تقدم هذه المقالة طريقة لزراعة بيوفيلم في الموقع وقت الطيران الثانوية أيون الطيف الكتلي لتمكين بمفاعل موائع جزيئية، نظام للتحليل في “الواجهة فراغ” السائل تعيين الكيميائية في حالته رطب،. السيد أونيدينسيس شيوانيلا -1 مع البروتينات الفلورية الخضراء كنموذج.
الأغشية الحيوية البكتيرية هي المجتمعات المحلية المرتبطة بالسطحية التي تجري دراستها إلى حد كبير على فهم تلك المواد البوليمرية خارج الخلية المنتجة ذاتيا (EPS) وأدوارها في الميكروبيولوجيا البيئية. تحدد هذه الدراسة أسلوباً لزراعة بيوفيلم المرفق إلى النظام للتحليل في واجهة فراغ السائل (سالفي) وتحقيق في الموقع الكيميائية تعيين بيوفيلم الحية بوقت الطيران الثانوية أيون الطيف الكتلي (ToF-سيمز). ويتم هذا عن طريق استزراع البكتيريا خارج وداخل القناة سالفي مع الإعداد المتخصصة لدينا على حد سواء، فضلا عن تقنيات التصوير الضوئي للكشف عن وجود بيوفيلم وسمك قبل تحليل ToF-سيمز. إظهار النتائج قمم بيوفيلم شيوانيلا المميزة في حالته المائية الطبيعية، تسليط الضوء على بناء بيئة الكتل المائية المترجمة، فضلا عن EPS الشظايا، التي تختلف اختلافاً جذريا عن بيوفيلم نفسه المجففة الدولة. وتبين هذه النتائج قدرة اختراق سالفي الذي يسمح للتصوير في الموقع بيوفيلم مع أداة تصوير كيميائية المستندة إلى فراغ.
الأغشية الحيوية البكتيرية هي المجتمعات المحلية المرتبطة بالسطحية التي تطورت على مر الزمن كدفاع للبكتيريا البقاء على قيد الحياة متفاوتة المحفزات المادية والميكانيكية الضارة، حيث خلايا قادرة على إرفاق والبقاء على قيد الحياة في العديد من البيئات الممكنة. 1 , 2 الأغشية الحيوية يجري التحقيق فيها إلى حد كبير، وأن تكون لها تطبيقات في العديد من المجالات مثل الطب الحيوي والهندسة الطبية الحيوية، والزراعة، والبحوث الصناعية والتنمية. 1 , 2 فهم التعيين الكيميائية هذه المجتمعات الميكروبية المعقدة، بما في ذلك تلك المواد البوليمرية خارج الخلية المنتجة ذاتيا (EPS) وبيئتها الكتلة المائية المحلية، أمر ضروري للحصول على نحو دقيق ومفصل تصوير أنشطتهم البيولوجية. 2
الأغشية الحيوية موجودة وتنمو داخل دولة رطب جداً. هذا يمثل تحديا كبيرا في استخدام تقنيات التحليل السطحي القائم على فراغ مثل وقت الطيران الثانوية أيون الطيف الكتلي (ToF-سيمز) بسبب الصعوبة في دراسة السوائل المتطايرة في فراغ. نتيجة لذلك كانت تقنيات التحليل السطحي القائم على فراغ محدودة تقريبا حصرا لدراسة عينات بيوفيلم فقط حالتها المجففة. ومع ذلك، دراسة بيوفيلم في حالته المجففة يحول دون التحقيق المكروية البيولوجية الحقيقية دقة. غالباً ما يسبب تغييرات جذرية مورفولوجية النزاهة وبيوفيلم EPS، الذي أثبت بعد مقارنة النتائج الجماعية الطيفية بيوفيلم الجافة للدراسات السائلة في الموقع . 3 , 4 تقدم هذه المقالة حلاً لدراسة الأغشية الحيوية داخل دولتهم المائية الطبيعية باستخدام استخدام نظامنا للتحليل في السائل الفراغ واجهة (سالفي)،5،6 مفاعل موائع جزيئية أن تحتوي على سائل تحت لها غشاء نتريد (سين) رقيقة السليكون في microchannel مصنوعة من بولي دايمثيل سيلوكسان (تطويره)، مما يوفر إمكانية الوصول المباشر إلى شعاع مسبار أيون الثانوية مع الحفاظ على سلامة هيكل المصفوفة السائل داخل فراغ الدائرة. 7 , 8
أونيدينسيس س. اختير السيد-1 تحور للتعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) ككائن نموذج لهذا التوضيح بيوفيلم الداخلي نظراً لتعدد التمثيل الغذائي والاستخدام الشائع في الميكروبيولوجيا البيئية والتطبيقية، الذي يستند إلى بشدة على قدرتها فريدة من نوعها للحد من المعادن ونقل الإلكترون خارج الخلية. 9 , 10 , 11 بالإضافة إلى ذلك، يسمح وجود بروتينات فلورية خضراء لسمك بيوفيلم المستمر سهل الرصد عن طريق الفحص المجهري الأسفار، باستخدام عامل تصفية fluorescein isothiocyanate (فيتك). وقد أظهرت دراساتنا السابقة أدلة على هذه البكتيريا التي تحابي مرفق للإطار الخطيئة باستخدام في أوبيراندو تصوير الأسفار لنمو بيوفيلم بسماكة تصل إلى 100 ميكرومتر. 4 , 12 بينما فقط ستناقش هذه الورقة تأكيد الوجود بيوفيلم من خلال الفحص المجهري الأسفار، سالفي متوافق مع غيرها من أساليب التصوير الضوئية مثل القرار فائقة تصوير الأسفار (أي منظم الإضاءة الفحص المجهري (SIM)9) والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (كلسم) التصوير4). التصوير البصري يمكن أن تستخدم لقياس سمك بيوفيلم، والحصول على صورة ثلاثية الأبعاد لشكل بيوفيلم كما يبدو، يؤكد سمك وتمسكها بالإطار الخطيئة. 9 “بروتينات فلورية خضراء بينما” كان يستخدم في تحليل سيمز، س. أونيدينسيس دون بروتينات فلورية خضراء كهذا القياس المطلوب فقط من الكثافة الضوئية لمنحنى النمو، ولا تحتاج إلى أي تصوير فلوري. عموما، معلم الفرق بين التجارة والنقل، والأنواع غير المميزة في منحنى النمو غير ذي بال. بالإضافة إلى ذلك، بينما يستخدم هذا البروتوكول “بروتينات فلورية خضراء” 1 السيد س. أونيدينسيس ككائن نموذج لوصف الإجراء، يهدف هذا الإجراء لأي السلالة البكتيرية التي قد تكون هناك حاجة لزراعة داخل سالفي. على الرغم من ذلك، نظراً للمعرفة للسلالة البكتيرية اللازمة، قد تحتاج بعض شروط النمو مثل الوقت ودرجة الحرارة والبيئة الأوكسجين إلى تعديل لاستيعاب سلالة البكتيريا لاستخدامها. للمتوسطة النمو، يستخدم هذا الإجراء مرق الصويا متوسطة، تريبتيك “أسلاك” (TSB) دون سكر العنب، وفول الصويا تريبتيك أجار (TSA) دون سكر العنب لاستزراع. تكوين “أسلاك” متوسطة وقد وضع خصيصا للنمو والرصد لامتدادات للغشاء وكان بيريبلاسم س. أونيدينسيس التي يبدو أنها تأخذ شكل الأسلاك الصغيرة، وتكوين المتوسطة إنشاء نطاق البحث السابقة. 13 , 14
لدينا بروتوكول السابقة في الموقع سيمز ToF السائل بتوضيح الفائدة التي تقدمها لتجميد البروتين والتمسك الخطيئة، فضلا عن بروتوكول مفصلة بشأن ToF-سيمز التحليل والبيانات الحد سالفي. 12 بدلاً من أن نكرر خطوات الحد من البيانات، سوف تخدم هذه الورقة بدلاً من ذلك التركيز على نهج فريد لإعداد وزراعة الأغشية الحيوية داخل microchannel سالفي لدينا، فضلا عن خطوات التصوير للكشف عن وجود بيوفيلم وسمك السابقة لتحليل ToF-سيمز. وبينما كانت سابقا محدودة الأغشية الحيوية تجفف العينات داخل الدائرة بتقنيات التحليل السطحي القائم على فراغ فقط، يمكن الآن الحصول EPS وبيوفيلم الكيميائية رسم خرائط تفصيلية للأغشية الحيوية الحية في الموقع بسبب هذه القدرة الجديدة.
بعد تطعيم المرحلة سجل، من المهم لاختبار العدد من الأيام ودرجة الحرارة التي ينبغي أن ينمو بيوفيلم قبل أن تكون سليمة وسميكة ما يكفي للتصوير، كما هو موضح في الخطوة 3، 1. ويشمل هذا الإجراء على وجه التحديد استزراع. س. أونيدينسيس بيوفيلم MR1 في درجة حرارة الغرفة؛ ومع ذلك يمكن أن تؤثر درجة حرارة الغر…
The authors have nothing to disclose.
ونحن ممتنون للمختبر الوطني شمال غرب المحيط الهادئ (بننل) الأرض والعلوم البيولوجية (EBD) بعثة بذور “مختبر البحوث الموجهة” والتنمية (لدرد) الصندوق للدعم. الوصول الآلي قدمت من خلال “اقتراح المستخدم العام جورج ر. إيلي البيئية الجزيئي علوم المختبرات” (امسل). امسل منشأة مستخدم علمية وطنية برعاية “مكتب البيولوجية” والبحوث البيئية (البر) في بننل. يشكر المؤلفون الدكتور دينغ يوانزاو لإثبات قراءة المخطوط وتوفير تغذية مرتدة مفيدة. وتتولى بننل Battelle للكيان التشغيلي المعين تحت العقد دي-AC05-76RL01830.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |