이 문서는 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 매핑의 화학 수 화 상태에서 미세 반응 기, 액체 진공 인터페이스에 분석을 위한 시스템으로 사용에 대 한 biofilm 성장을 위한 메서드를 제공 합니다. 녹색 형광 단백질으로 Shewanella oneidensis 미스터 1 모델로 사용 되었다.
박테리아 biofilms는 그는 광대 하 게 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS) 및 환경 미생물학에서 그들의 역할을 이해 하는 표면에 관련 된 지역 사회. 이 연구는 분석 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에 대 한 시스템에 biofilm 첨부 파일을 육성하 고 생활 biofilm의 화학 매핑 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈)에 의해 달성 하는 방법을 설명 합니다. 이 외부와 우리의 전문 설치 SALVI 채널 내의 박테리아의 경작을 통해 뿐만 아니라 biofilm 존재 및 ToF 심즈 분석 전에 두께 감지 하는 광학 이미징 기술을 통해 이루어집니다. 조각 같은 biofilm에서 크게 다른 탈수의 지역화 된 물 클러스터 환경으로 EPS에 강조 우리의 결과, 자연 수 화 상태에서 Shewanella biofilm의 특성 피크를 보여 상태입니다. 이러한 결과 진공 기반 화학 이미징 장비 biofilm 이미징 제자리에 있도록 SALVI의 획기적인 기능을 보여 줍니다.
박테리아 biofilms는 점에서 셀 연결 하 고 많은 가능한 환경에서 살아남을 수 있다 불리 한 물리적 및 기계적 자극, 다양 한 생존을 위해 박테리아에 대 한 방어로 시간이 지남에 진화 표면 관련 커뮤니티. 1 , 2 Biofilms는 광대 하 게 조사 하 고 의학, 공학, 농업, 그리고 산업 연구 및 개발 등 많은 분야에 응용 프로그램을. 1 , 2 정확 하 필수적 이다 이러한 복잡 한 미생물 지역 사회, 그들의 자체 생산된 세포 외 고분자 물질 (EPS)와 그들의 현지 물-클러스터 환경 등의 화학 매핑을 이해 하 고 상세한 그들의 생물 학적 활동 묘사 2
Biofilms는 존재 하 고 높은 수 화 상태에서 성장. 이 진공에서 휘발성 액체를 공부에 어려움으로 인해 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 (ToF-심즈) 같은 진공 기반 표면 분석 기법을 사용 하 여 큰 도전을 선물 한다. 그 결과, 진공 기반 표면 분석 기법만 말린된 상태에서 biofilm 샘플을 공부 하 고 거의 독점적으로 제한 되었습니다. 그러나, 그것의 진정한 생물 microenvironment의 정확한 조사 억제 말린된 상태에서 biofilm을 공부. 그것은 종종 EPS 무결성 및 biofilm 형태, 건조 biofilm 제자리에 액체 연구 질량 스펙트럼 결과 비교한 후 입증 되었습니다 어떤 과감 한 변경 발생 합니다. 3 , 4 이 문서에서는 분석에는 액체 진공 인터페이스 (SALVI),5,6 미세 반응 기에 대 한 우리의 시스템의 사용을 채용 하 여 자연 수 화 상태에서 biofilms 공부에 대 한 솔루션 제공을 따라서 여전히 진공 내에서 액체 매트릭스의 구조적 무결성을 유지 하면서 보조 이온 조사 빔에 대 한 직접 액세스를 제공 하는 아닌입니다 (PMDS)의 만든에서 그것의 얇은 실리콘 나이트 라 이드 (죄) 막에서 액체를 포함 약 실입니다. 7 , 8
S. oneidensis 씨-1 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하기 위해 돌연변이이 biofilm 절차 그림 변화 다양성 및 기반 환경 및 응용 미생물학에 있는 일반적인 사용에 대 한 모델 생물으로 선정 되었다 금속 감소와 세포 외 전자 전송에 대 한 그것의 독특한 기능에 무 겁 게. 9 , 10 , 11 또한, GFP의 존재를 허용 쉽게 연속 biofilm-두께 형광 현미경 검사 법을 통해 모니터링, fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터를 사용 하 여. 우리의 이전 연구 죄 창 최대 1 백 마이크로미터의 두께에 biofilm 성장을 위한 형광 이미징에 operando를 사용 하 여 첨부 파일을 선호 하는이 박테리아의 증거가 나타났습니다. 4 , 12 이 종이 형광 현미경 검사 법을 통해 biofilm의 존재의 확인을 토론할 것 이다, 하는 동안는 SALVI는 슈퍼 해상도 같은 다른 광학 이미징 방법에 호환 형광 이미징 (즉, 구조화 된 조명 현미경 (SIM)9) 그리고 confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (CLSM)4이미징). 광학 이미징 biofilm 두께 측정을 제공 하 고 표시, 두께 신 창에 첨부 파일을 확인 하는 biofilm의 모양의 3D 이미지를 얻을 수 있습니다. 9 동안 GFP 심즈 분석에 사용 되었다, oneidensis S. GFP 없이 성장 곡선에 대 한 광학 밀도의이 유일한 필요한 측정으로 사용 되었다 어떤 형광 이미징 요구 하지 않았다. 일반적으로, 차이 GFP 태그 및 태그 종 성장 곡선에 중요 하지 않습니다. 또한,이 프로토콜 절차를 설명 하는 모델 생물으로 S. oneidensis 씨 1 GFP를 사용,이 절차는를 위한 SALVI 내 재배에 필요한 수 있습니다 어떤 세균성 긴장. 비록 주어진 필요한 세균성 긴장의 지식, 시간, 온도, 산소 환경 등 일부 성장 조건 사용 될 박테리아의 변형에 맞게 수정 해야 합니다. 성장 매체에 대 한이 절차는 경작에 대 한 포도 당, 포도 당 없이 tryptic 간장 agar (TSA) 없이 “나노 와이어” 중간, tryptic 간장 국물 (TSB)를 사용합니다. 성장에 대 한 고 막의 확장 모니터링에 대 한 “나노 와이어” 매체의 구성 특별히 공식화 되었습니다. 그리고 S. oneidensis 작은 전선과 중간 구성의 모양을 나타나는 periplasm 되었습니다. 이전 연구에서 설립. 13 , 14
현장에서 우리의 이전 프로토콜 액체 ToF-심즈 SALVI 단백질 immobilization와 죄, ToF 심즈 분석 및 데이터 감소에 상세한 프로토콜을 첨부 파일에 대 한 제공 하는 혜택을 설명 했습니다. 12 데이터 감소 단계를 되풀이, 보다는 오히려이 종이 될 것입니다 대신 설정 하 고 biofilm 존재와 사전 두께 감지 하는 이미징 단계 뿐 아니라 우리의 SALVI 아닌 내 biofilms 육성의 독특한 접근 방식에 초점을 ToF 심즈 분석 하. Biofilms 이전만 건조 챔버 내에 진공 기반 표면 분석 기법의 샘플을 제한 되어, 하는 동안 라이브 biofilms의 상세한 EPS 및 biofilm 화학 매핑 지금 얻을 수 있습니다 현장에서 이 새로운 기능 때문에.
로그 단계에서 접종 후 수 일 및 온도를 그것은 건강 하 고 이미징, 충분히 두꺼운 3.1 단계에서 설명한 대로 전에 biofilm 성장 해야 테스트 중요 하다. 이 절차는 특히 S. oneidensis MR1 biofilm; 실 온에서 배양 커버 그러나 다른 방 온도 성장의 속도 좌우할 수 있다. 따라서, 그것은를 사용 하 여 광학 이미징는 biofilm ToF 심즈 분석을 진행 하기 전에 준비 인지 이해 중요 합니다. 마찬가지로, 박테리아의 다?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 평화로운 북 서 국립 연구소 (PNNL) 지구 및 생물 과학 (EBD) 임무 씨앗 실험실 감독 연구 및 개발 (LDRD) 기금 지원에 대 한 감사. 경 음악 액세스 W. R. 윌 환경 분자 과학 실험실 (EMSL) 일반 사용자 제안을 통해 제공 되었다. EMSL은 사무실의 생물학과 환경 연구 (BER) PNNL에 주최 국가 과학적인 사용자 시설입니다. 저자는 원고를 읽고 유용한 피드백을 제공 하는 증거에 대 한 박사 Yuanzhao 딩 감사 합니다. PNNL는 Battelle 계약 드 AC05 76RL01830 아래 DOE에 대 한에 운영 됩니다.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |