Summary
אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.
Abstract
דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא טכניקה חזקה לכימות תנועת תרמודינמי פרמטרים הנוגעים למערכות ביולוגיות קיפול ואינטראקציות מחייב. מידע זה חיוני בעיצוב של תרכובות פרמצבטיות חדש. אולם, רבים ליגנדים הרלוונטיים הם הם לא יציב מבחינה כימית בטמפרטורות גבוהות בשימוש DSC ניתוחים. לפיכך, מדידת אינטראקציות מחייב הוא מאתגר כי הריכוזים של ליגנדים ומוצרים המרה תרמית משתנים ללא הרף בתוך התא קלורימטר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות ליגנדים thermolabile ו DSC להשגת במהירות מידע תרמודינמי קינטי קיפול, האיגוד, לבין ליגנד תהליכי ההמרה. אנחנו החלת שיטת שלנו aptamer ה-DNA MN4 המאגד הקוקאין ליגנד thermolabile. באמצעות ניתוח כללי התאמה חדשים that חשבונות for ליגנד thermolabile ההמרה, הערכה המלאה של קיפול ופרמטרים איגוד מתקבלים מן זוג ניסויים DSC. בנוסף, נראה כי ניתן להשיג את קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile עם dataset DSC משלים אחד בלבד. ההנחיות לזיהוי וניתוח נתונים של מספר תרחישים יותר מסובך מוצגים, כולל צבירת בלתי הפיך של biomolecule, קיפול איטי, איגוד איטי, דלדול מהירה ליגנד thermolabile.
Introduction
דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא שיטה חזקה עבור איגוד למערכות ביולוגיות quantitating ומתקפלים אינטראקציות1,2,3. נקודות החוזק של DSC כוללים את יכולתו להבהיר מחייב וקיפול מנגנונים, תשואה של2,המקביל פרמטרים תרמודינמי3. יתר על כן, DSC יכול להתבצע בפתרון בתנאים ליד-פיזיולוגיים, לא דורשת תיוג של biomolecule או ליגנד, למשל, עם fluorophores, ספין-תוויות או גרעינית איזוטופים4. המכשיר סורק בטמפרטורה, מודדים את כמות החום הדרושה כדי denature את biomolecule, הנוכחות ואת היעדר ליגנד. Thermograms שנוצר משמשים כדי לחלץ את הפרמטרים תרמודינמי המסדירים את ליגנד מחייב וקיפול תהליכים. המידע שנמסר על ידי DSC או בטכניקות אחרות תרמודינמי חיוני המנחה את העיצוב של שהתרופות המתוות מולקולות1,5,6,7,8. עם זאת, סריקה חוזרת ונשנית לטמפרטורות גבוהות (~ 60-100 ° C) יכול להיות בעייתי. לדוגמה, תרכובות הם חשובים רבים עוברים סידור או ריקבון על חשיפה מתמשכת בטמפרטורות גבוהות9,10,11, קרי, הם thermolabile. בחינה של איגוד אינטראקציות על ידי DSC בדרך כלל דורש מספר סריקות ואחורה כדי לאמת את הפארמצבטית של תמוגרפיה ניתוח תרמודינמי12. המרה תרמי של ליגנד הראשונית בטופס משני עם איגוד שינו מאפיינים מוביל בולטת הבדלים הצורה והמיקום של thermograms רצופות, מאז ריכוז ליגנד הראשונית יורדת עם כל סריקה בזמן ההמרה התרמית מוצרים לצבור. אלה נתונים (datasets) נתונות לא ניתוח מסורתי.
לאחרונה פיתחנו שיטת המדידה הכללית datasets ליגנד thermolabile DSC המניבה את הערכה המלאה של פרמטרים תרמודינמי המסדירים את הקיפולים למערכות ביולוגיות ואיגוד אינטראקציות של ניסוי מאוגד-ליגנד אחד הפניה תמוגרפיה כנדרש עבור חינם biomolecule4. הניתוח מקטין את זמן הניסוי ואת מדגם הנדרש על-ידי ~ 10-fold בהשוואה הגישות DSC סטנדרטי. יש לנו פיתרון ליגנד ההמרה התרמית שייטול את זה קורה במהלך החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה איפה תמוגרפיה אינו תלוי בריכוז ליגנד. לכן, ריכוז ליגנד הוא קבוע בתוך החלק של תמוגרפיה המשמש כדי לחלץ תרמודינמי פרמטרים. בנוסף להדגים איך קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע ניסוי משלים אחד עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה. עבור מערכות ההמרה התרמית ליגנד איפה פחות תלוית טמפרטורה (קרי, המתרחשים ניכרת בטמפרטורות כל), הניתוח יכול להיות שונה כדי לכלול ריכוזים ליגנד משתנה. כאן אנחנו מוכיחים את הליך זה עבור aptamer DNA MN4 בנוכחות הקוקאין ליגנד thermolabile, אשר ממירה במהירות benzoylecgonine בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C). כינין משמש פקד שלילי ליגנד thermolability כיוון שהוא אינו עובר המרה בטמפרטורות אלה ניסיוני נקשר גם MN4. אנו מתארים הרכישה של ליגנד thermolabile DSC datasets וניתוח שלהם מניב פרמטרים תרמודינמי, קינטי של קיפול, איגוד, ליגנד תהליכי ההמרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הדוגמא
- לטהר את biomolecule הרצוי13.
הערה: זה פרוטוקול שימושים לרכוש קוקאין-איגוד ה-DNA aptamer MN4 לאחר החלפת נגד 2 M NaCl 3 פעמים ואחריו שלושה סבבי מים יונים באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם קרום ניתוק משקל מולקולרי 3 kDa. - לסנתז, לטהר, או לרכוש את הרצוי ליגנד thermolabile13.
הערה: MN4 נקשר ליגנד thermolabile הקוקאין. MN4 נקשר גם כינין, אשר משמש פקד שלילי ליגנד thermolability בטמפרטורות אלה ניסיוני. - להכין מאגרי דיאליזה של biomolecule מטוהרים והפירוק של ליגנדים (מאגר NaCl נתרן פוספט ו- 140 מ מ 20 מ מ, pH 7.4, MN4, את ליגנדים המשמש כאן).
- Dialyze את biomolecule נגד לפחות 2 L מאגר באמצעות דיאליזה אבובים עם 0.5 - 1.0 kDa ניתוק.
- לסנן המאגר הסופי (המכונה מאגר עובדים) דרך מסנן 0.2 µm יש כבר equilibrated ביסודיות עם מאגר.
- שוקל את ההמונים ליגנדים הרצוי, לפזר אותם במאגר העבודה מסוננים. אם הריכוזים ליגנד הרצוי לדרוש גושים קטנים מדי לשקול במדויק, ליצור פתרון מניות ליגנד מרוכז (10 x למשל).
הערה: זה הכרחי כי כל הניסויים DSC לנצל את המאגר לעבוד באותו המדגם, ליגנד, קרי, לא לבצע ניסוי שבו ליגנד הוא מומס אצווה שונה מאגר עובדים מאשר biomolecule כמו זה יגרום מאגר חפצים אי התאמה של הנתונים. - לסנן את הפתרון מניות biomolecule דרך מסנן 0.2 µm יש כבר equilibrated ביסודיות באמצעות מאגר עובדים.
- לקבוע את הריכוז biomolecule על ידי ספיגת מדידות (260 ננומטר עבור חומצות גרעין כמו MN4 ו- 280 ננומטר חלבונים).
- לאחסן את biomolecule מוכן ואת ליגנד במקרר 4 ° C (מתאים MN4 של ליגנדים המשמש כאן), או ב-20 או -80 ° C אם biomolecule ואת ליגנדים לסבול הקפאה ואחסון לטווח ארוך נדרש. דגה הפתרונות מאגר, biomolecule וליגנד מלמעלה בטבלה degasser (ראה טבלה של חומרים) לפני טעינה אל DSC.
הערה: Degassing מסייעת למנוע היווצרות בועה ב DSC בטמפרטורות גבוהות יותר. בועות לגרום חפצים אות שמחשיך DSC שיא וצורות בסיסיות.
2. DSC הכנה
- לפרק ידית לחץ מ DSC (ראה טבלה של חומרים).
- הפעל סיליקון אבובים מתוך המאגר עבודה ולחבר אותו מקורבות הקדמי (מתכת פתיחה) של נים ההפניה.
- ליצור גשר בין הנימים הפניה, לדוגמה על-ידי חיבור והסתיר את הפניית האחוריים והסתיר דגימת קבלה.
- צרף פיסת סיליקון אבובים מקורבות אחורי מדגם שפועל אל בקבוק פסולת עם קו ואקום מצורף.
- הפעל את הקו ואקום לרוקן את DSC עם 200 מ ל מאגר עובדים.
- לטעון את נימי הפניה של DSC עם מאגר עובדים. לצרף בערך 3-5 ס מ מקטעים של סיליקון אבובים flanges נימי ההפניה.
- להוסיף טיפ פיפטה 1 מ"ל סיליקון אבובים של מקורבות אחורי. לצייר 0.8 מ של מאגר עובדים עם פיפטה והכנס את הטיפ פיפטה עם מאגר לתוך צינורות סיליקון של מקורבות אסמכתא קבלה.
- לחץ בעדינות על הבוכנה פיפטה אל מעבר המאגר לעבוד דרך לאורך צינור סיליקון קבלה לתוך נימי הפניה ומצורפת למעלה לתוך של לכנף אחורית טיפ פיפטה. לחץ כלפי מטה הבוכנה פיפטה עד רמת מאגר עובדים מגיע בדיוק מעל לאורך צינור סיליקון הקבלה, ואז לשחרר את הבוכנה פיפטה עד רמת מאגר עובדים מגיע בדיוק מעל לאורך צינור אחורי סיליקון.
- חזור על העברת מאגר עובדים הלוך לטהר את עוצמת הקול נימי הפניה של בועות.
הערה: בדרך כלל, עובר 10 של הפתרון הלוך מספיקים לנקות את כל הבועות.
- חזור על העברת מאגר עובדים הלוך לטהר את עוצמת הקול נימי הפניה של בועות.
- קאפ הקצה האחורי פיפטה עם האגודל ומשוך בעדינות פיפטה אחורי עצה, פיפטה קבלה כדי להסיר אותם מן flanges ההפניה עם לאורך צינור סיליקון המצורפת.
- לטעון את נימי מדגם באמצעות מאגר עובדים כמו מדרגות 2.6 2.9. במקום כובע פלסטיק שחור על ההפניה אחורי, לטעום flanges, עוזב את אוגן קדמי חשפו.
- לצרף את הידית לחץ.
- לפתוח את התוכנה DSC (ראה טבלה של חומרים), לדחוס את המכשיר על ידי לחיצה על החץ בחלק העליון של הממשק האדום העולה למעלה ברגע הקריאה כוח התייצב; הכוח DSC מסומן בתוך קופסה בחלק העליון הימני של הממשק יחד עם כלי טמפרטורה, קריאה לחץ.
הערה: הצג הכוח לקרוא גם DSC הרמטי סיליקון. שינויים בשלטון של יותר מ ~ 10 µW מצביעים על היווצרות בועה הנימים, אשר יכול לגרום חפצים הנתונים. הפתרונות חייבים להיות הוסר, degassed נוסף לפני שתמשיך. - Equilibrate על DSC עם מאגר עובדים על-ידי ביצוע סריקה ואחורה. בכרטיסיה "השיטה הניסיונית" בצד שמאל של המסך, ודא כי האפשרות "סריקה" נבחרה לנהל את DSC ב טמפרטורה ומצב סריקה.
הערה: ניסיוני הפרמטרים הם הטמפרטורה סריקה טווח, קצב סריקה, חום נמוך וגבוה equilibration זמן ומספר של סריקות.- שיבוץ "טמפרטורה פרמטרים" תחת הלשונית "השיטה הניסיונית", לחץ על הלחצן "חימום". הזן 1 ו- 100 ° C בטמפרטורות ניסיוני העליון והתחתון, 1 ° C/דקה את קצב הסריקה, 60 s עבור התקופה equilibration.
- לחץ על לחצן "הוסף סדרה" תחת השדה קלט עבור התקופה equilibration. הזן 2 לתוך השדה "להוסיף שלבים" בחלון מוקפץ (עבור אחד סריקה הקירור והחימום אחד) וסמן את התיבה "חלופי חימום/קירור". לחץ על "אישור"; הסריקות שנוספו מופיעים בחלק התחתון של הממשק. בדוק הפרמטרים עבור כל סריקה הם כמו הרצוי.
- להתחיל את הניסוי על-ידי לחיצה על הכפתור הירוק "לשחק" בחלק העליון של הממשק. נווט אל התיקיה הרצויה, קלט שם קובץ לשמירת הניסוי בחלון מוקפץ. להציג את התקדמות הניסוי על-ידי לחיצה על הכרטיסיה "נתונים" בצד ימין של הכרטיסייה "שיטת הניסוי".
3. איסוף Datasets DSC ליגנד Thermolabile
הערה: ההליך מינימלית כוללת חמישה ניסויים: מאגר ניסויים הפניה עם ובלי ליגנד (שימוש עבור חיסור בסיסית, ראה דיון), לטעום ניסויים עם biomolecule ללא תשלום, biomolecule מאוגד-ליגנד, ו ליגנד-מחויב biomolecule עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה.
- עורכים ניסויים הפניה עבור חיסור בסיסית של הנתונים לדוגמה. רענן את DSC עם מאגר עובדים בשני נימים ולאסוף מספר סריקות ואחורה על טווח טמפרטורה מתאימים ב- 1 ° C דקות-1 עם ממריץ (חום גבוה) equilibration הזמן של 120 s.
- למחוק את הסריקות equilibration מאגר קודמות בחלק התחתון של הממשק על-ידי סימון כל אחד בנפרד, לחיצה על ה-X האדום באמצע נכון של הממשק. הוסף את הסריקות החדש על ידי לחיצה על לחצן "הוסף סדרה", כניסה 20 את השדה "צעדים כדי להוסיף" סימון התיבה "חלופי חימום/קירור". לחץ על אישור והפעל את הניסוי על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה הירוקה כמפורט לעיל.
- חזור על שלבים 3.1 - 3.1.1 עם עבודה מאגר המכיל את הריכוז הרצויה של ליגנד ב שני נימים כדי להשיג את ההפניה ניסויים עבור ליגנד (לאסוף שני ניסויים נפרדים באמצעות 120 s ו- 600 s בטמפרטורה גבוהה equilibration פעמים בהתאמה, כדי לשמש להשגת על קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile).
הערה: קצב הסריקה המשמש כאן מבטיח biomolecule בניסויים הבאים ב שיווי משקל תרמי סריקות ואחורה (ראה דיון). סרוק המחירים < 0.1-0.2 ° C דקות-1 להוביל thermograms רועש ו אינם ישימים בניסויים DSC. הטמפרטורות כדאי להאריך מן מתחת טמפרטורת ההיתוך biomolecule חינם טוב מעל טמפרטורת ההיתוך רווי-ליגנד biomolecule (~ 20-80 ° C עבור MN4). ודא הפארמצבטית של הסריקות (עבור דוגמה, קדימה 10 וסריקות הפוכה 10 20 הכולל מספיקה). - אם משתמש ליגנדים מרובים (כגון קוקאין כינין), לרוקן את DSC עם 200 מ ל מאגר עובדים (אני חוזר משלב 2.5) בין פועל כדי להסיר ליגנד הנימים ולמנוע זיהום צולב.
הערה: מומלץ לבצע ניסוי שכפל על biomolecule חינם לאחר ריצה ליגנד מאוגד על מנת לבדוק אם ליגנד הקודם adsorbs בחוזקה אל קירות נימי, אינו מוסר בצורה הולמת עם מאגר שטיפה. אם thermograms עבור biomolecule חינם מופיעה כדי להיות מוזז בסדר גודל גדול יותר, טמפרטורת דנטורציה גבוהה לאחר הניסוי ליגנד מכורך, סביר להניח כי ליגנד הקודם הוא עדיין נוכח קלורימטר לאחר שטיפה. הסר את ליגנד הספוחה על-ידי המקננת הנימים עם 20% Contrad-70 לשעה ב 60 מעלות צלזיוס עם מכסי פלסטיק, ידית לחץ. בתוכנה DSC, שנו את מצב ניסיוני כדי "איזותרמי" תחת הכרטיסיה השיטה הניסיונית 3,600 לבחור s עבור משך ו- 60 ° C עבור הטמפרטורה איזותרמי, עם אפס שהוזנו עבור הזמן equilibration. לחץ על "הוסף את השיטה הניסיונית". הניסוי איזותרמי מופיע בחלק התחתון של המסך. לאחר השלמת, לשטוף את המכשיר עם יונים 2 ל' מים וחזור מ שלב 2.5.
- עורכים ניסויים מדגם באמצעות אותו DSC טעינת הליך ופרמטרים ניסיוני כמו סורק ההפניה. עבור ערכת הנתונים biomolecule חינם, ודא כי נימי הפניה מכיל מאגר עובדים בזמן נימי מדגם מכיל את biomolecule חינם-הריכוז הרצוי במאגר עבודה.
- לניסויים מאוגד-ליגנד, ודא ליגנד נמצאת במאגר לעבוד בנים הפניה, biomolecule בתוספת ליגנד נמצאים במאגר לעבוד בנים הדגימה. לרוקן את המערכת בין תוספות של ליגנדים שונים כמו שלב 2.5.
- בצע אחד ניסוי נוסף עם biomolecule חייב ליגנד thermolabile איפה התקופה equilibration בטמפרטורה גבוהה מוגברת 600 s ו פרמטרים ניסיוני אחרים הם כמו שלב 3.2.1.
הערה: משך תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה עבור הניסוי השני ליגנד מכורך פשוט נבחר כדי להבטיח ליגנד מדולדל במהירות רבה יותר מאשר הניסוי זמן קצר equilibration. אם הפסגות ליגנד מכורך מהראשון ניסוי דעיכה לאט כפונקציה של מספר סריקה (למשל, הבדלי שיא רצופים maxima נמצאים ≤ 0.5 ° C), הערכת 10 - עד 20 פי מגביר את תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה על מנת שלמאחה לרוקן את ליגנד במהלך הניסוי השני. חישוב מדויק קבוע קצב לגיור ליגנד דורש כי הניסוי השני יש דלדול מואץ ליגנד ביחס הראשון. הריכוזים ליגנד שחולצו מן הבדיקה הכללית של שני ניסויים יהיו דומים, ולכן בלתי שמיש אם דלדול ליגנד היא לא מספיק מואצת של הניסוי השני.
4. עיבוד נתונים
- פתח DSC ניסוי קבצים בתוכנת ניתוח נתונים DSC (ראה טבלה של חומרים) ולייצא את הנתונים בעצמתה כמו גליונות אלקטרוניים.
- לייבא את גליונות אלקטרוניים המכילה את נתוני כוח גולמי לתוך תוכנת עבור נתונים מתאים.
- בסיסית להחסיר את הנתונים לדוגמה על-ידי חיסור מאגר נתונים כוח מ חופשי וניסויים מאוגד-ליגנד biomolecule.
הערה: עבור הניסוי ליגנד thermolabile, הריכוז של ליגנד הראשונית הולך ופוחת עם כל סריקה. לכן, הוא אידיאלי כדי לחסר את הסריקה מאגר 1 באמצעות סריקה מדגם 1, וכן הלאה. מצאנו כי הסריקות מאגר עם קוקאין אינם משתנים ניכרת ההמרה ליגנד התמורה, ולכן סריקת מאגר יחיד ליגנד thermolabile יכול לשמש כדי לחסר את כל הנתונים מאוגד-ליגנד thermolabile. - המרת הנתונים כוח לדוגמה המופחת בסיסית קיבול חום.
הערה: ההמרה מחייבת של biomolecule חלקי אחסון מסוים, אשר יכול להיות מוערך14,15,16. המשוואה לחישוב המרת כוח קיבול חום כבר שתוארה לעיל17.
5. ניתוח נתונים
- באופן כללי להתאים את equilibration קצר זמן thermolabile קיבול חום של ליגנד מאוגד נתונים (dataset) עם ערכה אחת של תוכנית בסיסית, ליגנד, קיפול לריכוז ליגנד תיחום פרמטרים כפי שתואר לעיל4.
- חזור על שהעולמי מתאים ערכת הנתונים זמן equilibration זמן כדי לחשב את שיעור קבוע לגיור ליגנד thermolabile כפי שתואר לעיל4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נציג נתונים עבור DSC ליגנד thermolabile מוצגים באיור1. המיקום ואת גובה הפסגה מאוגד-ליגנד thermolabile במרוכז משמרות לכיוון של biomolecule לא מאוגד כמו ליגנד thermolabile תיגמר עם כל סריקה (איור 1 א'). הפרופיל דנטורציה חינם משמש כייחוס עבור נקודת הקצה של ליגנד thermolabile המרה (איור 1b). נתונים עבור MN4 חייב כינין מוצגים כפקד שלילי לגיור ליגנד thermolabile (איור 1b). הסריקות ליגנד thermolabile הסופי יש מעט גבוה יותר מעבר האמצע הייטס שיא ביחס MN4 לא מאוגד, המציין שהמוצר ההמרה של ליגנד thermolabile (benzoylecgonine) יש זיקה חלשה עבור MN4. הפרמטרים תרמודינמי המתבררת מניתוח הכללית של datasets באיור 1 מוצגים בטבלה 1. הפרמטרים מתקפלים עבור MN4 בנוכחות קוקאין או כינין זהים בתוך שגיאה, כמצופה מאז שתדללו מולקולות קטנות לא צפויים perturb את התרמודינמיקה מתקפלים של biomolecule חינם. הפרמטרים איגוד בהסכם טוב עם אלה של calorimetry (ITC) טיטור איזותרמי18 , חושפים כי ההעדפה של MN4 כינין על קוקאין הוא מונע על ידי אנתלפיה מחייב יותר. איור 2, הגדלת תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה מניבה מובהק יותר הנחות של ריכוז ליגנד thermolabile עם כל סריקה יחסית ערכת הנתונים תקופה קצרה equilibration. באמצעות הפרמטרים ממוטבת ריכוז מתאים הכללית datasets שני, המחושבת על קצב קבוע לגיור ליגנד בטמפרטורה גבוהה equilibration השיפוע של קו שיבוץ באיור 2 .
איור 1. ליגנד thermolabile DSC- () Thermograms של MN4 (83 מיקרומטר) מאוגד לקוקאין (הריכוז ההתחלתי 778 מיקרומטר). סריקות הראשון והאחרון של MN4, בנוכחות ליגנד מופיעים כעיגולים אדום וכחול כהה בזמן מתאים התואם מוצגים כקווים צבעוניים. (b) Thermograms של MN4 חינם (מעגלים מיקרומטר, שחור 83), סריקות רציפות מאוגדים כינין (880 מיקרומטר, צבעונית ועיגולים). מתאים כדי datasets בחינם, כינין מכורך מוצגים כקווים שחורים, בהתאמה. לשכפל הפניה4 , ברשות החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. מדידת קצב קבוע עבור המרה ליגנד Thermolabile. () סטים של thermograms עבור MN4 חייב קוקאין עם קצר (120 s, אדום כהה), זמן (600 s, כחול כהה) equilibration פעמים ב 80 ° C, בהתאמה. (b) ריכוזים של הקוקאין מופק ניתוח גלובלית של קבצי הנתונים ב () כפונקציה של מספר הסריקה. נקודות ניסיוני מתאים מעריכי מוצגים כמו עיגולים צבעוניים וקווים בהתאמה. שיבוץ מציג התאמה לינארית 19 הציוד המשלים שתואר לעיל הרקנס ואח . באמצעות ריכוז ממוטבת קוקאין בכושר הכללית עבור שני נתונים (datasets)4. קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד ב 80 ° C מחושבת את השיפוע של הקו. השגיאה עבור קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile ניתנת כמו ± 2 סטיות תקן. לשכפל הפניה4 , ברשות החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פרמטרים בכושר | קוקאין הוסיף | כינין הוסיף |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ΔSUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| G δUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| H δB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| S δB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| Δ-C-p-B1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| G δB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| H δB2F | -33.7±1.8 | - |
| S δB2F | -49.9±5.2 | - |
| ΔCpB2F | -2.2±0.1 | - |
| G δB2F | -18.6±0.3 | - |
טבלה 1. פרמטרים תרמודינמי מופק ניתוח גלובלית של MN4 DSC Datasets באמצעות קוקאין ו ליגנדים כינין. פרמטרים חושבו ב 30 º C. B1F מתייחס למדינות מקופל קוקאין או כינין-מכורך ואת B2F מתייחס המדינה מקופל מאוגד-benzoylecgonine. Δ ΔG ו-H , מבוטאים kJ/mol, ΔS מתבטא ב J/mol/K וδCp מתבטאת kJ/mol/ק' שגיאות חושבו על פי שיטת השונות/co-variance19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שינויים ופתרון בעיות
הפרטים של הניתוח התאמה העולמית בשימוש איור 1 , איור 2 היה שתואר לעיל4. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ההיבטים המעשיים של ביצוע וניתוח DSC מחייב בין ניסויים ליגנדים thermolabile. שימו לב כי תוכנית בסיסית DSC להשיג עבור ליגנד thermolabile לבד המופחת של ליגנד + biomolecule dataset, ביטול ביעילות את החום שוחררו או נספג על ידי ההמרה התרמית לעבד את עצמה. הניתוח מתאים הכללית ליגנד thermolabile רגיל (איור 1 , איור 2) מבוסס על ההנחה כי המערכת הינה שיווי משקל תרמודינמי במהלך הסריקה טמפרטורה כי ריכוז ליגנד thermolabile הוא קבוע לאורך כל תמוגרפיה, הפחתת באופן בלעדי במהלך תקופת equilibration בטמפרטורה גבוהה. אנחנו בעבר הראו כי הנחה זו חלה על קוקאין מכורך MN4 צפויה להחזיק עבור כל מערכת ליגנד thermolabile/biomolecule עם קינטיקה דומים לאלה.
עם זאת, ישנם מספר מצבים שבהם המערכת אי אפשר להניח ב שיווי משקל תרמודינמי ו/או הריכוז של ליגנד יכולה להיחשב קבועה לאורך כל סריקה בודדת. אלה כוללים i) כאשר ליגנד תרמית ממיר במהירות יחסית קצב הסריקה של טמפרטורה, ii) בעת biomolecule עובר צבירה בלתי הפיך בטמפרטורה גבוהה, iii) כאשר המחירים קיפול/התגלגלות איטיים בהשוואה את קצב הסריקה, ו- iv). כאשר המחירים האגודה/דיסוציאציה ליגנד איטי בהשוואה קצב הסריקה. במקרים אלה, המערכת תחת שליטה קינטי ולא תרמודינמי, בקפדנות אין אפשרות להחיל את הניתוח נתנו בהפניה 4. הנתונים אולי ניתן לדמות באופן כמותי בעקבות איור 3, כפי שמתואר ב ה 1 קובץ משלים. בעקרון, חישובים אלה מבוססות-קינטיקה יכול לשמש כדי להתאים נתונים DSC ללא שיווי משקל, פוטנציאל מניב נתונים קינטי והן תרמודינמי, אולם ניתוח זה הוא מעבר להיקף של המאמר. במקום זאת, אנו מציגים חלק מהנתונים DSC מדומה נציג על מנת לסייע לקורא בזיהוי מצבים ללא שיווי משקל.
דוגמה אידיאלית של שליטה תרמודינמי מוצג באיור 4ab. DSC thermograms של biomolecule חינם superimposable (איור 4a), סריקות עם ליגנד thermolabile אינם מראים היסטרזיס, כך טמפרטורת ההיתוך מובחנים למעלה-הסריקה תואם טמפרטורת מתקפלים (למטה-scan הקודם איור 4b). כאשר ליגנד thermolabile ממיר במהירות בהשוואה את קצב הסריקה, עיוותים גדול מופיעות תמוגרפיה ואין המשוואות תרמודינמי חשבון עבור הצורה שיא, כפי שמוצג באיור 4 c, d. זה ניתן להקל במידת מה על ידי הגדלת את קצב הסריקה. כאשר מצרפי biomolecule באופן תלוית טמפרטורה, DSC עקבות למופע חינם biomolecule רצופים פוחתת מאוד בגודלם (איור 4e), בעוד תוספת של ליגנד thermolabile מפיק דפוס של הפחתת תרמי upshifts דומה המצב האידיאלי, אבל המשנה את גודלו על ידי הפחתת ריכוז biomolecule (איור 4f). מתי קיפול/התגלגלות קינטיקה איטיים בהשוואה קצב הסריקה, היסטרזיס בולטת ב- DSC עקבות biomolecule חינם כך הטמפרטורה דנטורציה לכאורה על מעלה-scan הוא גבוה יותר מאשר הטמפרטורה renaturation לכאורה על (למטה-scan איור 4 g). תוספת של ליגנד thermolabile מוביל דפוס מוכר של הפחתת upshifts תרמית, במיוחד עבור מעלה-הסריקות (איור 4 h). לבסוף, מערכות עם קיפול מהירה ואיגוד איטי לייצר ללא היסטרזיס DSC thermograms עבור biomolecule חינם (איור 4i), אולם הנתונים עם ליגנד thermolabile הצג היסטרזיס איפה טמפרטורת ההיתוך לכאורה של הסריקה למעלה גבוה יותר מאשר הטמפרטורה מתקפלים לכאורה הקודם למטה-הסריקה (איור 4j). ובכל זאת, הדפוס הטיפוסי של הפחתת upshifts תרמית ניכרים גם סריקות למעלה וגם למטה-סריקות. שיווי משקל ללא התנהגות במקרה של קיפול איטי או איגוד קינטיקה ניתן להקל במידת מה על ידי הפחתת את קצב הסריקה, למרות זה מפעיל את הסיכון של ליגנד שעצירת ההמרה התרמיים המתרחשים במהלך הסריקה. בפועל, הטמפרטורה equilibration סריקה קצב ו העליון יכול להיות מותאם באופן ידני כדי לקבל נתונים דמוי דמות 4a, b.
מגבלות של הטכניקה
ניתוח תרמודינמי שלנו עבור DSC מחייב ניסויים עם ליגנדים thermolabile דורש כי קיפול והתהליכים איגוד הם מהירה יחסית כי ההמרה ליגנד thermolabile הוא איטי לפני החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה. כאשר החיים של המדינה מקופלת ו/או מאוגד גדול מ כ 30 s (kחופש, ku < 0.03 s-1) היסטרזיס הופך ניכרת סריקות בנטילת דקות 1 ° C-1. בנוסף, כאשר הוא קבוע קצב ההמרה ליגנד מעל כ kc = 10-4 s-1 לפני המעבר דנטורציה, יכול להיות משמעותי דלדול ליגנד במהלך סריקה בודדת. היישום של הניתוח שלנו אינו מתאים גם כאשר מתרחשת צבירה בלתי הפיך. במקרים אלה, דגמי מתקדמים יותר יכול להיות מיושם על הנתונים. אין מידע זיקה זמינה אם ליגנד המרה היא כה מהירה כי זה מגיע למיצויו לפני המעבר דנטורציה הראשון.
משמעות לגבי שיטות קיימות
השיטה שלנו בפעם הראשונה מאפשרת DSC לשמש כדי למדוד את התרמודינמיקה איגוד של זיקה גבוהה, ליגנדים thermolabile. על ידי ביצוע ניתוח בו זמנית הכללית של כל הסריקות, פרמטרים תרמודינמי מחולצים עם רמת דיוק גבוהה20. יתרון נוסף הוא כי ערכת הנתונים המלא ניתן לאסוף בניסוי אחד קטנה כמו אם המוצר ההמרה התרמית שלא מרגישה biomolecule ללא תשלום. לעומת זאת, לייצר סידרה DSC ניסויית טיפוסית עבור ליגנד thermolabile דורש ~ ניסויים סה כ 7-10.
יישומים עתידיים
גישה זו יש ישירה ליישומי אפיון מעכבי חזק, thermolabile קמפיינים גילוי סמים. מספר תרכובות טיפוליות כגון אנטיביוטיקה, בנזודיאזפינים ידועים להיות thermolabile, שעברו הידרוליזה מהירה או קרוב ל- pH פיזיולוגיים, טמפרטורות של ~ 60-70 ° C11. שיטה זו DSC היא ממוצבת היטב כדי לזהות ולאפיין ורבים נוספים. כמו כן, שינוי של פרוטוקול הולם עבור מערכות תחת בקרה קינטית ולא תרמודינמי, כפי שפורט לעיל, יש הפוטנציאל לפתוח את הדלת כדי רבים עוד מערכות ביולוגיות רלוונטיות.
שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול
אחד ההליכים ניסיוני החשובים ביותר שיש להביא בחשבון הוא דיאליזה או exchange של biomolecule וליגנד לתוך העבודה זהים מאגר פתרונות (פרוטוקול שלבים 1.3-1.6). מאגר אי-התאמה בין הפתרונות ליגנד, biomolecule יכול להוביל חפצים גדולים סריקות בסיסית ודגימת אשר לחלוטין מטשטשים את הנתונים הרלוונטיים מתקפלים. בנוסף, זה חיוני כי הקריאה כוח מייצב לפני DSC מדוחס כך זה יכול להיות במעקב במהלך לחץ (פרוטוקול שלב 2.3). אם הקריאה כוח משתנה על ידי יותר מ ~ µW 10 בזמן לחץ, בועות ככל הנראה נוצר הנימים והוא יכול לגרום חפצים גדולים בנתונים. במקרה זה, הפתרונות צריכים להיות degassed באופן יסודי יותר.
איור 3. למערכות ביולוגיות קיפול, איגוד ליגנד Thermolabile ולאחר צבירת הפיך. ליגנד thermolabile (L) ממירה המוצר (X) עם קצב קבוע kc. X יש שלא מרגישה biomolecule. המדינה מאוגדת (B) של החילופים biomolecule עם חופשי מקופל המדינה (נ) עם קצב קבועים k. ו- kב-. חילופי F עם המדינה פרש (U) עם קצב קבועים ku ו- kf. U ממירה בלתי הפיך המדינה צבור (א) עם k קבוע קצבקנאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. הדמיית מחשב של שיווי משקל, DSC שבשליטת Kinetically ניסויים היעדרות, הימצאות ליגנד Thermolabile. () שיווי משקל מתקפל למערכות ביולוגיות. (b) שיווי משקל מתקפל, איגוד ליגנד thermolabile, והמרה ליגנד thermolabile איטי. (ג) שיווי משקל מתקפל למערכות ביולוגיות. (ד) שיווי משקל מתקפל ליגנד thermolabile מחייב, ההמרה ליגנד thermolabile מהר. קיפול למערכות ביולוגיות (e) שיווי משקל, צבירת בלתי הפיך איטי. (f) שיווי משקל, קיפול, כריכה, איטי ליגנד thermolabile המרה ולאחר צבירת בלתי הפיך איטי. (g) איטי קיפול למערכות ביולוגיות. (h) איטי קיפול, מחייב שיווי משקל, והמרה ליגנד thermolabile איטי. (אני) שיווי משקל מתקפל למערכות ביולוגיות. (j) שיווי משקל מתקפל, איגוד ליגנד thermolabile איטי, והמרה ליגנד thermolabile איטי. ב כל החלוניות, הסריקות מדומה הראשון והאחרון הם כחול כהה ואדום כהה, בהתאמה. פאנלים המציגים thermograms כחולים כהים ובהירים רק מצביעים על כך כל הסריקות מדומה כיסוי רק השתיים האחרונות גלויים בעלילה. DSC הניסויים היו מדומה עם סריקות 20 (10 נמס ו 10 חישול) בקצב 1 ° C דקות-1 סריקה, עם מגוון בטמפרטורה של 0-80 מעלות צלזיוס. לוחות מסוימים להציג טווחי טמפרטורה צר יותר כדי לאפשר כאחראית על המגמות סימולציה. ריכוז biomolecule וליגנד ב הסימולציות היו 200 מיקרומטר ו- 10 מ"מ, בהתאמה. ניסוי היה מדומה עם 600 s equilibration פעם ב-0 מעלות צלזיוס לפני סריקה, זמן equilibration s 60 בין כל הסריקות עוקבות. ארניוס פרמטרים עבור שיווי משקל מחייב וקיפול היועל = 5 x 10-1 ז-1 s-1,חופש = 1 x 1019 s-1, Eב =-20 kJ מול-1, E את = 120 kJ מול-1,לקפל = 1 x 10-14 s-1,נפרשים = 5 x 1018, Eמקפלים =-80 kJ מול-1, ו- Eנפרשים = kJ 120 מול-1 . ארניוס פרמטרים עבור שבשליטת kinetically מחייב וקיפול היועל = 5 x 10-3 ז-1 s-1,חופש = 1 x 1016 s-1, Eב -20 kJ מול-1, E = . את = 120 kJ מול-1,לקפל = 1 x 10-16 s-1,נפרשים = 5 x 1016, Eמקפלים =-80 kJ מול-1, ו- Eנפרשים = kJ 120 מול-1 . ארניוס פרמטרים עבור המרה מהירה ואיטית ליגנד thermolabile היואיטיים = 7.509 x 1010 s-1, Eלאט = 94.65 kJ mol-1,מהיר = 1 s-1, E מהר = kJ 10 מול-1. פרמטרים ארניוס לצורך צבירת בלתי הפיך איטי היו נתוניםagg. = 5 x 107 s-1 ו- Eקנאה. = kJ 80 מול-1. עודף חום קיבולות חושבו עם ΔHUF (התגלגלות), ΔHBF (binding) של ΔHAF (סיכום) = 200-140, מול 50 kJ-1, בהתאמה. תיאור תיאורטי DSC שבשליטת kinetically ניסויים ליגנדים thermolabile, script עבור ביצוע סימולציות אלו (וגם את הפרמטרים הנחוצים) הינם זמינים ב- 1 הקבצים המשלימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
V ח וו ר נתמכה על ידי מדעי הטבע מקגיל תוכנית אימונים הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ב- Bionanomachines. א ק מ ופי אי ג'יי נתמכו על ידי מענקים NSERC 327028-09 (א ק ז), 238562 (פי אי ג'יי).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
