Эта статья представляет метод для выращивания биопленки в situ время полета вторичной ионной масс-спектрометрии для химического сопоставления в своем гидратированных состоянии, активизируемые microfluidic реактора, системы для анализа на интерфейсе жидкий вакуум. Shewanella oneidensis -MR-1 с зеленым флуоресцирование белками использовался в качестве модели.
Бактериальные биопленки, поверхность ассоциированных сообществ, которые значительно учился понимать их собственного производства внеклеточного полимерных веществ (EPS) и их роли в микробиологии окружающей среды. Это исследование описывает метод культивировать биопленки привязанность к системе для анализа в жидкий вакуум интерфейс (Сальви) и достичь в situ химического сопоставления жизни биопленки, время полета вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS). Это делается путем культивирования бактерий как снаружи, так и внутри Сальви канал с нашей специализированной установки, а также оптические методы обработки изображений для обнаружения присутствия биопленки и толщина до анализа ToF-SIMS. Наши результаты показывают характеристика вершины Shewanella биопленки в своем естественном состоянии гидратированных, подчеркнув его локализованные водных кластеров окружающей среды, а также EPS фрагменты, которые резко отличаются от же биопленки обезвоженные состояние. Эти результаты демонстрируют возможности прорыва Сальви, что позволяет в situ биопленки изображений с вакуум основе химических изображений инструмент.
Бактериальные биопленки, поверхность ассоциированных сообществ, которые развивались с течением времени как обороны для бактерий, чтобы выжить, различных неблагоприятных физических и механических раздражителей, которой клетки способны вложить и выжить во многих возможных средах. 1 , 2 биоплёнки значительно исследованы и имеют применение во многих областях, таких как биомедицина, биомедицинской инженерии, сельское хозяйство и промышленных исследований и разработок. 1 , 2 понимание химического сопоставления этих сложных микробных общин, включая их собственного производства внеклеточного полимерных веществ (EPS) и их местные воды в кластерной среде, имеет важное значение для получения точной и подробной Описание их деятельности в биологической области. 2
Биоплёнки существовать и развиваться в рамках сильно увлажненной государства. Это представляет большой проблемой при использовании вакуум-на основе анализа поверхности методы, такие как время полета вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS) из-за трудности в изучении летучих жидкостей в вакууме. В результате вакуум-на основе анализа поверхности методы были ограничены почти исключительно для изучения биопленки образцы только их сушеные штата. Однако изучая биопленки в состоянии сушеные препятствует точной расследование его истинное биологических микроокружения. Это часто вызывает радикальные изменения в EPS целостности и биопленки морфологии, которая была продемонстрирована после сравнения сухой биопленки массы спектральных результаты в situ жидкого исследования. 3 , 4 эта статья представляет собой решение для изучения биопленки в их естественном состоянии, увлажненной, используя использования нашей системы для анализа в жидкий вакуум интерфейс (Сальви),5,6 microfluidic реактора, содержит жидкость под ее тонкий кремния нитрид (SiN) мембраны в микроканальные из полидиметилсилоксан (PMDS), таким образом обеспечивая прямой доступ к Луч зонд вторичных ионов при сохранении структурной целостности жидкие матрицы в вакууме камеры. 7 , 8
S. oneidensis мутировал выразить зеленый флуоресценции белков (ГПУП) MR-1 был выбран в качестве модельного организма для этой процедуры иллюстрации биопленки благодаря метаболических универсальность и общего пользования в экологических и прикладной микробиологии, который был основан сильно на ее уникальной способностью для металлических сокращения и передачи внеклеточных электрона. 9 , 10 , 11 Кроме того, присутствие GFP позволило легко непрерывной биопленки толщина мониторинга через микроскопии флуоресцирования, используя фильтр флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC). Наши предыдущие исследования показали доказательства этой бактерии пользу привязанность к окну грех, с использованием в operando визуализации флуоресценции для роста биопленки толщиной до 100 мкм. 4 , 12 в то время как этот документ будет обсуждать только подтверждение биопленки в присутствия посредством микроскопии флуоресцирования, Сальви совместим с другими оптических изображений методы, такие как супер резолюции флуоресценции изображений (т.е., структурированного освещения микроскопия (SIM)9) и Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) изображений4). Оптических изображений может служить для измерения толщины биопленки и получить изображение 3D, форма биопленки, как представляется, подтверждает его толщины и его привязанность к окну грех. 9 хотя GFP был использован в анализе SIMS, S. oneidensis без GFP использовался для роста кривой, как только необходимые измерения оптической плотности и не требует каких-либо флуоресцентных изображений. Как правило разница между GFP с тегами и непомеченным видов в кривая роста является незначительным. Кроме того в то время как этот протокол использует S. oneidensis GFP MR-1 в качестве модельного организма для описания процедуры, эта процедура предназначена для любых бактериальный штамм, который могут быть необходимы для выращивания в пределах SALVI. Хотя, учитывая знания бактериальный штамм необходимо, некоторые условия роста, например, времени, температуры и кислорода среды может потребоваться быть изменены для размещения штамм бактерий, которые будут использоваться. Для среднего роста эта процедура использует «нанопроволоки» средний, tryptic соевый бульон (TSB) без декстрозы и tryptic соевый агар (TSA) без декстроза для культивирования. Состав «нанопроволоки» средний специально разработан для роста и для мониторинга расширения мембраны и periplasm S. oneidensis , появляются принимать форму небольших проводов, и средний состав был создана в рамках предыдущих исследований. 13 , 14
Наш предыдущий протокол в situ жидкого ToF-SIMS продемонстрировал преимущество что Сальви предлагает для иммобилизации белков и привязанность к грех, а также подробный протокол на ToF-SIMS анализа и данных сокращения. 12 вместо того, чтобы подтвердить данные этапов сокращения, этот документ будет служить вместо этого сосредоточить внимание на уникальный подход, создание и выращивание биопленки в рамках нашей микроканальные Сальви, а также изображений шаги для обнаружения присутствия биопленки и толщина предварительного для анализа ToF-SIMS. В то время как биопленки ранее были ограничены только высушено образцов в рамках палаты поверхности аналитические методы, основанные на вакуум, детальное EPS и биопленки химическое картирование живой биоплёнки теперь могут быть получены, на месте из-за этой новой возможности.
После прививки в лаг фазы, важно проверить количество дней и температуры, при котором биопленки должен расти, прежде чем это здоровым и достаточно толстым для изображений, как описано в пункте 3.1. Эта процедура конкретно охватывает выращивание S. oneidensis MR1 биопленки при комнатной температ…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Тихоокеанская северо-западная Национальная лаборатория (PNNL) земли и биологических наук (EBD) Миссия семян лаборатории направлены фонд научных исследований и развития (МЦРУ) для поддержки. Инструментальный доступ обеспечивается через общее предложение пользователя W. р Уили экологических молекулярных наук лаборатории (ЛСМЭ). ЛСМЭ является объектом национальной научной пользователя под эгидой Бюро биологических и экологических исследований (BER) в PNNL. Авторы благодарят доктор Дин Yuanzhao за доказательство читать рукопись и обеспечения полезной обратной связи. PNNL эксплуатируется Battelle для Доу под контракт де-AC05-76RL01830.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |