Summary
Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.
Abstract
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige techniek voor het kwantificeren van de thermodynamische parameters bestuur biomoleculaire vouwen en bindende interacties. Deze informatie is cruciaal in het ontwerp van nieuwe farmaceutische stoffen. Er zijn echter vele farmaceutisch relevante liganden chemisch onstabiele bij de hoge temperaturen gebruikt in DSC analyses. Dus is bindende interacties te meten uitdagend omdat de concentraties van liganden en thermisch-geconverteerde producten voortdurend binnen de calorimeter-cel veranderen. Hier presenteren we een protocol met behulp van thermolabile liganden en DSC voor het snel verkrijgen thermodynamische en kinetische gegevens op de vouwing, bindende en ligand conversie processen. We hebben onze methode toegepast op de aptamer van DNA MN4 dat zich aan de thermolabile ligand cocaïne bindt. Met behulp van een nieuwe globale montage analyse die goed is voor thermolabile ligand conversie, de complete set van vouwen en bindende parameters worden verkregen van een paar van DSC experimenten. Bovendien laten we zien dat de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie met slechts één aanvullende DSC dataset kan worden verkregen. De richtsnoeren voor het identificeren en analyseren van gegevens uit verschillende ingewikkelder scenario's worden gepresenteerd, met inbegrip van onomkeerbare bundeling van de Biomolecuul, langzame vouwing, langzame bindende en snelle uitputting van de thermolabile ligand.
Introduction
Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige methode om quantitating biomoleculaire bindende en opvouwbare interacties1,-2,3. De sterke punten van DSC omvatten haar capaciteit te verhelderen bindend en vouwen van mechanismen en opleveren van het desbetreffende thermodynamische parameters2,3. Bovendien, DSC kan worden uitgevoerd in de oplossing in de buurt van de fysiologische omstandigheden en vereist geen etikettering van de Biomolecuul of ligand, bijvoorbeeldmet fluorophores, spin-etiketten of nucleaire isotopen4. Het instrument scant in temperatuur, het meten van de hoeveelheid warmte die nodig is om te denatureren van de Biomolecuul in de aanwezigheid en de afwezigheid van ligand. De resulterende thermograms worden gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters betreffende de ligand bindend en vouwen van processen. De door de DSC- of andere thermodynamische technieken verstrekte informatie is cruciaal voor het begeleiden van het ontwerp van drugs gericht op biomoleculen1,5,6,7,8. Echter de herhaalde scannen naar hoge temperaturen (~ 60-100 ° C) problematisch kan zijn. Bijvoorbeeld, veel farmaceutisch belangrijke stoffen ondergaan omlegging of ontleding bij langdurige blootstelling aan hoge temperaturen9,10,11, dat wil zeggen, ze zijn thermolabile. Behandeling van bindende interacties door DSC meestal meebrengt dat meerdere voorwaartse en omgekeerde scans om na te gaan van de reproduceerbaarheid van het thermogram voor thermodynamische analyses12. Thermische conversie van een eerste ligand naar een secundaire vorm met gewijzigde bindende eigenschappen leidt tot uitgesproken verschillen in de vorm en positie van opeenvolgende thermograms, aangezien de concentratie van de oorspronkelijke ligand met elke scan terwijl afneemt de thermische conversie producten ophopen. Deze datasets zijn niet vatbaar voor traditionele analyses.
Onlangs hebben we een globale montage methode voor thermolabile ligand DSC datasets dat de opbrengst van de complete set van thermodynamische parameters betreffende de Biomoleculaire vouwen en bindende interacties van een enkele ligand-gebonden experiment waarnaar wordt verwezen naar de vereiste thermogram voor de gratis Biomolecuul4. De analyse vermindert de experimentele tijd en monster vereist door ~ 10-fold in vergelijking met standaard DSC benaderingen. We hebben goed voor ligand thermische conversie door de veronderstelling dat dit gebeurt tijdens het gedeelte van de hoge temperatuur van elke scan waar de thermogram niet afhankelijk ligand concentratie. Daarom is de ligand concentratie een constante in het gedeelte van het thermogram die wordt gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters. We laten bovendien zien hoe de constant voor ligand thermische conversie kan worden verkregen door het uitvoeren van één aanvullende experiment met een langere equilibratietijd hoge temperatuur. Voor systemen waar ligand thermische conversie minder afhankelijk van de temperatuur is (dat wil zeggen, zich merkbaar bij alle temperaturen), de analyse kan worden gewijzigd als u wilt opnemen van variabele ligand concentraties. Hier laten wij zien deze procedure voor de aptamer van DNA MN4 in aanwezigheid van de cocaïne thermolabile ligand, die snel worden omgezet in benzoylecgonine bij hoge temperaturen (> 60 ° C). Kinine wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability omdat het geen conversie bij deze experimentele temperaturen ondergaan en ook aan MN4 bindt. We beschrijven de overname van thermolabile ligand DSC datasets en hun analyse opbrengst thermodynamische en kinetische parameters van de vouwing, bindende en ligand conversie processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de monstervoorbereiding
- Zuiveren de gewenste Biomolecuul13.
Opmerking: Dit protocol gebruikt gekocht cocaïne-bindende DNA aptamer MN4 na uitwisselen tegen 2 M NaCl driemaal gevolgd door drie rondes van gedeïoniseerd water met behulp van een centrifugaal filter met een 3 kDa molecuulgewicht cut-off membraan. - Synthetiseren en zuiveren, of koop het gewenste thermolabile ligand-13.
Opmerking: MN4 bindt de thermolabile ligand cocaïne. MN4 bindt ook kinine, die wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability bij deze experimentele temperaturen. - Buffers voorbereiden door dialyse van de gezuiverde Biomolecuul en ontbinding van liganden (20 mM natriumfosfaat en 140 mM NaCl buffer, pH 7.4, voor MN4 en de liganden gebruikt hier).
- Dialyze de Biomolecuul tegen ten minste 2 liter voor buffer met behulp van dialyse buis met 0,5 - 1,0 kDa cut-off.
- Filtreer de definitieve buffer (hierna: werkende buffer) door een 0,2 µm filter dat grondig heeft zijn geëquilibreerd met buffer.
- Weeg de gewenste massa's van de liganden en los ze op in gefilterde werkende buffer. Als de gewenste ligand concentraties massa's die te klein vereist zijn om nauwkeurig wegen, maken een geconcentreerde ligand-stockoplossing (10 x bijvoorbeeld).
Opmerking: Het is van cruciaal belang dat alle DSC experimenten de zelfde werkende buffer voor het monster gebruiken en ligand, dat wil zeggen, nooit uit te voeren een experiment waar de ligand wordt opgelost in een andere partij van werkende buffer dan de Biomolecuul omdat dit zal leiden tot de buffer mismatch artefacten in de gegevens. - Filtreer de stockoplossing Biomolecuul door een 0,2 µm filter dat grondig heeft zijn geëquilibreerd met werkende buffer.
- Bepaal de concentratie Biomolecuul extinctie metingen (260 nm voor nucleic zuren zoals MN4 en 280 nm voor eiwitten).
- Opslaan van de bereid Biomolecuul en ligand in de koelkast 4 ° C (geschikt voor MN4 en de liganden gebruikt hier), of bij -20 of -80 ° C als de Biomolecuul en liganden bevriezing en lange termijn opslag tolereren vereist is. Degas de buffer en Biomolecuul ligand oplossingen in een tafelblad Ontgasser (Zie Tabel van materialen) vóór het laden in de DSC.
Opmerking: Ontgassing helpt te voorkomen dat de zeepbel vorming in de DSC bij hogere temperaturen. Bubbels veroorzaken signaal artefacten die obscure DSC piek vormen en basislijnen.
2. DSC voorbereiding
- Draai het handvat van de druk van de DSC (Zie Tabel van materialen).
- Siliconen slang uit de werkende buffer uitvoeren en deze koppelen aan de voorste flens (metalen openen) van het referentie-capillair.
- Geen brug maken tussen de referentie- en monster haarvaten door het aansluiten van de achterste referentie-flens aan de voorzijde monster flens.
- Een stuk van silicium buis hechten aan de achterste monster-flens die over in een maatkolf van afval met een vacuüm lijn toegevoegd loopt.
- De vacuüm lijn voor het spoelen van de DSC met 200 mL werkende buffer inschakelen.
- Laad de verwijzing capillair van de DSC met werkende buffer. Ongeveer 3-5 cm secties van silicium buis aan koppelen de verwijzing capillaire flenzen.
- Een 1 mL pipet tip invoegen in de achterste flens Siliconen slang. Tekenen van 0,8 milliliters werkende buffer met een pipet en breng de tip van de pipet met buffer in de voorste referentie flens van silicium buis.
- Druk zachtjes op de zuiger van de pipet naar pass de buffer werken via de voorste Siliconen slang in het capillair verwijzing en tot in de achterste flens aangesloten pipette uiteinde. De plunjer van de Pipet ingedrukt te houden totdat de buffer werkniveau net boven de voorste silicium-tubing bereikt, en laat vervolgens de plunjer van de pipet totdat de buffer werkniveau net boven de achterste silicium-buis bereikt.
- Herhaal langs de werkende buffer om heen en weer te zuiveren van het volume in het capillair referentie van bubbels.
Opmerking: Meestal 10 doorgangen van de oplossing heen en weer zijn voldoende om alle bubbels wissen.
- Herhaal langs de werkende buffer om heen en weer te zuiveren van het volume in het capillair referentie van bubbels.
- Cap de achterste pipette uiteinde met de duim en voorzichtig optrekken op de achterste pipette uiteinde en front pipet om ze te verwijderen uit de verwijzing flenzen met de Siliconen slang aangesloten.
- Het laden van het monster capillair met werkende buffer zoals in stappen 2.6-2.9. Plaats een zwarte plastic dop op de achterste verwijzing en proef de flenzen, verlaten de voorzijde flenzen aan het licht gebracht.
- Bevestig de druk greep.
- De DSC-software niet openen (Zie Tabel van materialen) en druk uitoefenen van het instrument door te klikken op de rode pijl aan de bovenkant van de interface omhoog zodra de macht lezing gestabiliseerd; de DSC-macht wordt aangegeven in een doos bij de bovenkant van de interface samen met de instrument temperatuur en druk lezing.
Opmerking: Monitor de bevoegdheid lezen als de DSC pressurizes. Veranderingen in de kracht van meer dan ~ 10 μW geven luchtbel vorming in de haarvaten, die leiden artefacten in de gegevens tot kan. De oplossingen moeten worden verwijderd en ontgast verdere voordat u verdergaat. - Equilibreer de DSC met werkende buffer door een voorwaartse en omgekeerde scan uit te voeren. Zorg dat de "Scannen" optie uit te voeren van de DSC in temperatuur scanmodus is geselecteerd in het tabblad "Experimentele methode" aan de linkerzijde van het scherm.
Opmerking: Experimentele parameters zijn de temperatuur bereik, scanfrequentie, hoge en lage temperaturen equilibratietijd en aantal scans scannen.- De inzet van de "Temperatuur Parameters" onder het tabblad "Experimentele methode", klik op de knop voor "Verwarming". Voer 1 en 100 ° C voor de boven- en ondergrenzen experimentele temperaturen, 1 ° C/min. voor de scan rate en 60 s voor de periode van evenwichtsinstelling.
- Klik op de knop "Toevoegen Series" onder het invoerveld voor de periode van evenwichtsinstelling. Geef 2 op in het veld 'Stappen om toe te voegen' in het pop-up venster (voor één verwarming en één koeling scan) en vink het vakje "alternatieve verwarming/koeling". Klik op "OK"; de toegevoegde scans worden weergegeven in het onderste gedeelte van de interface. Controleer of de parameters voor elke scan als zijn gewenste.
- Start het experiment door te klikken op de groene "play" knop aan de bovenkant van de interface. Navigeer naar de gewenste map en een bestandsnaam voor het opslaan van het experiment in het pop-upvenster kunnen invoeren. Het experiment voortgang weergeven door te klikken op het tabblad "Gegevens" rechts van het tabblad "Experimenteren methode".
3. het verzamelen van Thermolabile Ligand DSC Datasets
Opmerking: De minimale procedure bestaat uit vijf experimenten: buffer referentie experimenten met en zonder ligand (gebruikt voor aftrekken van de basislijn, Zie discussie), proeven van experimenten met de gratis Biomolecuul, de ligand-gebonden Biomolecuul, en de ligand-gebonden Biomolecuul met een langere equilibratietijd hoge temperatuur.
- Referentie experimenten voor aftrekken van de basislijn van de voorbeeldgegevens worden uitgevoerd. Laden van de DSC met werkende buffer in beide haarvaten en verzamelen van meerdere scans voor voorwaartse en omgekeerde over een passende temperatuurbereik bij 1 ° C min-1 met een bovenste (hoge temperatuur) equilibratietijd van 120 s.
- De vorige buffer evenwichtsinstelling scans uit het onderste gedeelte van de interface verwijderen door elk afzonderlijk te markeren en te klikken op de rode X naar het midden rechts van de interface. De nieuwe scans toevoegen door te klikken op de knop "Toevoegen Series", 20 invoeren in het veld voor "Stappen om toe te voegen" en de "alternatieve verwarming/koeling" vakje aan te vinken. Klik op OK en voer het experiment door te klikken op de groene afspeelknop zoals hierboven.
- Herhaal stap 3.1 - 3.1.1 met werkende buffer met de gewenste concentratie van ligand in beide haarvaten de objectverwijzing experimenten voor de ligand (verzamelen van twee aparte experimenten met behulp van 120 s en 600 s hoogtemperatuur evenwichtsinstelling tijden respectievelijk worden gebruikt in het verwerven van de tarief-constante voor thermolabile ligand conversie).
Opmerking: De hier gebruikte scanfrequentie zorgt ervoor dat de Biomolecuul in latere experimenten bij thermisch evenwicht in de voorwaartse en omgekeerde scans (Zie discussie). Scan tarieven < 0,1-0,2 ° C min-1 leiden tot een luidruchtige thermograms en zijn niet van toepassing in DSC experimenten. De temperaturen moeten uitbreiden uit put beneden de smelttemperatuur van de gratis Biomolecuul tot ruim boven de smelttemperatuur van Biomolecuul ligand-verzadigd (~ 20-80 ° C voor MN4). Controleer de reproduceerbaarheid van de scans (bij voorbeeld, 10 vooruit en 10 omgekeerde scans voor 20 totaal is voldoende). - Als meerdere liganden (zoals cocaïne en kinine) gebruikt, spoel de DSC met 200 mL werkende buffer (Herhaal vanaf stap 2.5) tussen runs ligand verwijderen uit de haarvaten te voorkomen van kruisbesmetting.
Opmerking: Het is nuttig om te voeren een repliceren experiment op de gratis Biomolecuul na een run ligand-gebonden om te controleren of de vorige ligand sterk aan de capillaire wanden absorbeert en is niet voldoende verwijderd met de buffer leegmaken. Als de thermograms voor de gratis Biomolecuul lijken te worden verschoven naar een grotere omvang en hogere denaturatie temperatuur na de ligand-gebonden experimenteren, is het waarschijnlijk dat de vorige ligand nog steeds aanwezig in de calorimeter na het spoelen is. De geadsorbeerde ligand verwijderen door het broeden van de haarvaten met 20% Contrad-70 gedurende 1 uur bij 60 ° C met de plastic doppen en druk handvat af. De DSC-software, Wijzig in de experimentele modus "Isothermische" onder de tab. Kies 3.600 s van de experimentele methode voor de duur en 60 ° C voor de isothermische temperatuur, met nul voor de equilibratietijd ingevoerd. Klik op "Toevoegen aan experimentele methode". De isothermische experiment wordt weergegeven in het onderste gedeelte van het scherm. Na voltooiing, het instrument met 2 L gedeïoniseerd water spoelen en herhaal vanaf stap 2.5.
- Monster experimenten met behulp van hetzelfde DSC laden procedure en experimentele parameters zoals de verwijzing scandering uitvoeren Controleer het capillair verwijzing bevat de werkende buffer terwijl het capillair monster de gratis Biomolecuul op de gewenste concentratie in werkende buffer bevat voor de gegevensset gratis Biomolecuul.
- Voor de ligand-gebonden experimenten, Controleer dat de ligand in de buffer van de werken in het capillair verwijzing is en de Biomolecuul plus ligand in werkende buffer in het capillair monster. Spoel het systeem tussen toevoegingen van verschillende liganden zoals in stap 2.5.
- Voer een extra experiment met de Biomolecuul gebonden aan de thermolabile ligand waar de hoge temperatuur evenwichtsinstelling periode wordt verhoogd tot 600 s en alle andere experimentele parameters zijn hetzelfde als stap 3.2.1.
Opmerking: De duur van de evenwichtsinstelling hoge temperatuur voor het tweede ligand-gebonden experiment is gewoon gekozen om ervoor te zorgen dat de ligand sneller verarmd dan het korte evenwichtsinstelling tijd experiment. Als het ligand-gebonden pieken van de eerste verval langzaam als functie van de scan nummer experimenteren (bijvoorbeeldde verschillen in opeenvolgende piek maxima zijn ≤ 0,5 ° C), 10 - aan 20 keer verhogingen gedurende de evenwichtsinstelling hoge temperatuur om te schatten voldoende uitputten het ligand tijdens het tweede experiment. De nauwkeurige berekening van de constant voor ligand omzetting vereist dat de tweede experiment snellere uitputting van het ligand ten opzichte van de eerste heeft. De concentraties van de ligand geëxtraheerd uit de globale analyse van de twee experimenten zullen soortgelijke en dus onbruikbaar als het ligand uitputting wordt niet voldoende versneld in het tweede experiment.
4. verwerking van de gegevens
- Open de DSC experimenteren bestanden in de software van de analyse van de gegevens van DSC (Zie Tabel van materialen) en de rauwe kracht gegevens exporteren als werkbladen.
- De spreadsheets met de ruwe kracht gegevens in software voor data passend importeren.
- De voorbeeldgegevens basislijn aftrekken door af te trekken van de buffer gegevens van de macht van het vrije verkeer en de ligand-gebonden Biomolecuul experimenten.
Opmerking: Voor de thermolabile ligand-experiment, de concentratie van de oorspronkelijke ligand afneemt met elke scan. Het is daarom ideaal om aftrekken van de buffer scan 1 van monster scan 1, enzovoort. We hebben vastgesteld dat de buffer scans met cocaïne niet aanzienlijk veranderen als de ligand conversie opbrengst en daarom een enkele thermolabile ligand buffer scan kan worden gebruikt voor alle thermolabile ligand-gebonden gegevens aftrekken. - De macht voorbeeldgegevens basislijn-afgetrokken omzetten in warmtecapaciteit.
Opmerking: De conversie vereist van de Biomolecuul gedeeltelijke specifieke volume, die naar schatting14,15,16 worden kan. De vergelijking voor het omzetten van stroom naar warmtecapaciteit heeft al eerder beschreven17.
5. de gegevensanalyse
- Wereldwijd passen de korte evenwichtsinstelling tijd thermolabile ligand-gebonden warmtecapaciteit dataset met een enkele set van basislijn, ligand concentratie, vouwen en ligand bindende parameters zoals eerder beschreven4.
- Herhaal dat de globale geschikt voor de lange evenwichtsinstelling tijd dataset om te berekenen van de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie zoals eerder beschreven4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve gegevens voor de thermolabile ligand-DSC zijn afgebeeld in Figuur 1. De positie en de hoogte van de thermolabile ligand-gebonden piek verschuift achtereenvolgens naar beneden naar die van de niet-afhankelijke Biomolecuul aangezien de thermolabile ligand is uitgeput met elke scan (Figuur 1a). Het gratis denaturatie profiel wordt gebruikt als referentie voor het eindpunt van de thermolabile ligand conversie (Figuur 1b). Gegevens voor MN4 gebonden aan kinine worden weergegeven als een negatieve controle voor thermolabile ligand conversie (Figuur 1b). De definitieve thermolabile ligand-scans hebben iets hogere overgang middelpunten en piekhoogten ten opzichte van de niet-afhankelijke MN4, die aangeeft dat het thermolabile ligand conversie product (benzoylecgonine) heeft een zwakke affiniteit voor MN4. De thermodynamische parameters die voortvloeien uit de globale analyse van de datasets in Figuur 1 staan in tabel 1. De opvouwbare parameters voor MN4 in aanwezigheid van de cocaïne of kinine bevatten zijn identiek in fout, zoals verwacht aangezien verdunde kleine molecules wordt niet verwacht dat erover de opvouwbare thermodynamica van de gratis Biomolecuul. De bindende parameters zijn in goede overeenkomst met die van isothermische titratie calorimetrie (ITC)18 en onthullen dat MN4 de voorkeur voor kinine over cocaïne wordt gedreven door een gunstiger bindende enthalpie. In Figuur 2levert verhoging van de periode van de evenwichtsinstelling hoge temperatuur meer uitgesproken verlaging van de concentratie van thermolabile ligand met elke scan ten opzichte van de korte evenwichtsinstelling periode dataset. Met de geoptimaliseerde global fit concentratie parameters van de twee datasets, de constante tarief voor ligand conversie op de hoge evenwichtsinstelling temperatuur is berekend op basis van de helling van de lijn in de Figuur 2 inzet.
Figuur 1. Thermolabile ligand DSC. (een) Thermograms van MN4 (83 µM) gebonden aan cocaïne (beginconcentratie 778 µM). Eerste en laatste scans van MN4 in aanwezigheid van ligand worden weergegeven als donkere rode en blauwe kringen, terwijl de bijbehorende past worden weergegeven als gekleurde lijnen. (b) Thermograms van gratis MN4 (83 µM, zwarte cirkels) en opeenvolgende scans gebonden aan kinine (880 µM, gekleurde cirkels). Past bij de vrije en kinine-gebonden datasets worden weergegeven als zwarte en gekleurde lijnen, respectievelijk. Gereproduceerd van referentie4 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Het meten van de Constant voor Thermolabile Ligand conversie. (een) Sets van thermograms voor MN4 gebonden aan cocaïne met korte (120 s, donkerrood) en lange (600 s, donkerblauw) evenwichtsinstelling keer bij 80 ° C, respectievelijk. (b) concentraties van cocaïne geëxtraheerd uit globale analyse van de datasets in (een) als een functie van scan nummer. Experimentele punten en exponentiële past worden respectievelijk weergegeven als gekleurde cirkels en lijnen. De inzet toont een lineaire pasvorm tot en met de eerder beschreven aanvullende Eq. 19 van Harkness et al. met de geoptimaliseerde global fit cocaïne concentraties voor de twee datasets4. De constant voor de thermische conversie ligand bij 80 ° C wordt berekend als de helling van de lijn. De fout voor de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie wordt gegeven als ± twee standaarddeviaties. Gereproduceerd van referentie4 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Fit parameters | Cocaïne toegevoegd | Kinine toegevoegd |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆SUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| een∆GUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| een∆HB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| een∆SB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| ∆CpB1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| een∆GB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| een∆HB2F | -33.7±1.8 | - |
| een∆SB2F | -49.9±5.2 | - |
| ∆CpB2F | -2.2±0.1 | - |
| een∆GB2F | -18.6±0.3 | - |
Tabel 1. Thermodynamische Parameters geëxtraheerd uit globale analyse van de MN4 DSC Datasets met behulp van cocaïne en kinine liganden. Parameters werden berekend bij 30 ° C. B1F verwijst naar cocaïne - of kinine-gebonden gevouwen Staten en B2F verwijst naar de benzoylecgonine-gebonden gevouwen. ΔH en ΔG worden uitgedrukt in kJ/mol, ΔS wordt uitgedruct in J/mol/K en ΔCp wordt uitgedrukt in kJ/mol/K. fouten werden berekend volgens de variantie/co-variance methode19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wijzigingen en probleemoplossing
De details van de analyse van de wereldwijde montage gebruikt in Figuur 1 en Figuur 2 zijn eerder4beschreven. We schetsen hier, praktische aspecten van het uitvoeren en analyseren van DSC bindende experimenten met thermolabile liganden. Merk op dat een basislijn DSC verkregen voor de thermolabile ligand alleen wordt afgetrokken van het ligand + Biomolecuul dataset, effectief annuleren uit de hitte vrijgegeven of geabsorbeerd door de thermische conversie proces zelf. De standaard thermolabile ligand global montage analyse (Figuur 1 en Figuur 2) wordt ervan uitgegaan dat het systeem bij Thermodynamisch evenwicht gedurende de temperatuur scan is en dat de concentratie thermolabile ligand constante gedurende elke thermogram, afnemende uitsluitend tijdens de periode van de evenwichtsinstelling hoge temperatuur. Wij hebben eerder aangetoond dat deze veronderstelling is van toepassing op cocaïne-gebonden MN4 en verwachting te houden voor elk thermolabile ligand/Biomolecuul systeem met kinetiek vergelijkbaar met deze.
Er zijn echter bepaalde situaties waarin het systeem kan niet worden aangenomen dat bij Thermodynamisch evenwicht en/of de concentratie van ligand niet constant een enkele scan worden beschouwd. Deze omvatten i) wanneer de ligand thermisch snel ten opzichte van de temperatuur scan rate, converteert ii) wanneer de Biomolecuul onomkeerbare aggregatie op hoge temperatuur, ondergaat iii) wanneer de vouwen/ontvouwen tarieven traag vergeleken met de scan rate zijn, en iv). Wanneer de ligand vereniging/dissociatie tarieven zijn traag vergeleken met de scan rate. In deze gevallen, het systeem is onder kinetische in plaats van thermodynamische controle en de analyse gegeven in referentie 4 kan niet strikt worden toegepast. Gegevens kunnen kwantitatief worden gesimuleerd na Figuur 3, zoals beschreven in de aanvullende bestand 1. In principe kunnen deze kinetiek gebaseerde berekeningen aan niet-evenwichts DSC gegevens, potentieel levert zowel kinetische en thermodynamische gegevens, maar deze analyse buiten het bestek van dit document valt worden gebruikt. In plaats daarvan, presenteren we enkele representatieve gesimuleerde DSC-gegevens om te helpen de lezer in het identificeren van niet-evenwichts situaties.
Een ideaal voorbeeld van thermodynamische controle wordt weergegeven in figuur 4ab. DSC thermograms van de gratis Biomolecuul superimposable (figuur 4a) en scans met de thermolabile ligand vertonen geen hysteresis, zodanig dat de smelttemperatuur waargenomen op de up-scan overeenkomt met de opvouwbare temperatuur van de vorige down-scan ( Figuur 4b). Wanneer de thermolabile ligand snel converteert vergeleken met de scan rate, grote verstoringen in de thermogram weergegeven en de thermodynamische vergelijkingen geen rekening met de vorm van de piek, zoals weergegeven in Figuur 4 c, d. Dit kan enigszins verlicht door het verhogen van de scan rate. Als de Biomolecuul aggregaten in een temperatuur-afhankelijke manier, DSC sporen voor de gratis Biomolecuul show opeenvolgende afneemt in omvang (figuur 4e), terwijl de toevoeging van produceert de thermolabile ligand een patroon van het verminderen van thermische upshifts vergelijkbaar met het ideale geval, maar geschaald door de afnemende Biomolecuul concentratie (figuur 4f). Wanneer vouwen/ontvouwen kinetiek zijn traag vergeleken met de scan rate, hysteresis is herkenbaar in DSC sporen van de gratis Biomolecuul zodanig zijn dat de temperatuur van de schijnbare denaturatie op de up-scan hoger dan de temperatuur van de schijnbare renaturatie op de down-scan is ( Figuur 4 g). Toevoeging van een thermolabile ligand leidt tot het bekende patroon van het verminderen van thermische upshifts, met name voor de up-scans (Figuur 4 h). Ten slotte, systemen met snelle vouwen en langzame bindende produceren DSC thermograms hysteresis-gratis voor de gratis Biomolecuul (figuur 4i), maar gegevens met de thermolabile ligand blijkt hysteresis waar de schijnbare smelttemperatuur van de up-scan hoger dan de schijnbare opvouwbare temperatuur van de vorige down-scan (figuur 4j). Het typische patroon van de vermindering van de thermische upshifts zijn echter herkenbaar in zowel up-scans en down-scans. Niet-evenwichts gedrag in het geval van langzame vouwen of bindende kinetiek kunnen enigszins verlicht door het verminderen van de scan rate, hoewel dit loopt het risico niet te verwaarlozen ligand thermische conversie die zich voordoen tijdens de scan. In de praktijk kan de scan rate en bovenste evenwichtsinstelling temperatuur handmatig worden aangepast om gegevens lijkend op figuur 4a, bte verkrijgen.
Beperkingen van de techniek
Onze thermodynamische analyse voor DSC bindend experimenten met thermolabile liganden vereist dat de vouwen en bindende processen relatief snel zijn en dat thermolabile ligand conversie traag voorafgaand aan het gedeelte van de hoge temperatuur van elke scan is. Wanneer de levensduur van de gevouwen en/of afhankelijke staat groter is dan ongeveer 30 s (kuit, ku < 0.03 s-1), hysteresis wordt onderscheiden in scans uitgevoerd op 1 ° C min-1. Bovendien, wanneer de ligand conversie constant bedraagt ongeveer kc = 10-4 -s-1 vóór de overgang van denaturatie, kan er aanzienlijke uitputting van het ligand in de loop van een enkele scan. Toepassing van onze analyse is ook ongepast als onomkeerbaar samenvoeging plaatsvindt. In deze gevallen, kan geavanceerdere modellen worden toegepast op de gegevens. Er is geen affiniteit informatie beschikbaar als ligand conversie zo snel is dat het voltooiing voorafgaand aan de eerste denaturatie overgang bereikt.
Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Onze methode voor de eerste keer kunt op DSC om te worden gebruikt voor het meten van de bindende thermodynamica van hoge affiniteit, thermolabile liganden. Door het uitvoeren van een globale gelijktijdige analyse van alle scans, worden thermodynamische parameters geëxtraheerd met hoge nauwkeurigheid20. Een bijkomend voordeel is dat de volledige dataset in zo weinig als een experiment kan worden verzameld als de thermische conversie product geen affiniteit voor de gratis Biomolecuul heeft. In tegenstelling, een typische experimentele DSC-serie voor een niet-thermolabile ligand produceren vergt ~ 7-10 totale experimenten.
Toekomstige toepassingen
Deze aanpak heeft directe toepassingen te karakteriseren van strakke, thermolabile remmers in drug discovery campagnes. Verschillende therapeutische stoffen zoals antibiotica en benzodiazepinen zitten bekend voor zitten thermolabile, die een snelle hydrolyse bij of in de buurt van fysiologische pH en temperatuur van ~ 60-70 ° C11. Deze methode van DSC is goed gepositioneerd om te identificeren en te karakteriseren van veel meer. Eveneens, heeft wijziging van het protocol van de montage ter verantwoording voor systemen onder kinetische in plaats van thermodynamische controle, zoals hierboven, de potentie om de deur open voor veel meer systemen van biologische relevantie.
Kritische stappen binnen het protocol
Een van de belangrijkste experimentele procedures te overwegen is dialyse of uitwisseling van de Biomolecuul en ligand in identieke werken bufferoplossingen (protocol stappen 1.3-1.6). Buffer wanverhouding tussen de ligand en Biomolecuul oplossingen kan leiden tot grote artefacten in de basislijn en monster scans die de relevante opvouwbare gegevens volledig te verduisteren. Bovendien is het essentieel dat de macht lezing stabiliseert voordat de DSC is drukkend zodat het kan worden gecontroleerd tijdens overdruksystemen (protocol stap 2.3). Als de macht lezing wordt gewijzigd door meer dan ~ 10 μW tijdens drukregeling, bubbels hebben waarschijnlijk gevormd in de haarvaten en kan leiden tot grote artefacten in de gegevens. In dit geval moeten de oplossingen worden grondiger ontgast.
Figuur 3. Biomoleculaire vouwen, binden aan een Thermolabile Ligand, en onomkeerbare aggregatie. De thermolabile ligand (L) converteert naar een product (X) met een constante k tariefc. X heeft geen affiniteit voor de Biomolecuul. De afhankelijke staat (B) van de Biomolecuul uitwisselingen met de gratis gevouwen staat (F) met tarief constanten kaf en kop. F uitwisseling met de ongevouwen staat tarief constanten ku en kf(U). U converteert onherroepelijk aan de geaggregeerde staat (A) met de constante k tariefagg. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Computersimulatie van evenwicht en kinetisch-gecontroleerde DSC experimenten in de afwezigheid en aanwezigheid van een Thermolabile Ligand. (een) evenwicht biomoleculaire vouwen. (b) evenwicht vouwing, thermolabile ligand bindende en langzame thermolabile ligand conversie. (c) evenwicht biomoleculaire vouwen. (d) evenwicht vouwing, thermolabile ligand bindende en snel thermolabile ligand conversie. (e) evenwicht biomoleculaire vouwen en langzame onomkeerbare aggregatie. (f) evenwicht vouwen, bindend, traag thermolabile ligand conversie, en langzaam onomkeerbare aggregatie. (g) Slow biomoleculaire vouwen. (h) Slow vouwing, evenwicht bindend en langzame thermolabile ligand conversie. (ik) evenwicht biomoleculaire vouwen. (j) evenwicht vouwing, langzame thermolabile ligand bindende en langzame thermolabile ligand conversie. In alle panelen zijn de eerste en laatste gesimuleerde scans donker rode en donker blauw, respectievelijk. Panelen die slechts licht en donker blauwe thermograms Toon aangeven dat alle gesimuleerde scans overlay, en alleen de laatste twee zichtbaar in het proefvlak zijn. DSC experimenten werden gesimuleerd met 20 scans (10 smelten en 10 gloeien) tempo 1 ° C min-1 scan, met een temperatuurbereik van 0-80 ° C. Bepaalde deelvensters weer smaller temperatuurbereiken zodat betere visualisatie van de simulatie-trends. De Biomolecuul en ligand-concentraties in de simulaties werden 200 µM en 10 mM, respectievelijk. Elk experiment werd gesimuleerd met een 600 s equilibratietijd bij 0 ° C voor scannen en een 60 s equilibratietijd tussen elk van de daaropvolgende scans. Arrhenius parameters voor evenwicht bindend en vouwen waren eenop = 5 x 10-1 M-1 s-1, eenuit = 1 x 1019 s-1, Eeenop =-20 kJ mol-1, Eeen af = 120 kJ mol-1, eenVouw = 1 x 10-14 s-1, eenontvouwen = 5 x 1018, EeenVouw =-80 kJ mol-1en Eeenontvouwen = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parameters voor kinetisch-gecontroleerde bindend en vouwen waren eenop = 5 x 10-3 M-1 s-1, eenuit = 1 x 1016 s-1, Eeenop -20 kJ mol-1, E = een af = 120 kJ mol-1, eenVouw = 1 x 10-16 s-1, eenontvouwen = 5 x 1016, EeenVouw =-80 kJ mol-1en Eeenontvouwen = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parameters voor langzame en snelle thermolabile ligand conversie waren eenlangzame = 7.509 x 1010 s-1, Eeentraag = 94.65 kJ mol-1, en eensnelle = 1 s-1, Eeen snelle = 10 kJ mol-1. Arrhenius parameters voor langzame onomkeerbare aggregatie waren eenagg. = 5 x 10,7 s-1 en Eeenagg. = 80 kJ mol-1. Overtollige warmte capaciteit werden berekend met ΔHUF (ontplooiing), ΔHBF (bindende) en ΔHAF (aggregeren) = 200,-140 en 50 kJ mol-1, respectievelijk. De theoretische beschrijving van DSC kinetisch-gecontroleerde experimenten met thermolabile liganden en script voor het uitvoeren van deze simulaties (en de vereiste parameters) zijn beschikbaar in aanvullende bestand 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
R. W. H. V werd gesteund door het McGill Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) Training Program in Bionanomachines. A. K. M. en P. E. J. werden ondersteund door NSERC subsidies 327028-09 (A. K. M) en 238562 (P. E. J.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
