Denna artikel presenterar en metod för att odla en biofilm för i situ time-of-flight sekundära ion masspektrometri för kemiska mappning i dess hydrerade aktiveras med en mikroflödessystem reaktor, systemet för analys vid den flytande vakuum-gränssnitt. Den Shewanella oneidensis herr-1 med grön fluorescens protein användes som modell.
Bakteriell biofilm är ytan-associerade samhällen som studeras kraftigt för att förstå deras egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) och deras roller i miljömässiga mikrobiologi. Denna studie beskriver en metod för att odla biofilm fastsättning till systemet för analys vid den flytande vakuum gränssnitt (SALVI) och uppnå i situ kemiska kartläggning av en levande biofilm genom time-of-flight sekundära ion mass spectrometry (ToF-SIMS). Detta görs genom odling av bakterier både utanför och inom SALVI kanal med våra specialiserade setup samt optisk imaging tekniker att upptäcka biofilm närvaro och tjocklek före ToF-SIMS analys. Våra resultat visar de karakteristiska topparna av de Shewanella biofilmen i dess naturliga hydrerad belysa vid dess lokaliserade vatten klustermiljö, liksom EPS fragment, som skiljer sig drastiskt från den samma biofilmen uttorkad tillstånd. Dessa resultat visar genombrott kapacitet SALVI som möjliggör i situ biofilm imaging med ett vakuum-baserade kemiska imaging instrument.
Bakteriell biofilm är ytan-associerade samhällen som har utvecklats över tiden som ett försvar för bakterier att överleva olika negativa fysiska och mekaniska stimuli, vari celler är att bifoga och överleva i många möjliga miljöer. 1 , 2 biofilmer undersöks kraftigt och har tillämpningar inom många områden som biomedicin, medicinsk teknik, jordbruk, och industriell forskning och utveckling. 1 , 2 förstå kemiska mappningen av dessa komplexa mikrobiella samhällen, inklusive deras egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) och deras lokala vatten-klustermiljö, är viktigt att få en korrekt och detaljerad skildringen av deras biologiska aktiviteter. 2
Biofilmer finns och växa inom en mycket hydrerad stat. Detta utgör en stor utmaning i att använda vakuum-baserade ytanalys tekniker såsom time-of-flight sekundära ion mass spectrometry (ToF-SIMS) på grund av svårigheten att studera flyktiga vätskor i vakuum. Som ett resultat, begränsats vakuum-baserade ytanalys tekniker nästan uteslutande till studera biofilm prover på endast deras torkat tillstånd. Dock hämmar studera en biofilm i torkat tillstånd korrekt utredning av dess sanna biologiska mikromiljö. Det orsakar ofta drastiska förändringar till EPS integritet och biofilm morfologi, vilket har visats efter jämföra torra biofilm massa spektrala resultat i situ flytande studier. 3 , 4 denna artikel presenterar en lösning för att studera biofilmer inom deras naturliga hydrerad tillstånd genom att anställa användning av vårt System för analys på flytande vakuum gränssnitt (SALVI),5,6 en mikroflödessystem reaktor som innehåller vätska under dess tunna kiselnitrid (SiN) membran i en microchannel gjord av Polydimetylsiloxan (PMDS), vilket ger direkt tillgång till den sekundära ion sond strålen samtidigt bibehålla den strukturella integriteten av flytande matrisen inom ett vakuum kammaren. 7 , 8
S. oneidensis MR-1 muterad uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) valdes som modellorganism för denna biofilm förfarande illustration på grund av dess metaboliska mångsidighet och gemensam användning i miljö- och tillämpad mikrobiologi, som byggde tungt på sin unika förmåga för minskning av metall och extracellulära elektronöverföring. 9 , 10 , 11 dessutom förekomsten av GFP möjliggjorde enkel kontinuerlig biofilm-tjocklek övervakning genom fluorescensmikroskopi, med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) filter. Våra tidigare studier har påvisat detta bakterier som gynnar fastsättning till fönstret synd med i operando fluorescens imaging för biofilm tillväxt till en tjocklek på upp till 100 mikrometer. 4 , 12 medan detta papper kommer endast att diskutera bekräftelse av biofilm’s närvaro genom fluorescensmikroskopi, SALVI är kompatibel med andra optisk imaging metoder såsom super-resolution fluorescens imaging (dvs. strukturerad belysning mikroskopi (SIM)9) och confocal microscopy (CLSM) imaging4för laserscanning). Optisk imaging kan tjäna till att mäta tjockleken biofilm och få en 3D-bild av, en form av biofilmen som det verkar, bekräftar dess tjocklek och dess fastsättning fönstret synd. 9 medan GFP användes i SIMS analysen, S. oneidensis utan GFP användes för tillväxtkurvan, som här bara krävs mätning av optiska densitet och krävde inte någon fluorescerande imaging. Allmänhet, skillnaden mellan GFP taggade och otaggade arter i tillväxtkurvan är obetydlig. Dessutom, medan detta protokoll använder S. oneidensis MR-1 GFP som modellorganism för att beskriva förfarandet, är proceduren avsedd för någon bakteriell stam som kan behövas för odling inom SALVI. Även om, ges kunskap om den bakteriestam som behövs, kan vissa tillväxt villkor såsom tid, temperatur och syre miljön behöva ändras för att rymma stammen av bakterier ska användas. För odlingsmedium använder den här proceduren ”nanotrådar” medium, tryptic soy buljong (TSB) utan dextros och tryptic soy agar (TSA) utan dextros för odling. Sammansättningen av ”nanotrådar” medium har blivit speciellt framtagen för tillväxten och för övervakning av förlängningar av membranet och periplasm av S. oneidensis som verkar ta formen av små trådar och medelstora sammansättning har varit etablerad inom tidigare forskning. 13 , 14
Våra föregående protokoll på in situ flytande ToF-SIMS har illustrerat den förmån som SALVI har att erbjuda för protein immobilisering och fastsättning synd, liksom en detaljerad protokollet om minskning av ToF-SIMS analys och data. 12 i stället för att upprepa data minskning steg, detta papper skall tjäna till att i stället fokusera på den unika strategin för att upprätta och odla biofilmer inom vår SALVI microchannel, liksom imaging stegen att upptäcka biofilm närvaro och tjocklek tidigare ToF-SIMS analys. Medan biofilmer har varit tidigare begränsat till endast torkade prover inom kammaren av vakuum-baserade ytan analytiska tekniker, kan detaljerade EPS och biofilm kemiska kartläggning av levande biofilmer nu erhållas i situ på grund av denna nya kapacitet.
Efter ympning på logg-fas, är det viktigt att testa antalet dagar och temperatur vid vilken biofilmen bör växa innan det är hälsosamt och tjock nog för imaging, som beskrivs i steg 3.1. Proceduren omfattar särskilt odling en S. oneidensis MR1 biofilm i rumstemperatur; men olika rum temperaturer kan påverka tillväxten. Därför är det viktigt att använda optisk imaging för att förstå om biofilmen är redo innan du fortsätter till ToF-SIMS analys. Likaså kräver olika bakteriestammar olika odlingsbetingels…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma till Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) jorden och biologiska vetenskaper (EBD) uppdrag utsäde laboratorium riktad forskning och utveckling (LDRD) fonden för stöd. Instrumental tillträde lämnades genom W. R. Wiley miljömässiga Molecular Sciences laboratorium (EMSL) allmänna användaren förslag. Nationella vetenskapliga användaren är EMSL sponsrad av Office av biologiska och miljömässiga forskning (BER) på PNNL. Författarna tackar Dr. Yuanzhao Ding för bevis läsa manuskriptet och ge värdefull feedback. PNNL drivs av Battelle för DOE under kontrakt DE-AC05-76RL01830.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |