Bu makale bir biyofilm in situ uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi sulu durumda, kimyasal eşleştirmesi bir mikrosıvısal reaktör, sıvı vakum arabirimi analiz için sistemi tarafından etkinleştirilmiş için için büyüyen bir yöntem sunar. Shewanella Corynebacterium Bay-1 yeşil Floresans protein ile bir model olarak kullanıldı.
Bakteriyel biyofilmler onların kendi ürettiği ekstraselüler polimer maddeler (EPS) ve çevre Mikrobiyolojisi kendi rollerini anlamak için büyük ölçüde incelendiği yüzey ilişkili topluluklar vardır. Bu çalışmada biyofilm eki için analiz sıvı vakum arabirimi (SALVI) adlı sistemine yetiştirmek ve in situ kimyasal bir yaşam biyofilm eşlenmesinin uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi (ToF-SIMS) elde etmek için bir yöntem özetliyor. Bu bakteri ile bizim özel tertibat SALVI kanal içinde ve dışında kültür aracılığıyla yanı sıra biyofilm varlığı ve kalınlığı ToF-SIMS analiz önce tespit etmek için optik görüntüleme teknikleri aracılığıyla yapılır. Sonuçlarımız Shewanella biyofilm karakteristik doruklarına doğal sulu haliyle göstermek onun yerelleştirilmiş su küme ortamında, hem de EPS vurgulayarak aynı biyofilm’ın büyük ölçüde farklı olan parçaları, sıvı kaybı Devlet. Bu sonuçlar in situ biyofilm görüntüleme için bir vakum tabanlı kimyasal görüntüleme aletle sağlar SALVI atılım kapasitesini gösterir.
Bakteriyel biyofilmler neyin hücreleri eklemek ve birçok olası ortamlarda hayatta edebiliyoruz olumsuz fiziksel ve mekanik uyaranlara değişen hayatta kalmak bakteri için bir savunma olarak zaman içinde geliştiğini yüzey ilişkili topluluklar vardır. 1 , 2 biyofilmler büyük ölçüde incelenmiştir ve Biyomedikal, Biyomedikal Mühendisliği, tarım ve endüstriyel araştırma ve geliştirme gibi birçok alanda uygulamaları vardır. 1 , 2 kimyasal eşleme onların kendi ürettiği ekstraselüler polimer madde (EPS) ve yerel su-küme çevreleri de dahil olmak üzere bu karmaşık mikrobiyal toplulukların anlama doğru kazanıyor esastır ve detaylı biyolojik faaliyetlerini tasviri. 2
Biyofilmler var ve çok sulu bir devlet içinde büyür. Bu vakum uçucu sıvılar eğitim zorluk nedeniyle uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi (ToF-SIMS) gibi vakum tabanlı yüzey analiz teknikleri kullanarak büyük bir meydan okuma sunuyor. Sonuç olarak, vakum tabanlı yüzey analiz teknikleri biyofilm örnekleri kurutulmuş durumlarına, neredeyse sadece eğitim için sınırlı olmuştur. Ancak, bir biyofilm kurutulmuş haliyle okuyan onun gerçek biyolojik microenvironment doğru incelenmesi engeller. Bu kez situ içinde sıvı çalışmaları için Kuru biyofilm kitle spektral sonuçları karşılaştırarak sonra gösterdi EPS bütünlüğü ve biyofilm Morfoloji, köklü değişikliklere neden olur. 3 , 4 bu makale biyofilmler onların doğal sulu devlet içinde bizim sistem kullanım analizi, sıvı vakum arabirimi (SALVI),5,6 mikrosıvısal reaktör için istihdam ederek eğitim için bir çözüm sunar bu Böylece hala bir vakum içinde sıvı matris yapısal bütünlüğünü koruyarak ikincil iyon sonda ışın doğrudan erişim sağlayan polydimethylsiloxane (PMDS), yapılan bir microchannel onun ince silikon Nitrür (günah) membran altında sıvı içerir odası. 7 , 8
S. Corynebacterium Bay-1 yeşil Floresans protein (GFP) hızlı mutasyona metabolik çok yönlülük ve dayanıyordu çevre ve uygulamalı Mikrobiyoloji içinde yaygın kullanımı nedeniyle bu biyofilm yordamı illüstrasyon için bir model organizma olarak seçildi ağır metal azaltma ve ekstraselüler elektron transferi için kendi benzersiz yeteneğini. 9 , 10 , 11 Ayrıca, GFP varlığı kolay sürekli biyofilm-Floresans mikroskobu ile izleme, floresein isothiocyanate (FITC) filtre kullanarak kalınlığı için izin. Bizim önceki çalışmalar bu bakteri operando içinde Floresans Imaging’i kullanma ilâ 100 mikrometre kalınlığında bir biyofilm büyümesi için günah penceresine ek lehine kanıt göstermiştir. 4 , 12 bu kağıt sadece onay Floresans mikroskobu aracılığıyla biyofilm’ın varlığının ele alınacak, SALVI süper çözünürlük gibi diğer optik görüntüleme yöntemleri ile uyumlu iken Floresans görüntüleme (yani, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)9) ve confocal lazer mikroskobu (CLSM)4Imaging tarama). Optik görüntü biyofilm kalınlığını ölçmek için hizmet ve göründüğü kalınlığı ve onun eki günah penceresine onaylayan bir 3D görüntü, biyofilm şeklinde elde edilir. 9 iken GFP SIMS analizde kullanılan, Corynebacterium S. GFP olmadan büyüme eğrisi için optik yoğunluk bu tek gerekli ölçüyü kullanıldı ve floresan herhangi bir görüntüleme gerek yoktu. Genel olarak, GFP arasındaki farkı öğesini ve büyüme eğrisi etiketsiz türler önemsizdir. Ayrıca, bu iletişim kuralını yordamı açıklamak için bir model organizma S. Corynebacterium Bay-1 GFP kullanırken bu yordamı SALVI içinde ekimi için gerekli olabilir bakteriyel herhangi bir zorlanma için tasarlanmıştır. Rağmen bilgi gerekli bakteri baskı göz önüne alındığında, süresi, sıcaklık ve oksijen çevre gibi bazı büyüme koşullar kullanılmak üzere bakteri suşu içerecek şekilde değişiklik yapmanız gerekebilir. Büyüme orta için kültür için “nanowires” orta, tryptic soya suyu (TSB) dekstroz ve tryptic soya agar (TSA) dekstroz olmadan olmadan bu yordamı kullanır. “Nanowires” orta kompozisyon özel olarak büyüme ve membran uzantıları izleme için formüle edilmiştir ve küçük tel ve orta kompozisyon şekillenmeye görünen S. Corynebacterium periplasm oldu önceki araştırma içinde kurulan. 13 , 14
Situ üzerinde bizim önceki iletişim kuralı sıvı ToF-SIMS SALVI protein immobilizasyon ve günah, hem de detaylı bir protokol ToF-SIMS analiz ve veri azaltma eki için sunabileceği yarar resimli. 12 veri azaltma adımları yinelemek yerine, bu kağıt kurma ve biyofilmler bizim SALVI microchannel yanı sıra biyofilm varlığı ve kalınlığı önceden tespit etmek için görüntüleme adımları içinde yetiştirilmesi benzersiz bir yaklaşım yerine odaklanmak için görev yapacak ToF-SIMS analiz için. Biyofilmler daha önce örnekleri vakum tabanlı yüzey analitik teknikler TMMOB içinde sadece kurutulmuş için sınırlı sahip iken, canlı biyofilmler detaylı EPS ve biyofilm kimyasal eşleme şimdi in situ bu yeni özellik nedeniyle elde edilebilir.
Günlük-aşamasında aşı sonra gün ve 3.1 adımda anlatıldığı gibi sağlıklı ve görüntüleme için kalın önce hangi biyofilm büyümesini sıcaklık test etmek önemlidir. Bu yordam özellikle S. Corynebacterium MR1 biyofilm oda sıcaklığında kültür kapsar; ancak farklı oda sıcaklığında büyüme oranının etkisi altına alabiliyor. Bu nedenle, bu biyofilm ToF-SIMS analize devam etmeden önce hazır olup olmadığını anlamak için optik görüntüleme kullanmak önemlidir. Benzer şekilde, farkl…
The authors have nothing to disclose.
Destek için Pacific Northwest Ulusal Laboratuvarı (PNNL) toprak ve Biyolojik Bilimler (EBD) misyonu tohum laboratuvar yönelik araştırma ve geliştirme (LDRD) Fonu için sana şükrediyoruz. Enstrümantal erişim bir W. R. Wiley çevre moleküler Bilimleri Laboratuvarı (EMSL) genel kullanıcı öneri ile sağlandı. EMSL sponsor tarafından Office biyolojik ve çevresel araştırma (BER) PNNL adlı bir Ulusal Bilimsel kullanıcı tesisidir. Yazarlar Dr Yuanzhao Ding el yazması okuma ve yararlı geribildirim sağlama ispat için teşekkür ederiz. PNNL için sözleşme DE-AC05-76RL01830 altında DOE Battelle tarafından işletilmektedir.
ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
-80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |