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Biochemistry

Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Published: November 21, 2017 doi: 10.3791/55959
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, McGill University, 2Department of Chemistry, York University

Summary

Presentamos un protocolo para la caracterización rápida de biomolecular plegado y encuadernación interacciones con ligandos termolábiles utilizando calorimetría diferencial.

Abstract

Calorimetría diferencial (barrido DSC) es una técnica poderosa para la cuantificación de parámetros termodinámicos que rigen biomolecular plegable y las interacciones de los Unión. Esta información es fundamental en el diseño de nuevos compuestos farmacéuticos. Sin embargo, muchos ligandos farmacéuticamente relevantes son químicamente inestables a las altas temperaturas utilizadas en análisis de DSC. Así, las interacciones de los Unión de medición es difícil porque las concentraciones de ligandos y convierte térmicamente los productos cambian constantemente dentro de la célula del calorímetro. Aquí, presentamos un protocolo usando ligandos termolábiles y DSC para obtener rápidamente información termodinámica y cinética de plegamiento, vinculante y ligando procesos de conversión. Hemos aplicado el método al aptámero de ADN MN4 que se une a la cocaína ligando termolábiles. Usando un nuevo análisis del ajuste global que tenga en cuenta para la conversión de ligando termolábiles, el conjunto completo de parámetros vinculantes y plegable se obtienen de un par de experimentos de DSC. Además, nos muestran que la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles puede obtenerse con sólo un conjunto de datos complementario de DSC. Se presentan las directrices para la identificación y análisis de datos de varios escenarios más complicados, incluyendo la agregación irreversible de la biomolécula, plegamiento lento, enlace lento y rápido agotamiento del ligand termolábil.

Introduction

Calorimetría diferencial (barrido DSC) es un método eficaz para la cuantificación biomolecular vinculante y plegable interacciones1,2,3. Los puntos fuertes de DSC incluyen su capacidad para aclarar vinculantes y mecanismos de plegamiento y rendir los correspondientes parámetros termodinámicos2,3. Además, DSC puede realizarse en solución bajo condiciones fisiológicas cerca y no requiere de etiquetado de la biomolécula o ligando, por ejemplo, con fluoróforos, etiquetas de spin o isótopos nucleares4. El instrumento escanea en temperatura, midiendo la cantidad de calor necesaria para desnaturalizar las biomoléculas en presencia y en ausencia de ligando. Los termogramas resultantes se utilizan para extraer los parámetros termodinámicos que gobiernan el ligando vinculante y procesos de plegamiento. La información proporcionada por DSC u otras técnicas termodinámicas es fundamental para orientar el diseño de fármacos dirigidos a biomoléculas1,5,6,7,8. Sin embargo, la exploración repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) puede ser problemático. Por ejemplo, muchos compuestos farmacéuticamente importantes someterse a cambio o descomposición sobre la exposición sostenida a altas temperaturas9,10,11, es decir, que son termolábiles. Examen de enlace las interacciones por DSC normalmente requiere múltiples exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás con el fin de verificar la reproducibilidad de la termografía para el análisis termodinámico12. Conversión térmica de un ligando inicial a una forma secundaria con características de atascamiento alterado conduce a pronunciadas diferencias en la forma y posición de los termogramas sucesivas, puesto que la concentración del ligando inicial disminuye con cada barrido mientras que la se acumulan productos de conversión térmica. Estos conjuntos de datos no son susceptibles de análisis tradicionales.

Recientemente hemos desarrollado un método de ajuste global para datasets termolábiles ligando DSC que el conjunto completo de parámetros termodinámicos que gobiernan el plegamiento de biomolecular y vinculante de las interacciones de un solo experimento ligando enlazado hace referenciada a la Termograma de necesarias para el libre biomoléculas4. El análisis reduce el tiempo experimental y la muestra necesaria por ~ 10 veces en comparación con métodos estándar de DSC. Hemos representaron para ligando conversión térmica asumiendo esto sucede durante la parte de alta temperatura de cada exploración donde el termograma no depende de la concentración de ligando. Por lo tanto, la concentración de ligando es una constante dentro de la porción del termograma que se utiliza para extraer parámetros termodinámicos. Además demostramos cómo puede obtenerse la constante de velocidad para la conversión térmica ligando mediante la realización de un experimento complementario con un largo periodo de equilibrado de alta temperatura. Para sistemas donde la conversión termal ligando es menos dependiente de la temperatura (es decir, que ocurre apreciable en todas las temperaturas), el análisis puede ser modificado para incluir las concentraciones de ligando variable. Aquí demostramos este procedimiento para el aptámero de ADN MN4 en presencia de la cocaína ligando termolábiles, que rápidamente se convierte en benzoylecgonine a altas temperaturas (> 60 ° C). La quinina se utiliza como un control negativo para thermolability ligando ya que no sufre conversión a estas temperaturas experimentales y también se une a MN4. Describimos la adquisición de ligando termolábiles DSC conjuntos de datos y su análisis, obtención de parámetros termodinámicos y cinéticos de la plegable, vinculante y ligando procesos de conversión.

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Protocol

1. preparación de la muestra

  1. Purificar la biomolécula deseado13.
    Nota: Este protocolo usa comprados cocaína vinculante ADN aptámeros MN4 después de intercambiar contra 2 NaCl M tres veces seguido por tres rondas de agua desionizada utilizando un filtro centrífugo con una membrana de corte de peso molecular de 3 kDa.
  2. Sintetizar y purificar o comprar la deseada ligando termolábiles13.
    Nota: MN4 se une la cocaína ligando termolábiles. MN4 también se une a la quinina, que se utiliza como un control negativo para thermolability ligando a estas temperaturas experimentales.
  3. Preparación de buffers para diálisis de la biomolécula purificada y la disolución de los ligandos (20 mM de fosfato de sodio y 140 mM de tampón NaCl, pH 7,4, MN4 y los ligandos utilizados aquí).
  4. Dializan biomoléculas contra al menos 2 L de tampón utilizando tubos de diálisis con 0,5 - 1,0 kDa corte.
  5. Filtrar el búfer final (denominado buffer de trabajo) a través de un filtro de 0.2 μm que ha sido cuidadosamente equilibrado con tampón.
  6. Pesar las masas deseadas de los ligandos y disolver en buffer de trabajo filtrada. Si las concentraciones de ligando deseado requieren masas que son demasiado pequeñas para pesar exactamente, hacer una solución madre concentrada ligando (10 x por ejemplo).
    Nota: Es fundamental que todos los experimentos de DSC utilizan el mismo buffer de trabajo para la muestra y ligando, es decir, nunca realice un experimento donde el ligando se disuelve en un lote diferente de tampón de trabajo que las biomoléculas ya que esto causará buffer artefactos de desajuste en los datos.
  7. Filtrar la solución stock de biomoléculas a través de un filtro de 0.2 μm que ha sido cuidadosamente equilibrado con tampón de trabajo.
  8. Determinar la concentración de biomoléculas por medidas de absorbancia (260 nm por ácidos nucleicos como el MN4 y 280 nm para las proteínas).
  9. Guarde las biomoléculas preparado y ligando en un refrigerador de 4 ° C (apto para MN4 y los ligandos utilizados aquí), o -20 o -80 ° C si la biomolécula y ligandos soportar almacenamiento de congelación y a largo plazo se requiere. Degas las soluciones tampón, biomoléculas y ligando en una mesa degasser (véase Tabla de materiales) antes de cargar el DSC.
    Nota: Desgasificación ayuda a prevenir la formación de burbujas en el DSC en temperaturas más altas. Las burbujas causan artefactos de señal que las líneas de base y formas de pico de DSC.

2. preparación de DSC

  1. Desenrosque el mango de presión de la DSC (véase Tabla de materiales).
  2. Ejecutar tubos de silicio desde el buffer de trabajo y fije la brida delantera (abertura de metal) de los capilares de la referencia.
  3. Crear un puente entre los capilares mediante la conexión de la brida posterior referencia a la brida frontal muestra y muestra.
  4. Coloque un pedazo de tubo de silicon en la brida posterior muestra que va a un frasco de residuos con una línea de vacío conectada.
  5. Abra la línea de vacío para eliminar el DSC con 200 mL de buffer de trabajo.
  6. Cargar el capilar de la referencia del DSC con buffer de trabajo. Coloque aproximadamente secciones 3-5 cm de tubo de silicon en las pestañas capilar de referencia.
  7. Inserte una pipeta de 1 mL en tubos de silicona de la brida posterior. Dibujar 0,8 mL de tampón de trabajo con una pipeta e inserte la punta de la pipeta con el tampón en tubo de silicio de la brida frontal referencia.
  8. Presione suavemente el émbolo de la pipeta hasta pasar el buffer de trabajo a través del tubo frontal del silicio en el capilar de referencia y hacia la brida posterior unida una punta de pipeta. Presione el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del buffer de trabajo alcanza apenas sobre el tubo de silicona frontal, luego suelte el émbolo de la pipeta hasta que el nivel del buffer de trabajo alcanza apenas sobre el tubo de silicona trasera.
    1. Repita el paso el buffer de trabajo hacia adelante y hacia atrás para purgar el volumen en el capilar de referencia de burbujas.
      Nota: Generalmente, 10 pasos de la solución hacia adelante y hacia atrás son suficientes para eliminar cualquier burbuja.
  9. La tapa la punta trasera con el pulgar y tire suavemente hacia arriba en la punta trasera y delantera pipeta para sacarlos de las pestañas de referencia con el tubo de silicona Unido.
  10. Cargar el capilar de muestras con tampón de trabajo como en los pasos de 2.6-2.9. Coloque un tapón de plástico negro en la referencia posterior y rebordes, dejando las pestañas frente descubiertas de la muestra.
  11. Coloque la manija de presión.
  12. Abra el software de DSC (véase Tabla de materiales) y Presurice el instrumento haciendo clic en el rojo encima de la flecha en la parte superior de la interfaz una vez que la lectura de la energía se ha estabilizado; el poder de la DSC se indica en un cuadro en la parte superior derecha de la interfaz junto con la temperatura del instrumento y lectura de la presión.
    Nota: Monitor que el poder de la lectura como el DSC se presuriza. Cambios en la alimentación de más de ~ 10 μW indican la formación de burbujas en los tubos capilares, que pueden causar artefactos en los datos. Las soluciones deben ser quitadas y desgasificadas más antes de continuar.
  13. Equilibre la DSC con tampón de trabajo mediante la realización de una exploración hacia adelante y hacia atrás. En la pestaña "Método Experimental" en el lado izquierdo de la pantalla, asegúrese de que está seleccionada la opción "Exploración" para ejecutar el DSC de temperatura modo de exploración.
    Nota: Parámetros experimentales son la temperatura, gama, velocidad de lectura, tiempo de equilibrado de baja y alta temperatura y número de análisis de la exploración.
    1. En el recuadro de "Parámetros de temperatura" en la pestaña "Método Experimental", haga clic en el botón para "Calentar". Entre 1 a 100 ° C para las temperaturas experimentales superiores e inferiores, 1 ° C/min para la frecuencia de barrido y 60 s para el período de equilibrio.
    2. Haga clic en el botón "Añadir Series" bajo el campo de entrada para el período de equilibrio. Introduzca 2 en el campo "Los pasos para agregar" en la ventana emergente (para una calefacción y una refrigeración exploración) y marque la casilla de "calefacción/refrigeración alternativa". Haga clic en "Aceptar"; el análisis agregados aparecen en la parte inferior de la interfaz. Compruebe que los parámetros para cada análisis como deseado.
    3. Iniciar el experimento haciendo clic en el botón verde de "play" en la parte superior de la interfaz. Desplácese hasta la carpeta deseada e introduzca un nombre de archivo para guardar el experimento en la ventana emergente. Ver el progreso del experimento haciendo clic en la ficha "Datos" a la derecha de la pestaña "Método de experimento".

3. recoger datos de DSC ligando termolábil

Nota: El procedimiento mínimo consiste en cinco experimentos: experimentos de referencia con y sin ligand del almacenador intermediario (utilizado para la sustracción de la línea de base, ver discusión), experimentos con las biomoléculas gratis, la biomolécula ligando enlazado, la muestra y el biomoléculas de ligando enlazado con un largo periodo de equilibrado de alta temperatura.

  1. Ejecutar experimentos de referencia para restar en base de los datos de ejemplo. Recargar la DSC con tampón de trabajo en ambos tubos capilares y recoger múltiples exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás sobre un rango de temperatura adecuado en 1 ° C min-1 , con una parte superior (alta temperatura) tiempo de equilibrado de 120 s.
    1. Eliminar los anteriores buffer equilibrado análisis de la parte inferior de la interfaz destacando cada uno individualmente y haciendo clic en la X roja a la mitad derecha de la interfaz. Clic en el botón "Añadir Series", escriba 20 en el campo para "Pasos para añadir" y marcar la casilla de "calefacción/refrigeración alternativa" para agregar las nuevas exploraciones. Haga clic en aceptar y ejecutar el experimento haciendo clic en el botón de play verde que el anterior.
    2. Repita los pasos 3.1 - 3.1.1 con tampón de trabajo con la concentración de ligando en ambos vasos capilares para obtener la referencia de experimentos para el ligando (recoger dos experimentos separados 120 s y 600 s alta temperatura equilibrado veces respectivamente, para ser utilizado en la adquisición de la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles).
      Nota: El tipo de análisis utilizado aquí garantiza que las biomoléculas en posteriores experimentos en equilibrio térmico en las exploraciones hacia adelantadas y hacia atrás (ver discusión). Analizar las tasas < 0.1-0.2 ° C min-1 conducen a termogramas ruidosos y no son aplicables en los experimentos de DSC. Las temperaturas deben extenderse desde bien abajo la temperatura de fusión de la biomolécula gratis a muy superior a la temperatura de fusión de biomoléculas saturado de ligando (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar la reproducibilidad de los análisis (por ejemplo, 10 adelante y exploraciones inversas 10 20 total es suficiente).
    3. Si utiliza múltiples ligandos (como la cocaína y quinina), enjuague la DSC con 200 mL de tampón de trabajo (repetición del paso 2.5) entre tramos para quitar el ligando de los capilares y evitar la contaminación cruzada.
      Nota: Es útil realizar un experimento de replicación en la biomolécula libre después de una carrera de ligando enlazado para comprobar si el ligando anterior adsorbe fuertemente a las paredes capilares y no se elimina adecuadamente con tampón de lavado. Si los termogramas de las biomoléculas libre parecen ser cambiado de puesto a una magnitud mayor y una temperatura de desnaturalización después de experimentar el límite de ligando, es probable que el ligando anterior todavía está presente en el calorímetro después del lavado. Quitar el ligando adsorbido por incubación de los tubos capilares con un 20% Contrad 70 por 1 h a 60 ° C con presión asa de los tapones de plástico. En el software de DSC, cambiar el modo experimental a "Isotérmica" en la ficha método Experimental elegir 3.600 s de duración y 60 ° C para la temperatura ambiente, con cero en el tiempo de equilibrado. Haga clic en "Añadir al método Experimental". El experimento isotermo aparece en la parte inferior de la pantalla. Después de la terminación, lave el instrumento con agua 2 L desionizada y repita desde el paso 2.5.
  2. Ejecutar experimentos de muestra utilizando la misma DSC carga procedimiento y parámetros experimentales como la referencia de análisis. Para el conjunto de datos libre de biomoléculas, asegúrese de que el capilar de referencia contiene el buffer de trabajo mientras que el capilar de la muestra contiene la biomolécula libre en la concentración deseada en buffer de trabajo.
    1. Para los experimentos de ligando enlazado, asegúrese de que el ligando se encuentra en el buffer de trabajo en el capilar de referencia y la biomolécula más ligando es en buffer de trabajo en el capilar de la muestra. Limpie el sistema entre adiciones de diferentes ligandos como en el paso 2.5.
  3. Realizar un experimento adicional con las biomoléculas ligada al ligando termolábil donde el período de equilibrio de alta temperatura se aumenta a 600 s y todos los otros parámetros experimentales son las mismas que paso 3.2.1.
    Nota: La duración del periodo de equilibrado de alta temperatura para el experimento segundo ligando enlazado es elegida simplemente para asegurarse de que el ligando es agotado más rápidamente que el experimento de equilibrio corto tiempo. Si los picos ligando enlazado desde el primero experimentan decaimiento lentamente en función del número de análisis (por ejemplo, las diferencias en maxima pico sucesivas son ≤ 0,5 ° C), aumenta de 10 a 20 veces en el periodo de equilibrado de alta temperatura a fin de estimar adecuadamente agotan el ligando durante el segundo experimento. El cálculo exacto de la constante de velocidad para la conversión de ligando requiere que el segundo experimento tiene agotamiento más rápido de ligando con respecto a la primera. Las concentraciones de ligando extraídas del análisis global de los dos experimentos serán similares y por lo tanto inutilizable si el agotamiento del ligando no se acelera suficientemente en el segundo experimento.

4. procesamiento de datos

  1. Abierto el DSC experimentar archivos en el software de análisis de datos de DSC (véase Tabla de materiales) y exportar los datos de potencia bruta como hojas de cálculo.
  2. Importar las hojas de cálculo que contiene los datos de potencia en software para ajuste de datos.
  3. Línea de base restar los datos de la muestra restando los datos de la potencia de búfer y ligando enlazado biomoléculas experimentos.
    Nota: Para el experimento de ligando termolábiles, la concentración de ligando inicial disminuye con cada barrido. Por lo tanto, es ideal para restar la exploración búfer 1 del análisis de la muestra 1 y así sucesivamente. Hemos encontrado que las exploraciones de búfer con la cocaína no cambian apreciablemente como procede de la conversión de ligando y por lo tanto, una exploración de búfer ligando termolábil solo puede utilizarse para restar todos los datos de ligando enlazado termolábiles.
  4. Convertir los datos de potencia muestra resta base para capacidad de calor.
    Nota: La conversión requiere volumen específico parcial de biomoléculas, que puede ser unos14,15,16. La ecuación para la conversión de energía a la capacidad de calor ha sido descrito previamente17.

5. Análisis de datos

  1. A nivel mundial ajuste equilibrado corto tiempo termolábiles ligando enlazado calor capacidad dataset con un conjunto único de base, la concentración de ligando, plegable y ligando vinculante parámetros tal como se describe anteriormente4.
  2. Repita el que ajuste global del conjunto de datos de tiempo de mucho equilibrio para calcular la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles como se describió anteriormente4.

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Representative Results

Datos representativos para el DSC ligando termolábiles se muestran en la figura 1. La posición y altura del pico ligando enlazado termolábil sucesivamente cambios hacia la de las biomoléculas como el ligando termolábil se agota con cada exploración (Figura 1a). El perfil de desnaturalización libre se utiliza como referencia para el punto final de conversión ligando termolábiles (Figura 1b). Datos de MN4 a quinina se muestran como un control negativo para la conversión de ligando termolábiles (Figura 1b). El análisis final ligando termolábiles tienen puntos intermedios de transición ligeramente superiores y alturas de pico en relación con la independiente MN4, indicando que el producto de la conversión del ligando termolábiles (benzoylecgonine) tiene una afinidad débil para MN4. Los parámetros termodinámicos resultantes del análisis global de los conjuntos de datos en la figura 1 se muestran en la tabla 1. Los parámetros de plegado para MN4 en presencia de cocaína o quinina son idénticos dentro de error, como era de esperar puesto que diluido moléculas pequeñas no deben perturbar la termodinámica plegable de la biomolécula gratis. Los parámetros de enlace están en buen acuerdo con los de titulación isotérmica calorimetría (ITC)18 y revelan que la preferencia del MN4 de quinina sobre cocaína está impulsada por una entalpia de enlace más favorable. En la figura 2, aumentando el período de equilibrio de la temperatura alta produce reducciones más pronunciadas de la concentración de ligando termolábil con cada exploración en relación con el conjunto de datos de equilibrio corto período. Utilizando los parámetros de ajuste global optimizado de la concentración de los dos conjuntos de datos, se calcula la constante de velocidad para la conversión de ligando en la temperatura de equilibrio de la alta de la pendiente de la recta en el recuadro de la figura 2 .

Figure 1
Figura 1. Termolábil ligando DSC. (un) termogramas de MN4 (83 μm) salto a la cocaína (concentración inicial 778 μm). Primeras y últimos análisis de MN4 en presencia de ligando se muestran como círculos rojos y azules oscuros mientras que los ajustes correspondientes se muestran como líneas de color. (b) termogramas de MN4 gratis (círculos de 83 μm, negro) y exploraciones sucesivas a la quinina (880 μm, círculos de colores). Se adapta a los conjuntos de datos libre y enlazado a la quinina se muestra como líneas negro y color, respectivamente. Reproducido de la referencia4 con el permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Medición de la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles. (a) sistemas de termogramas para MN4 obligado a cocaína con corto (120 s, rojo oscuro) y equilibrado de largo (600 s, azul oscuro) veces a 80 ° C, respectivamente. (b) las concentraciones de cocaína, extraído de análisis global de los conjuntos de datos en (un) en función del número de análisis. Puntos experimentales y los ajustes exponenciales se muestran como líneas y círculos de colores, respectivamente. El recuadro muestra un ajuste lineal al 19 EQ. complementaria descrita de Harkness et al utilizando las concentraciones de cocaína ajuste global optimizado para los dos conjuntos de datos4. La constante de velocidad para la conversión térmica ligando a 80 ° C se calcula como la pendiente de la línea. Se da el error por la constante de velocidad para la conversión de ligando termolábiles como ± dos desviaciones de estándar. Reproducido de la referencia4 con el permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetros de ajuste Añadido de la cocaína Añadido la quinina
∆HUF 271.3±1.8 272.5±4.0
∆SUF 824.4±5.1 827.9±10.9
un∆GUF 21.6±0.2 21.6±0.9
un∆HB1F -75.2±1.6 -101.0±4.0
un∆SB1F -154.2±5.0 -213.7±12.0
∆CpB1F -1.5±0.1 -1.2±0.1
un∆GB1F -28.5±0.2 -36.2±0.7
un∆HB2F -33.7±1.8 -
un∆SB2F -49.9±5.2 -
∆CpB2F -2.2±0.1 -
un∆GB2F -18.6±0.3 -

Tabla 1. Parámetros termodinámicos extraídos de análisis Global de los conjuntos de datos de DSC de MN4 usando cocaína y ligandos de quinina. Parámetros se calcularon en 30 ° C. B1F se refiere a cocaína o quinina limite Estados plegados y B2F al estado doblado enlazado a benzoilecgonina. ΔH y ΔG se expresaron en kJ/mol, ΔS se expresa en J/mol/K y ΔCp se expresa en kJ/mol/K. errores fueron calculados según el método de la varianza/co-variance19.

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Discussion

Modificaciones y la resolución de problemas

El información de los análisis de montaje global utilizado en la figura 1 y figura 2 ha sido descrito previamente4. Aquí, describimos aspectos prácticos de la realización y análisis de experimentos de unión de DSC con ligandos termolábiles. Tenga en cuenta que una base de DSC obtenidos para el ligando termolábil solo se resta del ligando + conjunto de biomoléculas, cancelando con eficacia hacia fuera el calor liberado o absorbido por la conversión térmica proceso sí mismo. El análisis del ajuste global de ligando termolábiles estándar (figura 1 y figura 2) se supone que el sistema está en equilibrio termodinámico a través de la exploración de la temperatura y que la concentración de ligando termolábil es constante a lo largo de cada termograma, disminuyendo exclusivamente durante el periodo de equilibrado de alta temperatura. Previamente hemos demostrado que esta suposición se aplica a MN4 enlazado a la cocaína y se espera que mantenga por cualquier sistema termolábiles ligando/biomoléculas con cinética similar a estos.

Sin embargo, hay algunas situaciones en las que el sistema no puede suponerse que en equilibrio termodinámico o la concentración de ligando no puede considerarse constante a lo largo de una sola exploración. Estos incluyen i) cuando el ligando térmica convierte rápidamente en relación con la frecuencia de barrido de temperatura, ii) cuando las biomoléculas experimenta agregación irreversible en la temperatura alta, iii) cuando las tasas de plegar/desplegar son lentas en comparación con la frecuencia de barrido, y iv). Cuando las tarifas de asociación/disociación del ligando son lentas en comparación con la frecuencia de barrido. En estos casos, el sistema está bajo control cinético en lugar de termodinámica y el análisis en referencia 4 no se puede aplicar estrictamente. Datos pueden ser simulados cuantitativamente después de figura 3, como se describe en el archivo adicional 1. En principio, estos cálculos basados en la cinética se pueden usar para ajustar datos de DSC de no-equilibrio, potencialmente dando datos cinéticos y termodinámicos, sin embargo, este análisis está fuera del alcance de este documento. En cambio, presentamos algunos datos representativos de DSC simulados para ayudar al lector en la identificación de situaciones de no equilibrio.

Un ejemplo ideal de control termodinámico se muestra en la figura 4ab. Termogramas de DSC de la biomolécula libre son superponibles (figura 4a) y exploraciones con el ligando termolábil no muestran histéresis, tal que la temperatura de fusión observada en la exploración para arriba-coincide con la temperatura plegable de la anterior (abajo-scan Figura 4b). Cuando el ligando termolábil se convierte rápidamente en comparación con la velocidad de lectura, aparecen grandes distorsiones en el termograma y las ecuaciones termodinámicas no tienen en cuenta para la forma del pico, como se muestra en la figura 4C, d. Esto puede ser aliviado algo por aumento de la frecuencia de barrido. Cuando los agregados de biomoléculas en una forma dependiente de la temperatura, rastros de DSC para la demostración de biomoléculas gratis sucesivos disminuye en magnitud (Figura 4e), mientras que la adición del termolábil ligando produce un patrón de disminución térmica sistema similar al caso ideal, pero la escala de la concentración decreciente de biomoléculas (figura 4f). Cuando plegar/desplegar cinéticas son lentas en comparación con la frecuencia de barrido, histéresis es evidente en rastros de DSC de la biomolécula libre tal que la temperatura de desnaturalización evidente en la exploración para arriba-es mayor que la temperatura aparente de renaturalización en el abajo-scan ( Figura 4 g). Adición de un ligando termolábil provoca el patrón familiar de disminución térmica sistema, particularmente para las exploraciones de arriba (figura 4 h). Por último, sistemas plegables de rápido y lento enlace producen histéresis-libre termogramas de DSC para la biomolécula libre (figura 4i), sin embargo los datos con el ligando termolábil muestran histéresis Dónde está la temperatura de fusión aparente de la exploración para arriba- mayor que la aparente temperatura plegable de la abajo-scan anterior (figura 4j). Sin embargo, el patrón típico de disminución térmica sistema son evidentes en exploraciones de arriba y abajo-explora. Comportamiento de no equilibrio en el caso de plegamiento lento o unión cinética puede ser aliviado algo por disminuir la frecuencia de barrido, aunque esto corre el riesgo de conversión térmica ligando no despreciable que ocurren a lo largo de la exploración. En la práctica, la temperatura de equilibrio de la exploración tasa y la parte superior se puede ajustar manualmente para obtener los datos que se asemejan a la figura 4a, b.

Limitaciones de la técnica

Nuestro análisis termodinámico para DSC vinculante experimentos con ligandos termolábiles requiere que el plegamiento y procesos vinculantes son relativamente rápidos y que conversión ligando termolábil es lenta antes de la porción de alta temperatura de cada exploración. Cuando la vida del estado plegado o encuadernado es superior a aproximadamente 30 s (kfuera, ku < 0,03 s-1), histéresis se vuelve discernible en las exploraciones realizadas en 1 ° C min-1. Además, la constante de velocidad de conversión de ligando esté por encima de aproximadamente kc = 10-4 s-1 antes de la transición de la desnaturalización puede ser significativo agotamiento del ligando durante el curso de una exploración individual. Aplicación de nuestro análisis también es inadecuado cuando se produce la agregación irreversible. En estos casos, el modelado más avanzado podría aplicarse a los datos. No hay información de afinidad está disponible si ligando la conversión es tan rápida que llegue a completar antes de la primera transición de desnaturalización.

Importancia con respecto a los métodos existentes

Nuestro método por primera vez permite DSC para ser utilizado para medir la termodinámica de unión de alta afinidad, ligandos termolábiles. Realizando un análisis global simultánea de todos los escaneos, parámetros termodinámicos son extraídos con alta exactitud20. Un beneficio adicional es que el conjunto completo de datos pueden recogerse en tan poco como un experimento si el producto de conversión térmica no tiene ninguna afinidad para las biomoléculas gratis. En cambio, requiere de una serie de DSC experimental típico para un ligando no termolábiles ~ experimentos total 7-10.

Futuras aplicaciones

Este enfoque tiene aplicaciones directas para caracterizar inhibidores apretados, termolábiles en campañas del descubrimiento de drogas. Varios compuestos terapéuticos tales como antibióticos y benzodiazepinas son conocidos por ser termolábil, sometidos a hidrólisis rápida en o cerca del pH fisiológico y temperatura de ~ 60-70 ° C11. Este método DSC está bien posicionada para identificar y caracterizar muchos más. Así, modificación del protocolo apropiado para tener en cuenta para los sistemas bajo control cinético en lugar de termodinámica, como hemos comentado anteriormente, tiene el potencial para abrir la puerta a muchos más sistemas de importancia biológica.

Pasos críticos en el protocolo

Uno de los procedimientos experimentales más importantes a tener en cuenta es la diálisis o el cambio de la biomolécula y ligando en idénticas soluciones tampón de trabajo (pasos de protocolo 1.3-1.6). Desajuste de buffer entre el ligando y biomoléculas soluciones puede llevar a grandes artefactos en las exploraciones iniciales y muestra que oscurecen completamente los datos relevantes de plegables. Además, es esencial que la lectura de energía se estabilice antes de que el DSC es presurizado por lo que pueden ser monitoreado durante la presurización (paso 2.3 del Protocolo). Si la lectura de potencia cambia más de ~ 10 MW durante la presurización, las burbujas han formado probablemente en los capilares y puede causar grandes artefactos en los datos. En este caso, las soluciones deben desgasificarse más a fondo.

Figure 3
Figura 3. Biomolecular plegable, Unión a un ligando termolábil y agregación Irreversible. El ligando termolábil (L) convierte al producto (X) con una tasa constante kc. X no tiene ninguna afinidad para las biomoléculas. El estado encuadernado (B) de los intercambios de biomoléculas con el doblado estado (F) con tasa constantes kfuera y ken. Intercambios con el estado desplegado (U) con tasa constantes ku y kfF. U se convierte irreversiblemente en el estado agregado (A) con la tasa constante kagg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Experimentos de simulación de equilibrio y controlada cinéticamente DSC en la ausencia y la presencia de un ligando termolábil. (a) equilibrio biomolecular plegamiento. (b) equilibrio de plegamiento, ligando termolábiles y conversión lenta ligando termolábiles. (c) equilibrio biomolecular plegable. (d) equilibrio plegable, ligando termolábiles y conversión ligando rápido termolábiles. (e) equilibrio biomolecular plegable y lenta agregación irreversible. (f) equilibrio plegado, encuadernación, lenta conversión ligando termolábiles y lenta agregación irreversible. (g) lenta biomolecular plegable. plegables (h) lenta, enlace de equilibrio y conversión lenta ligando termolábiles. () equilibrio biomolecular plegable. (j) equilibrio de plegamiento lento ligando termolábiles y conversión lenta ligando termolábiles. En todos los paneles, las primeras y la últimas exploraciones simuladas son azul oscuro y rojo, respectivamente. Paneles que muestran los termogramas azul sólo claras y oscuras indican que superposición todas exploraciones simuladas, y sólo los dos últimos son visibles en la trama. Experimentos de DSC se simularon con 20 exploraciones (10 fusión y 10 recocido) en 1 ° C min-1 tarifa de exploración, con un rango de temperatura de 0-80 ° C. Ciertos paneles muestran las gamas de temperaturas más estrechas para permitir la mejor visualización de las tendencias de la simulación. Las concentraciones de biomoléculas y ligando en las simulaciones fueron 200 μm y 10 mM, respectivamente. Cada experimento fue simulado con un tiempo de equilibrado de s 600 a 0 ° C antes de la exploración y una 60 s equilibrar el tiempo entre cada una de las exploraciones posteriores. Parámetros de Arrhenius equilibrio encuadernación y plegado fueron unen = 5 x 10-1 M-1 s-1, unoff = 1 x 1019 s-1, Eunen =-20 kJ mol-1, Eun apagado = 120 kJ mol-1, undoble = 1 x 10-14 s-1, undespliegue = 5 x 1018Eundoble =-80 kJ mol-1y Eundespliegue = 120 kJ mol-1 . Parámetros de Arrhenius para controlada cinéticamente atar y plegable fueron unen = 5 x 10-3 M-1 s-1, unoff = 1 x 1016 s-1, Eunen =-20 kJ mol-1, E un apagado = 120 kJ mol-1, undoble = 1 x 10-16 s-1, undespliegue = 5 x 1016, Eundoble =-80 kJ mol-1y Eundespliegue = 120 kJ mol-1 . Parámetros de Arrhenius para la conversión de lenta y rápida ligando termolábiles eranlento = 7.509 x 1010 s-1, Eunlento = 94.65 kJ mol-1y unrápido = 1 s-1, Eun rápido = 10 kJ mol-1. Parámetros de Arrhenius para la lenta agregación irreversible fueron unagg. = 5 x 107 s-1 y Eunagg. = 80 kJ mol-1. Exceso de calor de capacidades se calcularon con ΔHUF (despliegue), ΔHBF (enlace) y ΔHAF (agregación) = 200 -140 y 50 kJ mol-1, respectivamente. La descripción teórica de DSC cinéticamente controlado experimentos con ligandos termolábiles y script para realizar estas simulaciones (y los parámetros necesarios) están disponibles en complementario 1 archivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Disclosures

Los autores no declaran conflictos de interés.

Acknowledgments

R. W. H. V fue apoyado por el programa de formación ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC) en Bionanomachines y Ciencias naturales de McGill. A. K. M. y P. E. J. fueron apoyados por donaciones NSERC 327028-09 (A. K. M) y 238562 (P. E. J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Chem Impex #00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71502
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9763
Deioinized water for molecular biology Millipore H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters VWR CA28145-477
3 kDa centrifugal filters Millipore UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff Spectrum Laboratories 131048
Silicon tubing VWR 89068-474
Plastic DSC flange caps TA Instruments 6111
DNA aptamer MN4 Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine Sigma Aldrich C008
Quinine Sigma Aldrich 22620
NanoDSC-III microcalorimeter TA Instruments http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70 VWR 89233-152

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References

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Bioquímica número 129 diferencial Análisis de calorimetría termodinámica cinética doblar atar ligandos termolábiles descubrimiento de fármacos
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Harkness V, R. W., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. J. Vis. Exp. (129), e55959, doi:10.3791/55959 (2017).

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