Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrofluid Bioprinting for Engineering vaskulariserede væv og Organoids

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55957
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,3
1Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 3Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

Vi leverer en generaliseret protokol baseret på en mikrofluid bioprinting strategi for engineering en microfibrous vaskulære seng, hvor en secondary celletype kunne blive yderligere seedede i det interstitielle rum af denne microfibrous struktur til at generere vaskulariserede væv og organoids.

Abstract

Engineering vaskulariserede væv konstruktioner og organoids har været historisk udfordrende. Her beskriver vi en roman metode baseret på mikrofluid bioprinting til at generere et stillads med flerlaget interlacing hydrogel mikrofibre. For at opnå glat var bioprinting, en kerne-kappe mikrofluid printhovedet med en composite bioink formulering ekstruderet fra core flow og den crosslinking løsning udført af kappe flow, designet og monteres på bioprinter. Ved at blande gelatine methacryloyl (GelMA) med natriumalginat, en polysaccharid, der undergår øjeblikkelig ionisk crosslinking i Vælg divalent ioner, efterfulgt af en sekundær photocrosslinking i komponenten GelMA at opnå permanent stabilisering, en microfibrous stillads kunne være opnået ved hjælp af denne bioprinting strategi. Vigtigere, kan endotelceller indkapslet inde bioprinted mikrofibre danne lumen-lignende strukturer, der ligner Vaskulaturen i løbet af kultur i 16 dage. Endothelialized microfibrous stillads kan bruges yderligere som en vaskulær seng til at konstruere en vaskulariserede væv gennem efterfølgende såning af typen secondary celle i det interstitielle rum af af mikrofibre. Mikrofluid bioprinting giver en generel strategi i praktisk engineering af vaskulariserede væv på high fidelity.

Introduction

Tissue engineering mål at skabe funktionelle væv erstatninger, der kan bruges til at udskifte, genoprette eller forøge de tilskadekomne eller syge i den menneskelige krop1,2,3,4, ofte gennem en kombination af ønskede celletyper, bioaktive molekyler5,6, og biomaterialer7,8,9,10. Mere nylig, tissue engineering teknologier er også i stigende grad vedtaget for at generere in vitro- væv og orgel modeller, der efterligner de vigtige funktioner i deres i vivo modparter, til applikationer såsom udvikling af lægemidler, i stedet for de konventionelle forenklede planar celle kulturer11,12,13,14,15,16,17,18,19. I begge situationer, evne til at sammenfatte de komplekse mikroarkitektur og hierarkisk struktur af de humane væv er kritisk i at aktivere funktionaliteten af manipuleret væv10, og navnlig, måder at integrere en vaskulære netværk i manipuleret væv efterspørgslen siden vascularization præsenterer en af de største udfordringer til felt20,21,22,23.

Til dato, en række forskellige metoder er blevet udviklet i denne henseende i et forsøg på at opbygge strukturer, blodkar i manipuleret væv konstruktioner med forskellige grader af succes8. For eksempel, samlesæt i endothelial celler giver mulighed for generation af mikrovaskulære netværk24; levering af angiogene vækstfaktorer inducerer vedvarende neovascularization25,26; Brug af vaskulære stamceller og pericytes letter endotel cellevækst og forsamling24,27; designe stillads egenskaber giver præcise graduering af vascularization28,29; og celle ark teknologi giver mulighed for bekvem manipulation af vaskulære lagdeling30. Disse strategier dog ikke begave evne til at kontrollere den rumlige mønstre af Vaskulaturen, ofte fører til tilfældige fordeling af blod fartøjer inden for en manipuleret væv konstruere og dermed begrænsede reproducerbarhed. I løbet af de sidste par år opstået bioprinting som en klasse af teknologier til løsning af sådan en udfordring på grund af deres enestående alsidighed af deponeringen komplekse væv mønstre på high fidelity og reproducerbarhed i en automatiseret eller semi-automatiseret måde31,32,33. Hellige bioprinting34,35,36,37,38, integrerede bioprinting39,40,41, og hule struktur bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 har alle udvist gennemførligheden af generering af vaskulær eller vaskulariserede væv.

Alternativt, en mikrofluid bioprinting strategi at fabrikere microfibrous stilladser har udviklet for nylig, hvor en hybrid bioink sammensat af natriumalginat og gelatine methacryloyl (GelMA) blev leveret gennem kernen i en koncentrisk printhoved og en calciumchlorid (CaCl2) løsning blev gennemført den ydre kappe flow af printhovedet54,55. Co ekstrudering af de to strømme tilladt for umiddelbare fysiske crosslinking af komponenten calciumalginat til aktiverer microfiber dannelse, mens efterfølgende photocrosslinking sikres permanent stabilisering af flere lag microfibrous stillads. Af note fandtes endotelceller indkapslet i bioprinted mikrofibre til at formere sig og vandrer mod periferier af mikrofibre antager lumen-lignende strukturer, der efterlignede de vaskulære bed54,55. Disse bioprinted, endothelialized vaskulære senge kunne være senere befolket med ønskede sekundære celletyper til yderligere konstruere vaskulariserede væv55. Denne protokol giver således en detaljeret procedure for sådan en mikrofluid bioprinting strategi aktiveret tilsigtet koncentriske dyse, som sikrer bekvem fabrikation af vaskulariserede væv for potentielle anvendelser i både vævsmanipulering og organoid modellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Neonatal rotte cardiomyocytes anvendes i denne protokol blev isoleret fra 2 dage gamle Sprague-Dawley rotter efter en veletableret procedure56 godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på Brigham and Women's Hospital.

1. instrumentering af Bioprinter

  1. Indsætte en mindre stumpt nål (f.eks., 27 G, 1 tomme) som kernen i centrum af en større stump nål (f.eks., 18 G, ½ tomme) som kappe at konstruere dual-layer, koncentriske mikrofluid printhovedet; Kontroller, at kerne nålen fremspringende lidt (~ 1 mm) længere end yderstof (fig. 1A). Justeringen er normalt justeret manuelt, men hvis nødvendigt afstandsstykker af passende størrelser kan være tidsligt klemt mellem de indre/ydre nåle på spidsen og tønde siderne til at bistå koncentriske justering. Forsegle krydset af tønder med epoxy lim og fjerne justering spacere fra spidsen side når det er relevant.
  2. Indsæt en anden nål (23G) i tønde af centrale nålen i den modsatte retning.  Derefter generere et hul på siden af tønden af den ydre nål og indsætte en metal stik af matchende størrelse ind i hullet, efterfulgt af forsegling med epoxy lim.
  3. Tilslut indløb af printhovedet til en dual-channel sprøjten pumpe til injektion af bioink og crosslinking løsningen, individuelt, via to PVC rør. Montere ekstruder på hovedet af en bioprinter ved hjælp af en plastik indehaveren af poly(methyl methacrylate) (PMMA).
    Bemærk: Bioprinter valg afhænger af tilgængeligheden. I vores tilfælde, har vi med succes testet denne opsætning på flere kommercielt tilgængelige bioprinters. Enhver bioprinter, der er udstyret med et x-y-z motoriserede stadium bør dog i princippet muligt integration af denne mikrofluid printhovedet.

2. Bioprinting Microfibrous vaskulære Bed

  1. Foretage bioink ved hjælp af en blanding af natriumalginat (4 w/v%, lav viskositet), gelatine methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58, og photoinitiator Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) opløses i 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] Ethan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (HEPES buffer, pH 7,4) indeholdende 10 vol.% føtal bovint serum (FBS).
  2. Gør en løsning af 0,3-M CaCl2 i HEPES buffer indeholdende 10 vol.% FBS som crosslinking carrier væske.
  3. Umiddelbart før bioprinting, adskille menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVECs) fra kolberne ved hjælp af behandling af 0,05 w/v% trypsin i 5-10 min. og resuspend celler i bioink i en koncentration på 5-10 × 106 celler/mL. Afpipetteres suspension langsomt 5 til 10 gange homogen fordeling.
  4. Start injektion af bioink/crosslinking væske ved hjælp af en dual-channel sprøjten pumpe på 5 µL/mL samme strømningshastigheder. Strømme kan få lov at køre kontinuerligt for op til 1 min, indtil de stabilisere. Efterfølgende indlede bevægelse af printhovedet ved at kontrollere bioprinter på en deposition hastighed på ca 4 mm/s (figur 1B). Disse hastigheder kan brug for fine tuning med hver ny opsætning for at sikre optimal bioprinting. Bioprinting processen er normalt foretages ved stuetemperatur (21-25 ° C), men denne temperatur kan ændres. Bioprinting processen bør give mulighed for hurtig Ioniske gellation af komponenten calciumalginat og aflejring af et microfibrous stillads (figur 1B).
  5. Efter skafottet er bioprinted, opnå kemiske gellation af yderligere photocrosslinking GelMA-komponent på ca 5-10 mW/cm2 af UV-lys (360-480 nm) for 20-30 s (figur 1C).
  6. Efter bioprinting og den crosslinking, skylles forsigtigt stillads med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til at fjerne den overskydende CaCl2. Kultur HUVECs-laden microfibrous stillads i endothelial celle vækstmedium (EGM) i en inkubator ved 37 ° C og 5 vol.% CO2 i op til 16 dage med medium ændret mindst hver 2 dage. Overvåge morfologier af HUVECs under et mikroskop periode kultur.

3. opbygge vaskulariserede væv

  1. Når HUVECs har migreret til periferier af mikrofibre i stillads til at danne lumen-lignende strukturer (fig. 1D), hente til skafottet og forsigtigt placere det på overfladen af en hydrofobe overflade (fx, en plade af polymethylsiloxane [PDMS]). Brug et stykke sterilt filtrerpapir omhyggeligt fjerne alle medium fra det interstitielle rum af stillads med kapillar kraft.
  2. Straks tilføje en dråbe (ca 20-40 µL) af suspensionen af en secondary celletype (f.eks., cardiomyocytes) i medium med en tæthed på 1-10 × 106 celler/mL på toppen af stillads, som skal infiltrere det hele interstitielle rum af stillads (figur 1E). Inkuber sådan konfiguration i en inkubator (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% relativ luftfugtighed) til 0,5 - 2 h til at tillade cellerne til at holde sig på den enkelte mikrofibre. Overvåge Dråbestørrelse over perioden for at sikre, at ingen mærkbar fordampning er observeret.
  3. Forsigtigt vaske stilladser ved omrystning i en PBS bad til at fjerne enhver ikke-tilhænger celler og kultur konstruktionen i relevante medium, indtil den ønskede vaskulariserede væv er dannet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikrofluid bioprinting strategi giver mulighed for direkte ekstrudering bioprinting af microfibrous stilladser med lav viskositet bioinks54,55. Som illustreret i figur 2A, et stillads med en størrelse på 6 × 6 × 6 mm3 indeholdende > 30 lag af mikrofibre kunne være bioprinted i 10 min. Den umiddelbare ionisk crosslinking af komponenten calciumalginat med CaCl2 tilladt for fremragende strukturelle integritet under bioprinting processen mens de efterfølgende fysiske photocrosslinking i komponenten GelMA sikret langsigtet stabilitet af bioprinted microfibrous stillads, som anført i ovenfra og sidekig vist i tal 2B og 2 C. Mikrofibre opnået i denne sag under de bioprinting betingelserne angivet i protokollen, var ca 100-150 µm i diameter, som ønsker lidt stigning overarbejde med hævelse.

Bioprinting proces, herunder mikrofluid ekstrudering af bioink, den ioniske crosslinking og photocrosslinking, påvirkede ikke væsentligt de indkapslede HUVECs levedygtighed. Cellerne kan opretholde en forholdsvis høj rentabilitet af > 80% efter afslutningen af alle disse procedurer (fig. 2D). Som rapporteret tidligere54,55, kunne HUVECs gradvist formere sig og vandrer i mikrofibre fra den oprindeligt tilfældige fordeling på dag 0 (figur 2E) til periferier af mikrofibre til at påtage sig lumen-lignende strukturer på dag 16 indlæg-bioprinting i kultur (figur 2F). Sådan adfærd, observeret for HUVECs var sandsynligvis på grund af den iboende interface-drevet tendens i endothelial celler samt den højere tilgængelighed af næringsstoffer og ilt omkring mikrofibre end i deres interiør55,59.

Microfibrous stillads kan også fungere som en standalone platform for vævsmanipulering. Ved hjælp af myokardiet væv som et eksempel, var neonatal rotte cardiomyocytes seedet til det interstitielle rum af et bioprinted stillads med en tæthed på 5 × 106 celler/mL og kulturperler i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10 vol.% FBS. Mediet blev ændret dagligt i de første 2-3 dage indtil cardiomyocytes begyndte at slå, hvorefter kun ½ medium blev udvekslet hver 2-3 dage55,60,61,62. Cellerne kunne opretholde deres spontane og synkroniseret slå for op til 9-28 dage afhængigt af celle kilde og konfiguration af stilladser55. Den modne cardiomyocytes på skafottet viste også stærk udtryk for funktionelle hjerte biomarkører som illustreret i Konfokal fluorescens billeder i figur 3, herunder sarcomeric α-actinin (fig. 3B) og connexin-43 (figur 3C).

Ved at kombinere i endothelial celler og secondary celletype, kunne en vaskulariserede væv yderligere konstrueres. Igen, med myokardiet som eksempel, efter den vaskulære seng har dannet i en bioprinted microfibrous stillads efter ca 16 dage af kultur, neonatal rotte cardiomyocytes blev efterfølgende seedede i det interstitielle rum af skafottet. Efter dyrkning og modning i et fælles medium bestående af 1:1-diskenhed ration af EGM:DMDM, kunne en endothelialized Myokardie væv dannes udstiller spontan og synkrone slå55. Single-plane Konfokal fluorescens billeder i figur 4 yderligere afsløret sameksistens af både celletyper, med HUVECs hovedsagelig findes i grænserne af mikrofibre (fig. 4B) og cardiomyocytes omkring udendørsbrug af mikrofibre (fig. 4C).

Figure 1
Figur 1 : Mikrofluid Bioprinting strategi til at generere vaskulariserede væv konstruerer.
(A) Design af kerne-kappe koaksial printhovedet for Co ekstrudering af den sammensatte bioink og CaCl2. (B-E) Skemaer viser proceduren fabrikation af en vaskulariserede væv opbygge. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Ref.55. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Bioprinting Microfibrous vaskulære sengen.
(A) fotografi viser en bioprinted 30-lag microfibrous stillads. (B, C) Top- og udsigt over micrographs viser en bioprinted stillads. (D) levedygtighed af HUVECs lastet i et bioprinted microfibrous stillads. Grøn og rød angiver levende og døde celler, henholdsvis. (E, F) Fluorescens micrographs viser organisation af grønne fuorescent protein (NGL)-HUVECs i bioprinted mikrofibre på dag 0 og dag 16 post bioprinting, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Efterfølgende vækst af Cardiomyocytes på Bioprinted Microfibrous stillads.
Fluorescens micrographs viser (A) kerner, (B) sarcomeric α-actinin, (C) connexin-43 og (D) overlejring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Konstruktion af Endothelialized Myokardie væv.
Fluorescens micrographs viser (A) kerner, (B) NGL-HUVECs, (C) f-actin af både HUVECs og cardiomyocytes, og (D) overlejring. Indsatser i D viser en lavere forstørrelse billede af den endothelialized Myokardie væv. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende datasæt.
En prøve G-kode fil til bioprinting en 6 × 6 mm2 firkantet gitter med 220 µm afstanden mellem tilstødende mikrofibre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Opførelsen af co-axial printhovedet er et kritisk skridt mod vellykket mikrofluid bioprinting at tillade samtidige levering af både bioink fra kernen og crosslinking agenten fra kappe. Mens i denne protokol et eksempel printhovedet blev oprettet ved hjælp af en 27G nål som kernen og en 18G nåle som shell, kan den let udvides til en række forskellige kombinationer med forskellige størrelser af nåle. Men ændringen i nål størrelser, hvilket resulterer i ændring i mængden af strøm leveret i hver fase, vil kræve yderligere optimering af strømningshastigheder både bioink crosslinking agent (individuelt justerbar ved hjælp af to sprøjte pumper i stedet for en dual channel) og potentielt også deposition hastighed afholdt af bioprinter.

En kombination af parametre (nål størrelser, strømningshastigheder og deposition hastighed) i den nuværende protokol førte til bioprinted mikrofibre med en diameter på cirka 120 µm umiddelbart efter deposition, der ville svulme op til omtrent 150 µm efter ækvilibrering i medium55. Sådan en størrelse også nogenlunde svarer til lagtykkelse af bioprinted konstruktioner, så der var ingen plads mellem lag af mikrofibre. Diameteren af bioprinted mikrofibre er en funktion af alle tre parametre54,63; størrelsen af core nålen af printhovedet og strømningshastigheden af bioink er positivt korreleret med diameteren af mikrofibre, der henviser til, at størrelsen af kappe nålen, strømningshastigheden af crosslinking agent og deposition hastighed er negativt korreleret med diameteren af af mikrofibre. Kontrol med flytning af printhovedet og/eller den motoriserede stadium vil give mulighed for deposition af microfibrous stilladser af vilkårlige strukturer54,55.

Formuleringen af bioink kan desuden ændre profilen af bioprinting. For eksempel mængden af natriumalginat og GelMA kan være lidt reguleres i overensstemmelse med specifikke programmer, og det er muligt at blande yderligere materiale i bioink, såsom polyethylen glycol-tetraacrylate (PEGTA), der øger mekanik bioprinted mikrofibre40. UV crosslinking bestemmer også de mekaniske egenskaber af center for bioprinted mikrofibre, som yderligere kan påvirke funktionsmåden af de integrerede endotelceller54. De parametre, der er rapporteret i denne protokol var optimeret til HUVECs. Det forventes imidlertid, at for hver forskellig type i endothelial celler crosslinking parametre skal være re optimeret til at opnå lumen dannelse i mikrofibre.

For at frø en secondary celletype på bioprinted vaskulære seng, er det nødvendigt at placere stillads på et stykke af hydrofobe overflade og sikre, at de fleste medium i det interstitielle rum af stillads er fjernet. Dette vil give mulighed for øjeblikkelig infiltration af cellesuspension til microfibrous struktur med slipværktøj selvstændigt og indkapsling skafottet i løbet af såning, maksimere antallet af celler på overfladen af af mikrofibre er knyttet. Selv om en relativt høj tæthed af cardiomyocytes på 5 × 106 celler/mL blev anvendt til at konstruere den Myokardie væv i den nuværende protokol, kan sådanne tæthed vilkårligt tunet til at matche bestemte vævstyper. Det er også afgørende for at opretholde en fugtig miljø, som kan realiseres ved at fylde sterile vand eller PBS i nærheden skafottet (dvs., i de omkringliggende brønde eller plads omkring PDMS slab), at sikre, at den lille mængde substrat for såning ikke fordamper i løbet af såning.

I sammendrag, har vi givet en detaljeret protokol af mikrofluid bioprinting for praktisk fabrikation af vaskulariserede væv. I denne strategi, er en kerne-kappe co-axial printhoved bruges til at aktivere samtidige ekstrudering af en hybrid bioink fra den kerne og crosslinking agent fra kappe. Ved co ekstrudering, bioink gennemgår straks fysiske crosslinking for sin calciumalginat komponent udgør en lagdelt microfibrous stillads som programmeret af bioprinter bevægelse, mens hele konstruktionen er yderligere kemisk photocrosslinked for komponenten GelMA at tillade stabilitet på lang sigt. Endotelceller indkapslet i mikrofibre under bioprinting processen kan formere sig og migrere til periferier antager lumen-lignende strukturer, dreje skafottet i en vaskulær seng. Ved såning en secondary celletype, kan en vaskulariserede væv konstruktion efterfølgende genereret. Denne mikrofluid bioprinting strategi er unik, og bekvemt kan udvides til at omfatte en række forskellige typer væv såsom lever, skelet muskler, og kræft udover myokardiet illustreret i den nuværende protokol, rationel kombination af ønskede celletyper og specielt designet mønstre af bioprinted microfibrous stilladser. Vaskulariserede væv konstruktioner fremstillet med sådan en metode kan anvendes til in vivo vævsregeneration eller in vitro- væv modellering.

Der er flere begrænsninger i forbindelse med den mikrofluid bioprinting strategi er beskrevet i denne protokol. Først, diameteren af bioprinted mikrofibre er begrænset til nogle få hundrede mikrometer på grund af diffusionsspærre af matrixen hydrogel for CaCl2 løsning til effektivt bitmapgenkendelse komponenten natriumalginat i kernen. Alt for lav fysisk crosslinking tæthed ville gøre strukturen multilayer ustabil. For det andet kan den fysiske crosslinking agent for CaCl2 løsning udøve negative virkninger på visse endotel celletyper, der er mere skrøbelige end HUVECs, som i endothelial stamceller. Muligheden for at bruge sådan en bioprinting metode til en bredere vifte af endotel celletyper kan kræve yderligere undersøgelser. Tredje, mens i endothelial celler kan danne lumen-lignende strukturer inden for rammerne af mikrofibre, kerner af disse mikrofibre er ikke hult at aktivere perfusion. Derfor, næringsstoffer og ilt findes stadig hovedsagelig gennem den interstitielle rum i bioprinted stilladser. Tilpasning af opoffrende materialer som photocrosslinkable komponent bioink64 kan løse dette problem i fremtidige versioner af teknologien. Alternativt, bioprinted hule microfibrous strukturer42,43,65,66,67,68 kan bruges som den vaskulære bed for at sikre direkte perfusion af vaskulariserede væv konstruktioner. Sidst, bioprinting af kliniske mellemstore væv kan stadig være udfordrende, som kan sandsynligvis løses ved at indarbejde design af klædt mikrofluid printhoveder69 at opnå udvidet skala bioprinting på høj overførselshastighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne anerkende National Cancer Institute af den nationale institutter sundhed vej til uafhængighed Award (K99CA201603).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alginic acid sodium salt from brown algae Sigma-Aldrich A0682 BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder
Gelatin type A from porcine skin Sigma-Aldrich G2500 Gel strength 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) Sigma-Aldrich 410896 98%
HEPES buffer Sigma-Aldrich H0887 1 M, pH 7.0 - 7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Fetal bovine serum  Thermo Fisher Scientific 10438026 Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 BioXtra, ≥99.0%
Phosphate buffered saline Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4
Human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001 Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)
GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells Angio-Proteomie cAP-0001GFP GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)
Endothelial cell growth medium Lonza CC-3162 EGM-2 BulletKit
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific 12430054 High glucose, HEPES
Sylgard 184 silicone elastomer kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Clear 0.5 kg Kit
UV curing lamp system Excelitas Technologies OmniCure S2000 Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  2. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P., Langer, R. Progress in Tissue Engineering. Sci. Am. 300 (5), 64-71 (2009).
  3. Langer, R. Tissue Engineering: Status and Challenges. E-Biomed: J.Regen. Med. 1 (1), 5-6 (2004).
  4. Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. Engineering Complex Tissues. Sci. Transl. Med. 4 (160), 112 (2012).
  5. Biondi, M., Ungaro, F., Quaglia, F., Netti, P. A. Controlled Drug Delivery in Tissue Engineering. Adv. Drug Del. Rev. 60 (2), 229-242 (2008).
  6. Tayalia, P., Mooney, D. J. Controlled Growth Factor Delivery for Tissue Engineering. Adv. Mater. 21 (32-33), 3269-3285 (2009).
  7. Hubbell, J. A. Biomaterials in Tissue Engineering. Nat. Biotechnol. 13 (6), 565-576 (1995).
  8. Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. Complexity in Biomaterials for Tissue Engineering. Nat. Mater. 8 (6), 457-470 (2009).
  9. Rice, J. J., et al. Engineering the Regenerative Microenvironment with Biomaterials. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 57-71 (2012).
  10. Zhang, Y. S., Xia, Y. Multiple Facets for Extracellular Matrix Mimicking in Regenerative Medicine. Nanomedicine. 10 (5), 689-692 (2015).
  11. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  12. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic Organs-on-Chips. Nat. Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  13. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-Chips at the Frontiers of Drug Discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  14. Zhang, Y. S., Khademhosseini, A. Seeking the Right Context for Evaluating Nanomedicine: From Tissue Models in Petri Dishes to Microfluidic Organs-on-a-Chip. Nanomedicine. 10, 685-688 (2015).
  15. Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., Van Noort, D., Yu, H. Towards a Human-on-Chip: Culturing Multiple Cell Types on a Chip with Compartmentalized Microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
  16. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A Focus on Compartmentalized Microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  17. Sung, J. H., et al. Microfabricated Mammalian Organ Systems and Their Integration into Models of Whole Animals and Humans. Lab Chip. 13 (7), 1201-1212 (2013).
  18. Wikswo, J. P. The Relevance and Potential Roles of Microphysiological Systems in Biology and Medicine. Exp. Biol. Med. 239 (9), 1061-1072 (2014).
  19. Yum, K., Hong, S. G., Healy, K. E., Lee, L. P. Physiologically Relevant Organs on Chips. Biotechnol. J. 9 (1), 16-27 (2014).
  20. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P. D., Soker, S. Principals of Neovascularization for Tissue Engineering. Mol. Aspects Med. 23 (6), 463-483 (2002).
  21. Jain, R. K., Au, P., Tam, J., Duda, D. G., Fukumura, D. Engineering Vascularized Tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 821-823 (2005).
  22. Rouwkema, J., Rivron, N. C., Van Blitterswijk, C. A. Vascularization in Tissue Engineering. Trends Biotechnol. 26 (8), 434-441 (2008).
  23. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Sci. Transl. Med. 4 (160), 123 (2012).
  24. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
  25. Perets, A., et al. Enhancing the Vascularization of Three-Dimensional Porous Alginate Scaffolds by Incorporating Controlled Release Basic Fibroblast Growth Factor Microspheres. J. Biomed. Mater. Res. A. 65 (4), 489-497 (2003).
  26. Davies, N. H., Schmidt, C., Bezuidenhout, D., Zilla, P. Sustaining Neovascularization of a Scaffold through Staged Release of Vascular Endothelial Growth Factor-A and Platelet-Derived Growth Factor-BB. Tissue Eng. A. 18 (1-2), 26-34 (2012).
  27. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Influence of Adult Mesenchymal Stem Cells on in Vitro Vascular Formation. Tissue Eng. A. 15 (7), 1751-1761 (2009).
  28. Quint, C., et al. Decellularized Tissue-Engineered Blood Vessel as an Arterial Conduit. Proct. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (22), 9214-9219 (2011).
  29. Choi, S. -W., Zhang, Y., Macewan, M. R., Xia, Y. Neovascularization in Biodegradable Inverse Opal Scaffolds with Uniform and Precisely Controlled Pore Sizes. Adv. Healthcare Mater. 2 (1), 145-154 (2013).
  30. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of Three-Dimensional Vascularized Cardiac Tissue with Cell Sheet Engineering. J. Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  31. Zhang, Y. S., et al. 3D Bioprinting for Tissue and Organ Fabrication. Ann. Biomed. Eng. 45 (1), 148-163 (2017).
  32. Malda, J., et al. 25th Anniversary Article: Engineering Hydrogels for Biofabrication. Adv. Mater. 25 (36), 5011-5028 (2013).
  33. Murphy, S. V., Atala, A. 3d Bioprinting of Tissues and Organs. Nat. Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  34. Miller, J. S., et al. Rapid Casting of Patterned Vascular Networks for Perfusable Engineered Three-Dimensional Tissues. Nat. Mater. 11 (9), 768-774 (2012).
  35. Bertassoni, L. E., et al. Hydrogel Bioprinted Microchannel Networks for Vascularization of Tissue Engineering Constructs. Lab Chip. 14 (13), 2202-2211 (2014).
  36. Kolesky, D. B., et al. 3d Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  37. Lee, V. K., et al. Creating Perfused Functional Vascular Channels Using 3d Bio-Printing Technology. Biomaterials. 35 (28), 8092-8102 (2014).
  38. Zhang, Y. S., et al. Bioprinted Thrombosis-on-a-Chip. Lab Chip. 16, 4097-4105 (2016).
  39. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the Granular Gel Medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  40. Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3d Printing of Shear-Thinning Hydrogels into Self-Healing Hydrogels. Adv. Mater. 27 (34), 5075-5079 (2015).
  41. Hinton, T. J., et al. Three-Dimensional Printing of Complex Biological Structures by Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  42. Jia, W., et al. Direct 3d Bioprinting of Perfusable Vascular Constructs Using a Blend Bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  43. Zhang, Y., et al. In Vitro Study of Directly Bioprinted Perfusable Vasculature Conduits. Biomaterials Science. 3 (1), 134-143 (2015).
  44. Gao, Q., He, Y., Fu, J. -Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial Nozzle-Assisted 3D Bioprinting with Built-in Microchannels for Nutrients Delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  45. Cornock, R., Beirne, S., Thompson, B., Wallace, G. G. Coaxial Additive Manufacture of Biomaterial Composite Scaffolds for Tissue Engineering. Biofabrication. 6 (2), 025002 (2014).
  46. Duan, B., Hockaday, L. A., Kang, K. H., Butcher, J. T. 3D Bioprinting of Heterogeneous Aortic Valve Conduits with Alginate/Gelatin Hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. A. 101 (5), 1255-1264 (2013).
  47. Skardal, A., et al. Photocrosslinkable Hyaluronan-Gelatin Hydrogels for Two-Step Bioprinting. Tissue Eng. A. 16 (8), 2675-2685 (2010).
  48. Li, S., et al. Direct Fabrication of a Hybrid Cell/Hydrogel Construct by a Double-Nozzle Assembling Technology. J. Bioact. Compatible Polym. 24 (3), 249-265 (2009).
  49. Visser, J., et al. Biofabrication of Multi-Material Anatomically Shaped Tissue Constructs. Biofabrication. 5 (3), 035007 (2013).
  50. Boyd, D. A., Adams, A. A., Daniele, M. A., Ligler, F. S. Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape. Journal of visualized experiments: JoVE. (83), e50958 (2014).
  51. Daniele, M. A., Adams, A. A., Naciri, J., North, S. H., Ligler, F. S. Interpenetrating Networks Based on Gelatin Methacrylamide and Peg Formed Using Concurrent Thiol Click Chemistries for Hydrogel Tissue Engineering Scaffolds. Biomaterials. 35 (6), 1845-1856 (2014).
  52. Daniele, M. A., Boyd, D. A., Adams, A. A., Ligler, F. S. Microfluidic Strategies for Design and Assembly of Microfibers and Nanofibers with Tissue Engineering and Regenerative Medicine Applications. Adv. Healthcare Mater. 4 (1), 11-28 (2015).
  53. Daniele, M. A., Radom, K., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfluidic Fabrication of Multiaxial Microvessels Via Hydrodynamic Shaping. RSC Advances. 4 (45), 23440-23446 (2014).
  54. Colosi, C., et al. Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low Viscosity Bioink. Adv. Mater. 28 (4), 677-684 (2015).
  55. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D Microfibrous Scaffolds for Engineering Endothelialized Myocardium and Heart-on-a-Chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  56. Khademhosseini, A., et al. Microfluidic Patterning for Fabrication of Contractile Cardiac Organoids. Biomed. Microdevices. 9 (2), 149-157 (2007).
  57. Yue, K., et al. Synthesis, Properties, and Biomedical Applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) Hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  58. Loessner, D., et al. Functionalization, Preparation and Use of Cell-Laden Gelatin Methacryloyl-Based Hydrogels as Modular Tissue Culture Platforms. Nat. Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  59. Aung, A., Theprungsirikul, J., Lim, H. L., Varghese, S. Chemotaxis-Driven Assembly of Endothelial Barrier in a Tumor-on-a-Chip Platform. Lab Chip. 16, 1886-1898 (2016).
  60. Shin, S. R., et al. A Bioactive Carbon Nanotube-Based Ink for Printing 2d and 3d Flexible Electronics. Adv. Mater. 28 (17), 3280-3289 (2016).
  61. Shin, S. R., et al. Aptamer-Based Microfluidic Electrochemical Biosensor for Monitoring Cell Secreted Cardiac Biomarkers. Anal. Chem. 88, 10019-10027 (2016).
  62. Zhang, Y. S., et al. Google Glass-Directed Monitoring and Control of Microfluidic Biosensors and Actuators. Sci. Rep. 6, 22237 (2016).
  63. Colosi, C., et al. Rapid Prototyping of Chitosan-Coated Alginate Scaffolds through the Use of a 3d Fiber Deposition Technique. J. Mater. Chem. B. 2 (39), 6779-6791 (2014).
  64. Zhu, W., et al. Direct 3D Bioprinting of Prevascularized Tissue Constructs with Complex Microarchitecture. Biomaterials. 124, 106-115 (2017).
  65. Yu, Y., Zhang, Y., Martin, J. A., Ozbolat, I. T. Evaluation of Cell Viability and Functionality in Vessel-Like Bioprintable Cell-Laden Tubular Channels. J. Biomech. Eng. 135 (9), 091011-091011 (2013).
  66. Zhang, Y., Yu, Y., Chen, H., Ozbolat, I. T. Characterization of Printable Cellular Micro-Fluidic Channels for Tissue Engineering. Biofabrication. 5 (2), 025004 (2013).
  67. Zhang, Y., Yu, Y., Ozbolat, I. T. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4 (2), 020902 (2013).
  68. Dolati, F., et al. In Vitro Evaluation of Carbon-Nanotube-Reinforced Bioprintable Vascular Conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  69. Hansen, C. J., et al. High-Throughput Printing Via Microvascular Multinozzle Arrays. Adv. Mater. 25 (1), 96-102 (2013).

Tags

Bioteknologi sag 126 Bioprinting tissue engineering regenerativ medicin organoids orgel-on-chip vascularization endothelialization mikrofibre
Mikrofluid Bioprinting for Engineering vaskulariserede væv og Organoids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen,… More

Zhang, Y. S., Pi, Q., van Genderen, A. M. Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids. J. Vis. Exp. (126), e55957, doi:10.3791/55957 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter