Dette manuskript beskriver metoder til anvendelse af peptidmikraariteknologi til specificitetsprofilering af antistoffer, der genkender histoner og deres posttranslationelle modifikationer.
Post-translationelle modifikationer (PTM'er) på histonproteiner studeres bredt for deres roller i regulering af kromatinstruktur og genekspression. Masseproduktionen og distributionen af antistoffer, der er specifikke for histon-PTM'er, har i høj grad lettet forskningen på disse mærker. Da histon-PTM-antistoffer er nøglereagenser til mange kromatinbiokemiske applikationer, er streng analyse af antistofspecificitet nødvendig for nøjagtig datatolkning og fortsatte fremskridt på området. Denne protokol beskriver en integreret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays til profilering af specificiteten af histonantistoffer. Design og analyse aspekter af denne procedure er lettet af ArrayNinja, en open source og interaktiv softwarepakke, vi for nylig udviklede for at strømline tilpasningen af microarray printformater. Denne rørledning er blevet brugt til at screene et stort antal kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte histon PTM antibodiesS, og data genereret fra disse eksperimenter er frit tilgængelige via en online og udvidende Histone Antibody Specificity Database. Ud over histoner kan den generelle fremgangsmåde beskrevet heri anvendes bredt til analysen af PTM-specifikke antistoffer.
Genomisk DNA pakkes elegant inde i den eukaryote cellekerne med histonproteiner til dannelse af chromatin. Den gentagne underenhed af kromatin er nukleosomet, som består af 147 basepar af DNA viklet omkring en octamer kerne af histonproteiner – H2A, H2B, H3, og H4 1. Kromatin er bredt organiseret i løst pakket eukromatin og tæt pakket heterochromatin domæner. Graden af chromatin-komprimering regulerer i hvilket omfang proteinindustrien kan få adgang til det underliggende DNA til at udføre grundlæggende DNA-templaterede processer som replikation, transkription og reparation.
Nøgleregulatorer for genometilgængelighed i forbindelse med chromatin er PTM'er på de ustrukturerede hale- og kerneområder af histonproteiner 2 , 3 . Histon-PTM'er virker direkte ved at påvirke strukturen af chromatin 4 og indirekte througH rekruttering af læserproteiner og deres tilhørende makromolekylære komplekser, der har kromatin remodeling, enzymatisk og stilladsaktiviteter 5 . Undersøgelser af histon-PTM-funktion i løbet af de sidste to årtier tyder på overvejende, at disse mærker spiller nøglerolle i regulering af celleforebyggelse, organisationsudvikling og sygdomsinitiering / progression. Fueled af fremskridt i massespektrometri-baseret proteomteknologi er der fundet mere end 20 unikke histon-PTM'er på mere end 80 forskellige histonrester 6 . Navnlig forekommer disse modifikationer ofte i kombinationer og i overensstemmelse med "histonkode" -hypotesen, viser talrige undersøgelser, at læserproteiner er målrettet mod diskrete regioner af chromatin ved genkendelse af specifikke kombinationer af histon-PTM'er 7 , 8 , 9 . En vigtig udfordring fremadrettet vil være at tildele funktioner til grSkyldige liste over histon-PTM'er og at bestemme, hvordan specifikke kombinationer af histon-PTM'er orkestrerer de dynamiske funktioner, der er forbundet med chromatin.
Antistoffer er lynchpinreagenser til påvisning af histon-PTM'er. Som sådan er mere end 1000 histon-PTM-specifikke antistoffer blevet udviklet kommercielt til anvendelse i kromatinbiokemiforskning. Med den hurtige udvikling af DNA-sekventeringsteknologi med høj gennemstrømning anvendes disse reagenser i vid udstrækning af individuelle efterforskere og omfattende epigenomiske "køreplan" -initiativer ( f.eks . ENCODE og BLUEPRINT) i ChIP-seq (chromatinimmunpræcipitation kombineret med næste generations sekventering ) Rørledninger til at generere højopløselige rumlige kort af histon PTM-fordelingsgenet bredt 10 , 11 . Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at specificiteten af histon-PTM-antistoffer kan være meget variabel, og at disse reagenser udviser uegnede Dyrebare egenskaber som off-target-epitopgenkendelse, stærk positiv og negativ indflydelse fra nabo-PTM'er og vanskeligheder med at diskriminere modifikationsordren på en bestemt rest ( fx mono-, di- eller trimethyllysin) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Derfor er streng kvalitetskontrol af histon PTM-specifikke antistofreagenser nødvendigt for nøjagtigt at fortolke data genereret med disse værdifulde reagenser.
Microarray-teknologien muliggør samtidig forespørgsel af tusindvis af makromolekylære interaktioner i et gennemgående, reproducerbart og miniaturiseret format. Af denne årsag er der blevet udviklet en række mikroarrayplatforme til analyse af protein-DNA 19 ,"> 20, proteinprotein 21 og proteinpeptid-interaktioner 22. Faktisk er histonpeptidmikroarrays fremkommet som en informativ opdagelsesplatform for chromatin biokemiforskning, der muliggør højprofilering af forfattere, viskelæder og læsere af histon PTM'er 15 , 23, 24, og også til analyse af histon antistofspecificitet 17, 25. Beyond deres anvendelse i kromatin og epigenetik forskning, histon peptidarrays har potentiel anvendelighed som en diagnostisk / prognostisk test for systemisk lupus erythematosus og andre autoimmune sygdomme, hvor anti- Chromatin autoantistoffer er dannet 26 , 27 .
Her beskriver vi en integreret rørledning, som vi har udviklet til design, fremstilling og køRying histone peptid microarrays at generere specificitet profiler for antistoffer, der genkender histoner og deres PTMs. Rørledningen understøttes af ArrayNinja, en open source, interaktiv software applikation, som vi for nylig udviklede, som integrerer design- og analysestadierne i microarray eksperimenter 28 . ArrayNinja virker bedst i Google Chrome. Kort fortalt anvendes en robotkontakt-mikroarray printer til at deponere et bibliotek af biotinkonjugerede histonpeptider i definerede positioner på streptavidin-coatede glasmikroskop dias. Arrays kan derefter anvendes i et konkurrencedygtigt og parallelt assayformat for at forhøre antistof-epitopinteraktioner ( Figur 1 ). Peptidbiblioteket består af hundredvis af unikke syntetiske peptider, der indeholder PTM'er (lysinacetylering, lysin / argininmethylering og serin / threoninphosphorylering) alene og i relevante kombinationer, der stort set er afledt af proteomiske datasæt. Metoder til peptidsyntese og validering Er beskrevet andetsteds 23 . Data genereret fra vores igangværende histone PTM antistof screening indsats udnytter denne array platform er arkiveret på en offentlig web ressource, Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Især er histonpeptidmikroarrays fremstillet med variationer af denne protokol også blevet anvendt i vid udstrækning for at karakterisere aktiviteten af histon PTM-læserdomænerne 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 og mere for nylig til profilering af histon PTM forfatter og viskelæder 24 .
/files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg "/>
Figur 1: Tegneserieafbildning af den trinvise procedure til antistof screening på en histonpeptid-mikroarray. Biotinylerede histonpeptider med definerede posttranslationelle modifikationer (røde og blå cirkler) er trykt med biotin-fluorescein på streptavidin-belagt glas. Positive interaktioner visualiseres som rød fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Antistofens pålidelighed i biomedicinske forskningsapplikationer er afgørende 46 , 47 . Dette gælder især i kromatinbiokemi givet antistoffernes position som nøgleværktøjer til de fleste teknikker, der er udviklet til at karakterisere overfladen og fordelingen af histon-PTM'er. Protokollen præsenterede her detaljer en optimeret pipeline til design, fabrikation og anvendelse af peptidmikroarrays for at analysere histon PTM antistofspecificitet. …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af Van Andel Research Institute og et forskningsbidrag fra National Institutes of Health (CA181343) til SBR
Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
BSA | Omnipure | 2390 | |
Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
PBS | Invitrogen | 14190 | |
Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |