek normalleştirilmiş. İlginçtir, 3.5 4-fold artışlara p53 fosforilasyon, serin serin 20 fosforile p53 düzeyini 15 ve logosuna 2 kat artış doksorubisin 4 h maruz kaldıktan sonra gözlendi. Bu sonuçlar p53 aktivasyonu olduğunu gösterir; Ancak, doz-yanıt seçilen konsantrasyonları görülür (tersine, test en düşük doz en yüksek yanıt elde edildi). Toplam p53 açık tedaviye yanıt bu modeli sistemde göstermek değil. Biz daha önce çinko tedavi BEAS-2B hücreleri14' te toplam p53 benzer koşullar altında yüksek düzeyde yokluğunda p53 fosforilasyon aktivasyonu gözlemledim.
Resim 2 . Sinyal tükenmişlik algılamak için pozlama görüntü karşılaştırma. Lane protein konsantrasyonları ile p53-1 antikor 1:500 seyreltme at probed BEAS-2B lysates için azalan göstermek görüntüler. Kemiluminesan sinyal katsayıları, tepe yükseklikleri enstrüman yazılım olarak rapor üst üste. Tepe yükseklikleri farklı olarak görsel grup yoğunluklarda otomatik olarak oluşturulan ve bantları ve bir panelden diğerine değil karşılaştırılabilir görüş yardım etmek için aracı tarafından ayarlanır. Kemiluminesan sinyal azalma kaybolmaya başlayan sinyali ile (split tepe) substrat tükenmesi gösteren iki uzun pozlama, pozlama süresi arttıkça unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Lysate titrasyon lane sayısı gösteriliyor. Lysate titrasyon lane gösterilen (A) BEAS-2B 1:500 p53-1 veya 1:50 ɑ-tübülin ile probed zaman lysate kez. En yüksek alan değerleri farklı olarak, görsel grup yoğunluklarda otomatik olarak oluşturulan ve bantları ve bir panelden diğerine değil karşılaştırılabilir görüş yardım etmek için aracı tarafından ayarlanır. Doğrusal regresyon çözümlemesi (B) deneyleri, 0.01 0.20 µg/µL ve 0,025-0,40 µg/µL, 0.999 ve 0.985, R2 değerleri ile sırasıyla test tüm aralığında doğrusal onaylar. Toplam protein konsantrasyonları doğrusal aralık ortasında potansiyel hedef protein değişim her iki yönde de (örneğin, α-tübülin için 0.2 µg/µL) karşılamak için seçilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . İki ayrı BEAS-2B protein lysates olan ve olmayan temel normalleştirme için α-tübülin antikor seyreltme eğrileri. Kesin bir ulusTure doğrusallık üzerinden 1:50 (0.02) görülür seyreltme, doygunluk gösteren. 1:50 bu nedenle bu antikor için en uygun seyreltme olarak seçilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Toplam ve serin 4 h doksorubisin (DXN) tedavisinin etkisi fosforile p53 protein ifade BEAS-2B hücre. Tepe alanları α-tübülin için normalleştirilmiş ve denetim (CTL) kat çizilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1. Toplam ve serin 4 h doksorubisin (DXN) tedavisinin etkisi fosforile p53 protein ifade BEAS-2B hücre. Bu tablo daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
On yıllardır, oldu sürekli Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntem geliştirme ilgi işleme azalmıştır düşük örnek ve reaktif harcamaları nedeniyle, zaman zaman geleneksel yöntemlere göre ve yüksek uyumluluk için yordam4,15otomatikleştirmek. Kılcal damarlar, elektroforetik, electrokinetic, polimer eleme ve proteinler (sırasıyla farklı özelliklerine göre ayır, isoelectric yöntemleri de dahil olmak üzere kullanılan proteinler ayrılması için farklı iletişim kuralları vardır Elektrostatik yükü, bölüm denge, özellikleri ayıran matris ve pH eleme)16. Burada, bir otomatik ayırma, eleme bir polimer kullanarak antikor tabanlı (veya immunoassay) Kapiler elektroforez yöntemi ve ticari olarak kabul edilen3açıklayın. Bu sistemin avantajları kolaylığı kullanım ve işlem, standart ve piyasada bulunan reaktifler ve daha az reaktif ve geleneksel protein deneyleri Batı leke gibi karşılaştırıldığında örnekleri gerektirir güvenilir, duyarlı ölçümler şunlardır, enzim bağlı immunoassay ve diğer formatları3,4,5. O bu teknoloji önceki Değerlendirmeler içinde değerlendirilebilir protein boyutu aralığı tarafından kullanılabilir ayırma matris4ancak son teklifleri için 440 kDa17 2 Aralık ölçülebilir genişlettik, sınırlı dikkat edilmiştir . Buna ek olarak, bazı lysate arabellekleri tahlil18ile uyumsuz olduğu bilinmektedir, bu nedenle kullanılan deneysel reaktifler yelpazesi önceden dikkate alınmalıdır.
Bir otomatik işlemi piyasada bulunan bileşenleri ile önemli bir avantajı standartlaştırılmış yöntemler ve Kimyasalları ile sonuç tutarlılığını var. Bu tahlil başarısızlık yordam içinde kritik adımlar otomatikleştirerek bozmasını önler. Ancak, bazı uygulamalar için Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay sorunları en aza indirmek için protokol sırasında yapıştırılır gerekir olduğunu unutmamak gerekir. İlk olarak, bu luminol-S/peroksit karışımı taze ve hemen önce yükleme plakası hazırlanır önemlidir. Oksitleyici Ajan, sonra tahlil belirli antikor tayini için tutarlı ölçümleri ile sonuçlanır eklendikten sonra tutarlı zamanlama içinde tutarlı ışıldama neden olur. Ayrıca, süresi bitmemiş reaktifler, hangi öncelikle oksitleyici Ajan potens etkiler kullanılır önemlidir. Ayrıca, örnekleri, antikorlar ve diğer Kimyasalları yükleme sırasını kesinlikle (bkz. şekil 1) takip edilmesi önemlidir. Yersiz pipetted herhangi bir reaktif tahlil başarısızlık ve boşa koşmak sonuçlanır.
Kritik adımları yanı sıra, birincil sorunları tekniği ile deneyimli genellikle optimizasyon ile aşılabilir. Nitekim, bu koşullar her modeli sistem/antikor birleşimi için özeldir ve bu nedenle ampirik olarak her yeni tahlil için tespit edilmelidir. Bu makalede, biz üç ortak en iyi duruma getirme yordamı üzerinde odaklanmak: çekim hızı, lysate titrasyon ve birincil antikor seyreltme. Ne zaman luminol substrat hızla, substrat tükenmesi sonuçlarına sinyal kaybı tükenmiştir değil bir çekim hızı analizini ölçülebilir sonuçlar oluşturma yeteneği bağlıdır. Lysate titrasyon farklı model sistemleri, hem de aynı protein hedef için bile farklı antikorlar ile farklı olabilir her tahlil doğrusal dinamik aralığını belirler. Antikor dilutions veya konsantrasyonları doyurarak yakınındaki seçilmiş ücretsiz antikor yetersizliğinden, ancak kullanılabilir protein hedef epitope farklı miktarda sadece sinyal değişiklikleri etkilenmeyecektir emin olun. Diğer konuları en iyi duruma getirme işlemi sırasında antikor kuluçka süresi ve istifleme/örnek yükleme süresi içerebilir. Çoğu durumda varsayılan ayarlar için araç en iyi çözünürlük ve hassasiyet dengesini sunuyoruz. Ancak, bazı durumlarda yanlış çözünürlükte veya duyarlılık bu parametreleri ayarlayarak geliştirilebilir.
Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri protein hızlı, verimli ve tekrarlanabilir ölçümler sağlar. Bu yöntemler öncelikle araştırma ve geliştirme ayarlarında kullanılan iken, bu teknolojilerin tutarlılık düzenleyici ve klinik uygulamaları potansiyel yarar vardır. Örneğin, duyarlı altgrupları çevre toxicants veya hasta kimlik hastalığın ilerlemesi ile protein biyolojik kan, idrar ve tükürük gibi erişilebilir matrisler ölçülen temel alabilir. Reaktif ve işlem maliyetleri bırak ve örnekleri ve aynı anda biçilen artar olabilir hedeflerin sayısı, biz büyük olasılıkla bu tür uygulamalar için kullanılan Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri göreceksiniz.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin. Bu makale Ulusal Sağlık ve çevre etkileri araştırma laboratuvarı tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmış yayın için. İçerik bize EPA görüşlerini yansıtmayabilir ne de ticari adlar veya ticari ürünler söz ciro veya kullanım için tavsiye teşkil etmez.
Acknowledgments
Yazarlar Keith Tarpley bize EPA kayıt ve öğretim video düzenleme Office geliştirme, araştırma ve geliştirme-araştırma üçgen Parkı (ORD-RTP) grafik ve medya ekibinin teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Deborah Pritchett ProteinSimple üzerinden bizim veri. duruma getirilmesi ile ilgili yararlı konuşmaları için teşekkür etmek istiyorum JM Guynn bilim ve eğitim araştırma/katılım programı ABD Çevre Koruma Kurumu, Oak Ridge Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
| P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
| phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
| phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
| alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
| Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
| 12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
| www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
| BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
| keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
| keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
| doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
| Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
| Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
| INCLUDES: | |||
| Lysis Buffer AM1 | |||
| 1M dithiothreitol (DTT) | |||
| Protease Inhibitor Cocktail | |||
| 10X PBS | |||
| Phosphatase Inhibitors |
References
- Bradley, H. L., Sabnis, H., Pritchett, D., Bunting, K. D. Hematopoietic stem cell protocols. 1185, Springer. (2014).
- Guo, L., Eldridge, S., Furniss, M., Mussio, J., Davis, M. Use of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes (hiPSC-CMs) to Monitor Compound Effects on Cardiac Myocyte Signaling Pathways. Curr Protoc Chem Biol. 7 (3), 141-185 (2015).
- Chen, J. Q., et al. Absolute quantitation of endogenous proteins with precision and accuracy using a capillary Western system. Anal Biochem. 442 (1), 97-103 (2013).
- Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. J Transl Med. 13, 182 (2015).
- Liu, S., et al. The Application of a Novel Nanovolume Capillary Electrophoresis- Based Protein Analysis System in Personalized & Translational Medicine Research. J Bioanal Biomed. S3 (004), (2013).
- ProteinSimple Western. Size Assay Development Guide, Revision 1. , (2014).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis. J Vis Exp. (84), e51149 (2014).
- Thorn, C. F., et al. Doxorubicin pathways: pharmacodynamics and adverse effects. Pharmacogenet Genomics. 21 (7), 440-446 (2011).
- Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. J Vis Exp. (38), (2010).
- Taira, N., Yoshida, K. Post-translational modifications of p53 tumor suppressor: determinants of its functional targets. Histol Histopathol. 27 (4), 437-443 (2012).
- Thompson, T., et al. Phosphorylation of p53 on key serines is dispensable for transcriptional activation and apoptosis. J Biol Chem. 279 (51), 53015-53022 (2004).
- Currier, J. M., Cheng, W. Y., Menendez, D., Conolly, R., Chorley, B. N. Developing a Gene Biomarker at the Tipping Point of Adaptive and Adverse Responses in Human Bronchial Epithelial Cells. PLoS One. 11 (5), e0155875 (2016).
- Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
- Shintani, H. Handbook of Capillary Electrophoresis Applications. , 1, Springer. Netherlands. (1997).
- Wes reagents and consumables :: ProteinSimple. , https://www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html (2017).
- Simple Western Size Assay Buffer Compatibility. , http://www.proteinsimple.com/documents/SW_Buffer_Compatibility_Table_rev_D.pdf (2017).
