Summary
نقدم بروتوكول لتوصيف الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات مع يغاندس ثيرمولابيلي باستخدام القياس فرق المسح السريع.
Abstract
فرق المسح القياس (DSC) تقنية قوية للتحديد الكمي لمعلمات دينامي حراري تحكم الجزيئية البيولوجية قابلة للطي والتفاعلات ملزمة. تعتبر هذه المعلومات الحاسمة في تصميم المركبات الدوائية الجديدة. ومع ذلك، العديد من يغاندس فارماسيوتيكالي ذات الصلة غير مستقرة كيميائيا عند درجات الحرارة العالية المستخدمة في التحليلات DSC. وهكذا، قياس التفاعلات ملزم هو التحدي لأن تركيزات يغاندس وتحويلها حرارياً المنتجات المتغيرة باستمرار داخل الخلية مسعر. وهنا، يقدم بروتوكول باستخدام يغاندس ثيرمولابيلي و DSC لسرعة الحصول على المعلومات الحرارية والحركية على الطي والربط، ويجند عمليات التحويل. لقد قدمنا طلبا لدينا طريقة للحمض النووي ابتمر MN4 الذي يربط بين الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. استخدام تحليل تركيب عالمية جديدة التي تستأثر بتحويل يجند ثيرمولابيلي، يتم الحصول على مجموعة كاملة من طي ومعلمات الربط من زوج من تجارب DSC. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يمكن الحصول على معدل ثابت للتحويل يجند ثيرمولابيلي مع واحد فقط dataset DSC التكميلية. وترد المبادئ التوجيهية لتحديد وتحليل البيانات من عدة سيناريوهات أكثر تعقيداً، بما في ذلك تجميع بيوموليكولي وطي بطيئة، بطيئة ملزمة والاستنفاد السريع ليجند ثيرمولابيلي لا رجعة فيه.
Introduction
فرق المسح القياس (DSC) وسيلة قوية كوانتيتاتينج الجزيئية البيولوجية ملزمة وقابلة للطي التفاعلات1،،من23. وتشمل مواطن قوة DSC قدرتها على توضيح ملزمة وقابلة للطي آليات، وأن تسفر عن2،معلمات دينامي حراري المقابلة3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤديها في حل الظروف الفسيولوجية قرب DSC ولا تشترط وسم بيوموليكولي أو يجند، مثلاً، مع فلوروفوريس، وتدور التسميات أو النظائر النووية4. يمسح الصك في درجة الحرارة، وقياس كمية الحرارة المطلوبة لتجريدها في بيوموليكولي في وجود وغياب ليجند. ثيرموجرامس الناتجة عن ذلك تستخدم لاستخراج معلمات دينامي حراري يجند ملزمة وقابلة للطي عمليات الإدارة. المعلومات المقدمة من DSC أو غيرها من التقنيات الحرارية ضروري لتوجيه تصميم المخدرات تستهدف الجزيئات الحيوية1،،من56،،من78. ومع ذلك، المسح المتكرر لدرجات حرارة عالية (~ 60-100 درجة مئوية) يمكن أن يكون مشكلة. على سبيل المثال، العديد من المركبات الهامة فارماسيوتيكالي الخضوع لإعادة ترتيب أو التحلل عند التعرض المستمر لدرجات الحرارة المرتفعة9،،من1011، أي، ثيرمولابيلي. يتطلب دراسة ملزمة التفاعلات التي DSC عادة متعددة إلى الأمام وعكس الأشعة بغية التحقق من إمكانية تكرار نتائج للشخصية لتحليل دينامي حراري12. تحويل الحرارية يجند الأولية إلى نموذج ثانوية مع خصائص ربط تغيير يؤدي إلى الفروق وضوحاً في الشكل والموقف من ثيرموجرامس المتعاقبة، نظراً لتركيز يجند الأولية تتناقص مع كل عملية مسح في حين منتجات التحويل الحراري تتراكم. مجموعات البيانات هذه غير قابلة للتحليل التقليدي.
مؤخرا قمنا بتطوير أسلوب عالمي مناسب ليجند ثيرمولابيلي DSC مجموعات البيانات التي تعطي مجموعة كاملة من معلمات دينامي حراري الإدارة الجزيئية البيولوجية قابلة للطي وملزمة التفاعلات من تجربة واحدة يجند زمنياً المشار إليها إلى الشخصية المطلوبة ل بيوموليكولي الحرة4. التحليل يقلل الوقت التجريبي والعينة التي تتطلبها ~ 10 إضعاف بالمقارنة مع نهج DSC قياسية. ونحن قد شكلت ليجند التحويل الحراري بافتراض هذا يحدث أثناء الجزء درجة حرارة عالية لمسح كل حيث الشخصية لا تعتمد على تركيز يجند. ولذلك، يتم تركيز يجند ثابت داخل جزء الشخصية التي تستخدم لاستخراج معلمات دينامي حراري. بالإضافة إلى ذلك أظهرنا كيف يمكن الحصول على معدل ثابت ليجند التحويل الحراري عن طريق إجراء تجربة تكميلية واحدة مع فترة الموازنة أطول في درجة حرارة عالية. لأنظمة التحويل الحراري يجند فيها تعتمد على درجة حرارة أقل (أيحدوث ملحوظ في جميع درجات الحرارة)، التحليل ويمكن تعديلها لتشمل تركيزات يجند متغير. هنا نظهر هذا الإجراء للحمض النووي ابتمر MN4 حضور الكوكايين يجند ثيرمولابيلي، الذي تحول سريعاً إلى بينزويليكجونيني في درجات حرارة عالية (> 60 درجة مئوية). يتم استخدام الكينين كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيليتي نظراً لأنها لا تخضع للتحويل في هذه درجات الحرارة التجريبية، وأيضا بربط MN4. يصف لنا اقتناء يجند ثيرمولابيلي DSC مجموعات البيانات وتحليلها مما أسفر عن معلمات دينامي حراري والحركية للطي والربط، ويجند عمليات التحويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد نموذج
- تنقية بيوموليكولي المطلوب13.
ملاحظة: هذا البروتوكول الأغراض التي تم شراؤها الكوكايين-ربط الحمض النووي ابتمر MN4 بعد تبادل ضد 2 من كلوريد الصوديوم م ثلاث مرات تليها ثلاث جولات من المياه باستخدام عامل تصفية الطرد مركزي مع غشاء وقف وزن الجزيئي كاتشين 3. - توليف وتنقية، أو شراء المطلوب يجند ثيرمولابيلي13.
ملاحظة: ربط MN4 الكوكايين يجند ثيرمولابيلي. كما يربط MN4 الكينين، الذي يستخدم كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيليتي في هذه درجات الحرارة التجريبية. - تجهيز المخازن المؤقتة للغسيل الكلوي بيوموليكولي المنقي وانحلال يغاندس (المخزن كلوريد الصوديوم فوسفات الصوديوم و 140 ملم 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.4، MN4 ويغاندس المستخدمة هنا).
- دياليزي بيوموليكولي ضد على الأقل 2 لتر من المخزن المؤقت باستخدام أنابيب الغسيل الكلوي مع 0.5-1.0 كاتشين وقف إنتاج المواد الانشطارية.
- تصفية المخزن المؤقت النهائي (المشار إليها كعامل المخزن المؤقت) عن طريق فلتر 0.2 ميكرون وقد تم اكويليبراتيد تماما مع المخزن المؤقت.
- تزن بها الجماهير المرجوة من يغاندس وحل لهم في المخزن المؤقت الذي تم تصفيته للعامل. إذا كانت تركيزات يجند المنشودة تتطلب الجماهير التي أصغر من أن تزن بدقة، تجعل حل يجند تتركز أسهم (10 x على سبيل المثال).
ملاحظة: من الأهمية بمكان أن جميع DSC تجارب استخدام المخزن المؤقت العامل نفسه للعينة ويجند، أيابدأ إجراء تجربة حيث يحل يجند في مجموعة مختلفة من المخزن المؤقت للعامل من بيوموليكولي كما سيؤدي هذا المخزن المؤقت عدم تطابق القطع الأثرية في البيانات. - تصفية الحل بيوموليكولي الأسهم من خلال فلتر 0.2 ميكرون قد تم اكويليبراتيد تماما مع المخزن المؤقت للعمل.
- تحديد تركيز بيوموليكولي بامتصاص القياسات (260 nm للأحماض النووية مثل MN4 و 280 نانومتر للبروتينات).
- تخزين بيوموليكولي المعدة ويجند في ثلاجة 4 درجة مئوية (مناسبة ل MN4 ويغاندس المستخدمة هنا)، أو في-20 أو-80 درجة مئوية إذا بيوموليكولي ويغاندس تحمل التخزين التجميد والطويل مطلوب. ديغا الحلول المخزن المؤقت، وبيوموليكولي، ويجند في أعلى جدول ديجاسير (انظر الجدول للمواد) قبل التحميل إلى DSC.
ملاحظة: ولﻵﻻت يساعد على منع تكوين فقاعة في DSC في ارتفاع درجات الحرارة. تسبب فقاعات التحف الإشارات التي تحجب DSC ذروة الأشكال وخطوط الأساس.
2-إعداد DSC
- فك المقبض الضغط من DSC (انظر الجدول للمواد).
- تشغيل أنابيب السيليكون من المخزن المؤقت العامل وإرفاقه بشفة الجبهة (الافتتاحية معدنية) شعري مرجع.
- إنشاء جسر بين الشعيرات الدموية المرجعية وعينه عن طريق توصيل المرجع الخلفي الشفة شفة عينة الجبهة.
- إرفاق قطعة من السليكون أنابيب شفة عينة الخلفي يتعارض قارورة نفايات مع خط فراغ المرفقة.
- قم بتشغيل خط فراغ لطرد DSC مع 200 مل من المخزن المؤقت للعمل.
- تحميل الشعرية مرجع من DSC مع المخزن المؤقت للعمل. إرفاق تقريبا الأقسام 3-5 سم من أنابيب السيليكون للشفاه الشعرية مرجع.
- إدراج تلميح ماصة 1 مل في أنابيب السيليكون لشفة الخلفي. رسم 0.8 مل من المخزن المؤقت للعمل مع ماصة، وإدراج تلميح ماصة مع المخزن المؤقت في أنابيب السيليكون لاستقبال إشارة شفة.
- اضغط برفق المكبس ماصة وصولاً إلى تمرير المخزن المؤقت العامل عن طريق أنابيب السيليكون الجبهة إلى الشعرية مرجع ويصل إلى شفة الخلفي لتعلق نصيحة ماصة. اضغط لأسفل المكبس ماصة حتى يصل إلى مستوى العمل المخزن المؤقت فقط فوق أنابيب السيليكون الجبهة، ثم الإفراج عن المكبس ماصة حتى يصل إلى مستوى العمل المخزن المؤقت فقط فوق أنابيب السيليكون الخلفي.
- كرر تمرير المخزن المؤقت العمل ذهابا وإيابا لإزالة وحدة التخزين في الشعرية مرجع الفقاعات.
ملاحظة: عادة ما يمر 10 الحل ذهابا وإيابا كافية لمسح أي فقاعات.
- كرر تمرير المخزن المؤقت العمل ذهابا وإيابا لإزالة وحدة التخزين في الشعرية مرجع الفقاعات.
- كاب نصيحة ماصة الخلفي مع الإبهام وسحب ما يصل بلطف على الحافة الخلفية ماصة وماصة الجبهة لإزالتها من الشفاه مرجع مع أنابيب السيليكون المرفقة.
- تحميل الشعرية عينة مع المخزن المؤقت للعمل كما هو الحال في الخطوات 2.6 2.9. ضع قبعة بلاستيكية سوداء على مرجع خلفي وعينه الشفاه، تاركاً الشفاه الجبهة التي اكتشفت.
- إرفاق مؤشر الضغط.
- فتح برنامج DSC (انظر الجدول للمواد)، وممارسة الضغط على الصك بواسطة النقر فوق الأحمر السهم في الجزء العلوي من الواجهة إلى متى استقر القراءة السلطة؛ سلطة DSC يشار في مربع في الجزء العلوي اليمين من الواجهة إلى جانب صك درجة الحرارة والضغط القراءة.
ملاحظة: مراقب سلطة القراءة ك DSC تحفزها. التغييرات في السلطة لأكثر من ~ 10 µW تشير إلى تشكيل فقاعة في الشعيرات الدموية، التي يمكن أن تسبب النتائج الملموسة في البيانات. الحلول التي يجب إزالتها ويطرد المزيد قبل المتابعة. - حجته DSC مع المخزن المؤقت للعمل بإجراء مسح للأمام وعكس. في علامة التبويب "المنهج التجريبي" على الجانب الأيسر من الشاشة، تأكد من تحديد الخيار "مسح" لتشغيل DSC في درجة حرارة وضع المسح.
ملاحظة: معلمات التجريبية هي درجة الحرارة مسح نطاق معدل المسح الضوئي، ودرجات الحرارة المنخفضة والعالية الموازنة والوقت عدد عمليات التفحص.- في داخلي "معلمات درجة الحرارة" ضمن علامة التبويب "المنهج التجريبي"، انقر فوق الزر "التدفئة". قم بإدخال 1 و 100 درجة مئوية لأعلى وأدنى درجات تجريبي، 1 درجة مئوية/دقيقة لمعدل المسح الضوئي، و 60 ثانية لفترة الموازنة.
- انقر فوق الزر "إضافة سلسلة" ضمن حقل الإدخال لفترة الموازنة. إدخال 2 في الحقل "خطوات لإضافة" في نافذة منبثقة (لتدفئة واحدة وفحص التبريد واحدة) والتحقق من المربع "البديل التدفئة/التبريد". انقر فوق "موافق"؛ بالأشعة وأضاف تظهر في الجزء السفلي من الواجهة. تحقق من أن المعلمات لكل عملية مسح كالمطلوب.
- تبدأ التجربة بواسطة النقر فوق الزر الأخضر "مسرحية" في الجزء العلوي من الواجهة. انتقل إلى المجلد المطلوب وإدخال اسم ملف لحفظ التجربة في نافذة منبثقة. عرض تقدم التجربة عن طريق النقر فوق علامة التبويب "البيانات" إلى يمين علامة التبويب "أسلوب التجربة".
3-جمع مجموعات البيانات DSC يجند ثيرمولابيلي
ملاحظة: الإجراء الحد الأدنى الذي يتكون من خمس تجارب: المخزن المؤقت التجارب المرجعية مع أو بدون [ليغند] (المستخدمة للطرح الأساس، انظر المناقشة)، عينة تجارب مع بيوموليكولي الحرة، بيوموليكولي يجند زمنياً، بيوموليكولي يجند زمنياً مع فترة الموازنة أطول في درجة حرارة عالية.
- تشغيل التجارب المرجعية للطرح الأساس لنموذج البيانات. إعادة تحميل DSC مع المخزن المؤقت للعمل في كلا من الشعيرات الدموية وجمع عدة إلى الأمام وعكس الأشعة عبر نطاق درجة حرارة مناسبة في 1 درجة مئوية دقيقة-1 مع الشيوخ (ارتفاع درجة الحرارة) وقت الموازنة من 120 ثانية.
- حذف مسح المخزن المؤقت السابق على الموازنة من الجزء السفلي من الواجهة بتسليط الضوء على كل منها على حدة والنقر فوق علامة X الحمراء إلى منتصف اليمين للواجهة. إضافة مسح جديد بالنقر فوق الزر "إضافة سلسلة" وإدخال 20 في حقل "خطوات لإضافة" والتحقق من المربع "البديل التدفئة/التبريد". انقر فوق موافق، وتشغيل هذه التجربة عن طريق النقر على زر التشغيل الأخضر كما ذكر أعلاه.
- كرر الخطوات من 3، 1-تجارب 3.1.1 مع عامل مخزن يحتوي على تركيز المطلوب ليجند في الشعيرات الدموية على حد سواء للحصول على المرجع ليجند (جمع تجربتين منفصلتين باستخدام 120 s و s 600 درجة حرارة مرتفعة الموازنة مرات على التوالي، لاستخدامها في الحصول على معدل ثابت ليجند ثيرمولابيلي التحويل).
ملاحظة: معدل المسح المستخدمة هنا يضمن بيوموليكولي في التجارب اللاحقة في التوازن الحراري في فحص الأمامية والعكسية (انظر المناقشة). مسح معدلات < 0.1-0.2 درجة مئوية دقيقة-1 يؤدي إلى ثيرموجرامس صاخبة ولا تطبق في تجارب DSC. ينبغي أن تمتد إلى درجات حرارة من البئر تحت درجة حرارة ذوبان من بيوموليكولي الحرة إلى ما فوق درجة حرارة ذوبان بيوموليكولي المشبعة يجند (~ 20-80 درجة مئوية ل MN4). تحقق من إمكانية تكرار نتائج للمسح الضوئي (بالنسبة مثلاً إلى الأمام 10 ومسح عكس 10 ل 20 مجموع غير كافية). - في حالة استخدام يغاندس متعددة (مثل الكوكايين ومادة الكينين)، تدفق DSC مع 200 مل من المخزن المؤقت العامل (كرر من الخطوة 2، 5) بين يعمل من أجل إزالة يجند من الشعيرات الدموية، ومنع التلوث عبر.
ملاحظة: أنها مفيدة لإجراء تجربة نسخ متماثل في بيوموليكولي الحرة بعد تشغيل يجند زمنياً من أجل التحقق من إذا كان يجند السابقة تمتز بقوة على الجدران الشعرية ولا تتم إزالة على نحو كاف مع مسح المخزن المؤقت. إذا كان ثيرموجرامس بيوموليكولي الحرة تظهر إلى أن تحول إلى حجم أكبر وأعلى درجة حرارة تمسخ بعد التجربة يجند زمنياً، من المرجح أن يجند السابقة لا تزال موجودة في مسعر بعد التنظيف. إزالة يجند الممتزة بحضانة الشعيرات الدموية مع 20% كونتراد-70 ح 1 عند 60 درجة مئوية مع أغطية بلاستيكية وضغط مقبض قبالة. في برنامج DSC، تغيير وضع التجريبية إلى "متحاور" ضمن علامة التبويب "الأسلوب التجريبي" s اختر 3,600 لمدة 60 درجة مئوية لدرجة الحرارة متحاور، مع صفر دخلت فترة الموازنة. انقر فوق "إضافة إلى المنهج التجريبي". التجربة متحاور يظهر في الجزء السفلي من الشاشة. بعد الانتهاء، تدفق الصك مع 2 لتر منزوع الماء وكرر من الخطوة 2، 5.
- تشغيل عينة تجارب باستخدام نفس DSC تحميل الإجراء ومعلمات التجريبية كما مسح الإشارة. لمجموعة البيانات بيوموليكولي الحرة، ضمان أن الشعرية مرجع يحتوي على المخزن المؤقت العامل بينما الشعرية نموذج يحتوي على بيوموليكولي الحرة في تركيز المطلوب في المخزن المؤقت للعمل.
- لتجارب يجند زمنياً، ضمان أن يجند في المخزن المؤقت للعامل في الشعرية مرجع، وبيوموليكولي بالإضافة إلى يجند في المخزن المؤقت للعامل في شعري عينة. مسح النظام بين إضافات يغاندس مختلفة كما هو الحال في الخطوة 2، 5.
- نفذ إحدى تجربة إضافية مع بيوموليكولي ملزمة ليجند ثيرمولابيلي حيث تمت زيادة فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة إلى 600 s وكافة المعلمات الأخرى التجريبية هي نفس الخطوة 3.2.1.
ملاحظة: يتم اختيار فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة في التجربة الثانية يجند زمنياً ببساطة التأكد من يجند المستنفد أكثر سرعة من التجربة المرة الموازنة قصيرة. إذا كان على قمم يجند زمنياً من الأول تجربة تسوس ببطء كدالة لفحص عدد (مثلاً، الاختلافات في ماكسيما ذروة المتعاقبة هي ≤ 0.5 درجة مئوية)، تقدير الزيادات 10 إلى 20 ضعفا في فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة من أجل تستنفد على نحو كاف يجند خلال التجربة الثانية. حساب دقيق لمعدل ثابت للتحويل [ليغند] يتطلب أن التجربة الثانية استنزاف أسرع ليجند بالنسبة إلى الأولى. سوف تكون تركيزات يجند المستخرجة من التحليل الشامل لأن التجربتين مماثلة وذلك غير قابل للاستخدام إذا لا هو تسارع نضوب يجند بما فيه الكفاية في التجربة الثانية.
4-معالجة البيانات
- فتح الملفات في برنامج تحليل البيانات DSC تجربة DSC (انظر الجدول للمواد)، وتصدير البيانات الخام والطاقة كجداول البيانات.
- استيراد جداول البيانات التي تحتوي على البيانات الخام والطاقة إلى برمجيات للبيانات المناسب.
- الأساس طرح نموذج للبيانات عن طريق طرح في المخزن المؤقت لبيانات السلطة من الحر وتجارب بيوموليكولي يجند زمنياً.
ملاحظة: ليجند ثيرمولابيلي التجربة، يتناقص تركيز يجند الأولية مع كل عملية مسح. ولذلك، ومثالي لطرح مسح المخزن المؤقت 1 من عينة المسح الضوئي 1، وهلم جرا. وقد وجدنا أن بمسح المخزن المؤقت مع الكوكايين لا تغير ملحوظ كما يجند تحويل العائدات وذلك مسح المخزن مؤقت ليجند ثيرمولابيلي واحدة يمكن استخدامها لطرح كافة البيانات المرتبطة يجند ثيرمولابيلي. - تحويل بيانات السلطة عينة طرح خط الأساس لقدرة الحرارة.
ملاحظة: يتطلب التحويل حجم بيوموليكولي محددة الجزئية، التي يمكن أن تكون ما يقدر14،،من1516. المعادلة لتحويل الطاقة إلى قدرة الحرارة قد سبق وصفها17.
5-بيانات التحليل
- على الصعيد العالمي تناسب الموازنة قصيرة الوقت ثيرمولابيلي السعة الحرارية يجند زمنياً dataset مع مجموعة واحدة من خط الأساس وتركيز يجند وقابلة للطي، ويجند ربط المعلمات كما هو موضح سابقا4.
- كرر صالح العالمي ل dataset وقت طويل الموازنة من أجل حساب معدل ثابت ليجند ثيرمولابيلي التحويل كما هو موضح سابقا4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد بيانات تمثيلية ليجند ثيرمولابيلي DSC في الشكل 1. الموقف وارتفاع ذروة يجند زمنياً ثيرمولابيلي تباعا التحولات إلى أسفل نحو من بيوموليكولي غير منضم كما زف يجند ثيرمولابيلي مع كل عملية مسح (الشكل 1a). يتم استخدام التشكيل الجانبي تمسخ الحرة كمرجع لنقطة النهاية ليجند ثيرمولابيلي التحويل (الشكل 1b). وترد بيانات منضمة إلى الكينين MN4 كعنصر تحكم سلبية ليجند ثيرمولابيلي التحويل (الشكل 1b). وقد مسح نهائي يجند ثيرمولابيلي نقاط أعلى قليلاً من المنتصف الانتقال ومرتفعات الذروة بالنسبة إلى MN4 غير منضم، تشير إلى المنتج تحويل يجند ثيرمولابيلي (بينزويليكجونيني) لها صلة ضعيفة ل MN4. وترد في الجدول 1معلمات دينامي حراري الناتجة عن تحليل عالمي لمجموعات البيانات في الشكل 1 . معلمات قابلة للطي ل MN4 حضور الكوكايين أو الكينين متطابقة في الخطأ، كما هو متوقع نظراً لتمييع الجزيئات الصغيرة من غير المتوقع أن التشويش الديناميكا الحرارية للطي من بيوموليكولي الحرة. معلمات الربط في اتفاق جيد مع أولئك من معايرة متحاور القياس (ITC)18 وتكشف عن أن تفضيلها ل MN4 الكينين على الكوكايين تحركها محتوى حراري ملزمة أكثر مواتاة. في الشكل 2، زيادة فترة الموازنة درجة حرارة عالية الغلة تخفيضات أكثر وضوحاً من تركيز يجند ثيرمولابيلي مع كل عملية مسح بالنسبة إلى dataset فترة قصيرة الموازنة. استخدام معلمات الأمثل العالمية تركيز مناسب من مجموعات البيانات اثنين، يحسب معدل ثابت ليجند التحويل عند درجة حرارة مرتفعة الموازنة من منحدر الخط في اقحم الرقم 2 .
رقم 1. ثيرمولابيلي يجند DSC. () ثيرموجرامس MN4 (83 ميكرومتر) ملزمون بالكوكايين (تركيز الأولية 778 ميكرومتر). المسح الأولى والأخيرة من MN4 حضور يجند تظهر كدوائر حمراء وزرقاء داكنة بينما يناسب المقابلة تظهر كخطوط ملونة. (ب) ثيرموجرامس MN4 الحرة (83 ميكرومتر، أسود دوائر) ومسح المتعاقبة ملزمة الكينين (880 ميكرومتر، دوائر ملونة). يناسب لمجموعات البيانات الحرة وربط الكينين تظهر كخطوط سوداء وملونة، على التوالي. مستنسخة من مرجع4 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. قياس ثابت معدل للتحويل يجند ثيرمولابيلي. () مجموعات من ثيرموجرامس ل MN4 ملزمة للكوكايين مع قصيرة (120 ثانية، أحمر داكن) والموازنة طويلة (600 s، الأزرق الداكن) مرات في 80 درجة مئوية، على التوالي. (ب) تركيزات الكوكايين المستخرج من تحليل عالمي لمجموعات البيانات في () كدالة لعدد المسح الضوئي. وترد النقاط التجريبية ويناسب الأسية كدوائر ملونة وخطوط على التوالي. ويبين اقحم نوبة خطي إلى 19 مكافئ. التكميلي هو موضح سابقا من هاركنس et al. باستخدام تركيزات الكوكايين تناسب العالمية الأمثل ل مجموعات البيانات اثنين4. ويحسب معدل ثابت ليجند التحويل الحراري عند 80 درجة مئوية كمنحدر الخط. يتم إعطاء الخطأ لمعدل ثابت ليجند ثيرمولابيلي التحويل الانحرافات المعيارية ± اثنين. مستنسخة من مرجع4 بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| معلمات تناسب | وأضاف الكوكايين | وأضاف الكينين |
| ∆Hالجبهة المتحدة | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆Sالجبهة المتحدة | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| ∆زالجبهة المتحدة | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| H∆B1F | --75.2±1.6 | --101.0±4.0 |
| ∆SB1F | --154.2±5.0 | --213.7±12.0 |
| ∆جفB1F | --1.5±0.1 | --1.2±0.1 |
| ∆زB1F | --28.5±0.2 | --36.2±0.7 |
| H∆B2F | --33.7±1.8 | - |
| ∆SB2F | --49.9±5.2 | - |
| ∆جفB2F | --2.2±0.1 | - |
| ∆زB2F | --18.6±0.3 | - |
الجدول 1. معلمات دينامي حراري المستخرج من تحليل عالمي لمجموعات البيانات DSC MN4 استخدام الكوكايين ومادة الكينين يغاندس. حسبت المعلمات في 30 درجة مئوية. B1F يشير إلى الدول مطوية زمنياً الكوكايين أو الكينين و B2F للدولة مطوية بينزويليكجونيني زمنياً. Δح و Δز يتم التعبير عنها في كيلوجول/مول، وهو أعرب عن ΔS في J/mol/K و Δ يعبر عنجف في kJ/mol/ك. أخطاء حسبت وفقا لأسلوب الفرق-variance المشارك19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
تفاصيل التحليل المناسب العالمية المستخدمة في الشكل 1 و الشكل 2 تم وصف سابقا4. هنا، فإننا مخطط الجوانب العملية لتنفيذ وتحليل تجارب DSC ملزمة مع يغاندس ثيرمولابيلي. ملاحظة الحصول على خط أساس DSC ليجند ثيرمولابيلي وحدها هو طرح من يجند + dataset بيوموليكولي، إلغاء فعالية من الحرارة الإفراج أو استيعابها من قبل التحويل الحراري العملية نفسها. تحليل تركيب العالمية يجند ثيرمولابيلي القياسية(الشكل 1 و الشكل 2) يفترض أن يكون النظام في توازن دينامي حراري في جميع أنحاء فحص درجة الحرارة، وأن تركيز يجند ثيرمولابيلي ثابت في جميع أنحاء كل الشخصية، تتناقص حصرا خلال فترة الموازنة ارتفاع درجة الحرارة. وقد أظهرنا سابقا أن هذا الافتراض ينطبق على MN4 الكوكايين زمنياً، ومن المتوقع أن يعقد لأي نظام ليجند ثيرمولابيلي/بيوموليكولي مع حركية مماثلة لهذه.
ومع ذلك، هناك بعض حالات على هذا النظام لا يمكن أن يفترض أن يكون في توازن دينامي حراري أو لا يمكن أن يعتبر تركيز يجند ثابتة خلال عملية فحص. وتشمل هذه ط) عند يجند حرارياً يحول سريعاً بالنسبة لمعدل فحص درجة الحرارة والثاني) عندما بيوموليكولي يخضع التجميع لا رجعة فيها في درجة حرارة عالية، ثالثا) عند معدلات قابلة للطي/تتكشف بطيئة مقارنة بمعدل المسح الضوئي، والرابع). عندما تكون معدلات رابطة/الانفصال يجند بطيئة مقارنة بمعدل المسح الضوئي. وفي هذه الحالات، النظام تحت السيطرة الحركية بدلاً من دينامي حراري ودقة لا يمكن تطبيق التحليل النظر في مرجع 4. قد يمكن محاكاة البيانات كمياً بعد الرقم 3، كما هو موضح في التكميلية الملف 1. من حيث المبدأ، يمكن استخدام هذه العمليات الحسابية المستندة إلى حركية لاحتواء البيانات DSC عدم التوازن، يحتمل أن تسفر عن بيانات الحركية والدينامية الحرارية على حد سواء، إلا أن هذا التحليل خارج نطاق هذه الورقة. بدلاً من ذلك، نقدم بعض بيانات DSC محاكاة تمثيلية لمساعدة القارئ في تحديد حالات عدم التوازن.
يظهر مثال مثالي للمراقبة الحرارية في الشكل 4 أ، ب DSC ثيرموجرامس من بيوموليكولي الحرة هي سوبيريمبوسابل (الشكل 4a) ولا تظهر بالأشعة مع يجند ثيرمولابيلي التباطؤ، أن يحتفل بدرجة حرارة ذوبان في الأعلى--المسح الضوئي مباريات درجة الحرارة قابلة للطي (المسح الضوئي لأسفل السابقة الشكل 4). عند تحويل يجند ثيرمولابيلي السريع مقارنة بمعدل المسح الضوئي، تظهر تشوهات كبيرة في الشخصية ولا تراعي المعادلات الحرارية للشكل ذروته، كما هو موضح في الشكل 4 ج، د. وهذا يمكن أن يخفف إلى حد ما عن طريق زيادة معدل المسح الضوئي. عندما المجاميع بيوموليكولي بطريقة تعتمد على درجة الحرارة، آثار DSC لإظهار بيوموليكولي الحرة المتعاقبة النقصان في الحجم (4e الشكل)، بينما إضافة يجند ثيرمولابيلي تنتج نمطاً من تناقص سرعة الحرارية مشابهة لحالة مثالية، لكن المقاس بتناقص تركيز بيوموليكولي (الرقم 4f). عند طي تتكشف حركية بطيئة مقارنة بمعدل المسح الضوئي، التباطؤ الواضح في آثار DSC بيوموليكولي الحرة أن درجة الحرارة تمسخ الظاهر في الأعلى--المسح الضوئي أعلى من درجة حرارة ريناتوريشن الظاهر على (المسح الضوئي لأسفل ز الرقم 4). إضافة يجند ثيرمولابيلي تؤدي إلى نمط مألوف تتناقص سرعة الحرارية، خاصة بالنسبة لتصل بالأشعة (ح رقم 4). أخيرا، تنتج نظم مع الطي السريع وربط بطيئة خالية من التباطؤ DSC ثيرموجرامس بيوموليكولي الحرة (الرقم 4i)، بيد أن تظهر البيانات مع يجند ثيرمولابيلي التباطؤ فيها درجة حرارة ذوبان الظاهر حتى--المسح الضوئي أعلى من درجة حرارة قابلة للطي الظاهر الأسفل السابقة-المسح (الرقم 4j). ومع ذلك، نمط نموذجي لتقليل سرعة الحرارية تتجلى في مسح أعلى وأسفل-مسح. يمكن أن يكون السلوك عدم التوازن في حالة قابلة للطي أو ملزمة حركية بطيئة خفف إلى حد ما بانخفاض معدل المسح الضوئي، على الرغم من أن هذا ينطوي على خطر تحويل يجند إغفالها الحرارية التي تحدث في جميع أنحاء المسح الضوئي. في الممارسة العملية، يمكن ضبط فحص معدل والعلوي الموازنة درجة الحرارة يدوياً للحصول على بيانات تشبه الشكل 4 أ، ب.
القيود المفروضة على هذه التقنية
لدينا تحليل حراري ل DSC ملزم التجارب مع يغاندس ثيرمولابيلي يتطلب أن قابلة للطي وعمليات الربط سريعة نسبيا وأن يجند ثيرمولابيلي التحويل بطيئة قبل جزء درجة حرارة عالية في كل عملية مسح. عندما يكون بقاء الدولة مطوية و/أو منضم أكبر من حوالي 30 ثانية (kإيقاف، كيو < 0.03 s-1)، التباطؤ يصبح ملموسا في عمليات التفحص التي أجريت في 1 درجة مئوية دقيقة-1. بالإضافة إلى ذلك، عندما يكون ثابت معدل التحويل يجند أعلاه تقريبا كج = 10-4 s-1 قبل الانتقال تمسخ، يمكن أن يكون هناك استنزاف كبيرة ليجند أثناء عملية الفحص. تطبيق تحليلنا أيضا غير مناسبة عندما يحدث التجميع لا رجعة فيه. وفي هذه الحالات، يمكن تطبيق نماذج أكثر تقدما للبيانات. لا تقارب تتوفر معلومات إذا كان يجند التحويل السريع حتى وصولها إلى الانتهاء قبل الانتقال تمسخ الأولى.
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
لدينا طريقة لأول مرة يسمح DSC التي ستستخدم لقياس الديناميكا الحرارية ملزم من عالية تقارب، يغاندس ثيرمولابيلي. بإجراء تحليل متزامنة عالمية لجميع عمليات التفحص، يتم استخراج معلمات دينامي حراري بدرجة عالية من الدقة20. فائدة إضافية أن مجموعة البيانات الكاملة يمكن جمعها في تجربة واحدة قدر ضئيل إذا كان المنتج التحويل الحراري للا تقارب بيوموليكولي الحرة. على العكس من ذلك، يتطلب إنتاج سلسلة DSC تجريبية نموذجية ليجند غير ثيرمولابيلي ~ تجارب المجموع 7-10.
التطبيقات المستقبلية
وهذا النهج قد التطبيقات المباشرة لوصف مثبطات ضيق، ثيرمولابيلي في حملات اكتشاف المخدرات. المعروف أن ثيرمولابيلي، تمر بالتحلل السريع في أو بالقرب من الأس الهيدروجيني الفسيولوجي، ودرجات الحرارة من عدة مركبات علاجية مثل المضادات الحيوية والبنزوديازيبينات ~11من 60-70 درجة مئوية. هذا الأسلوب DSC وضع جيد لتحديد وتوصيف أكبر بكثير. كذلك، تعديل البروتوكول المناسب لحساب أنظمة السيطرة الحركية بدلاً من دينامي حراري، كما نوقش أعلاه، لديه القدرة على فتح الباب أمام العديد من أكثر النظم البيولوجية ذات الصلة.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
أحد أهم الإجراءات التجريبية للنظر هو الغسيل الكلوي أو تبادل بيوموليكولي ويجند إلى حلول المخزن المؤقت العامل متطابقة (خطوات 1.3-1.6 من البروتوكول). المخزن المؤقت لعدم تطابق بين الحلول التي يجند وبيوموليكولي يمكن أن تؤدي إلى القطع الأثرية الكبيرة في مسح خط الأساس وعينه التي تحجب البيانات ذات الصلة للطي تماما. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري أن تستقر القراءة السلطة قبل أن يتم الضغط DSC حيث أنه يمكن رصدها من خلال الضغط (الخطوة 2، 3 من البروتوكول). إذا تغيرت القراءة السلطة قبل أكثر من ~ 10 µW أثناء الضغط، فقاعات شكلت المحتمل في الشعيرات الدموية ويمكن أن يسبب القطع الأثرية الكبيرة في البيانات. وفي هذه الحالة، أن الحلول تحتاج إلى أن يطرد أكثر دقة.
الشكل 3. الجزيئية البيولوجية قابلة للطي، وملزمة ليجند ثيرمولابيلي، والتجميع لا رجعة فيه. تحويل يجند ثيرمولابيلي (L) للمنتج (س) مع معدل ثابت كج. وقد س لا تقارب بيوموليكولي. الدولة المنضمة (ب) تبادل بيوموليكولي مع الحر مطوية الدولة (و) مع معدل ثوابت kإيقاف وك. و التبادلات مع الدولة تكشفت (U) مع معدل ثوابت ku و kو. يو يحول لا رجعة فيه للدولة (أ) مجمعة مع ك ثابت معدلagg. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. تجارب المحاكاة الحاسوبية للتوازن وتسيطر عليها كينيتيكالي DSC في غياب وحضور يجند ثيرمولابيلي. () التوازن الجزيئية البيولوجية قابلة للطي. (ب) التوازن طي، ملزم يجند ثيرمولابيلي، وتحويل يجند ثيرمولابيلي بطيئة. (ج) التوازن الجزيئية البيولوجية قابلة للطي. (د) التوازن طي، ملزم يجند ثيرمولابيلي، ويجند ثيرمولابيلي سرعة التحويل. (ﻫ) التوازن الجزيئية البيولوجية قابلة للطي والتجميع البطيء الذي لا رجعة فيه. قابلة للطي (f) التوازن، ملزمة، بطء يجند ثيرمولابيلي التحويل والتجميع البطيء الذي لا رجعة فيه. (ز) بطيئة الجزيئية البيولوجية قابلة للطي. قابلة للطي (ح) بطيئة والربط التوازن، وتحويل يجند ثيرمولابيلي بطيئة. (أنا) التوازن الجزيئية البيولوجية قابلة للطي. قابلة للطي (ي) التوازن وملزم يجند ثيرمولابيلي بطيئة، وتحويل يجند ثيرمولابيلي بطيئة. في كل اللوحات، بمسح المحاكاة الأولى والأخيرة زرقاء داكنة حمراء والظلام، على التوالي. اللوحات التي تظهر ثيرموجرامس الزرقاء الفاتحة والداكنة فقط تشير إلى أن جميع عمليات التفحص محاكاة تراكب، وآخر اثنين فقط مرئية في المؤامرة. كانت محاكاة التجارب DSC مع مسح 20 (10 ذوبان و 10 الصلب) معدل 1 درجة مئوية دقيقة-1 المسح الضوئي، مع درجة حرارة تتراوح من 0-80 درجة مئوية. بعض لوحات عرض أضيق النطاقات درجة الحرارة للسماح لتصور أفضل للاتجاهات المحاكاة. وكانت تركيزات بيوموليكولي ويجند في عمليات المحاكاة 200 ميكرومتر و 10 ملم، على التوالي. تمت محاكاة كل تجربة مع فترة الموازنة s 600 في 0 درجة مئوية قبل المسح و 60 s وقت الموازنة بين كل من عمليات التفحص اللاحقة. كانت معلمات أرينيوس للتوازن ملزمة وقابلة للطيشأن = 5 × 10-1 م-1 ق-1،إيقاف = 1 × 1019 ق-1، هعلى =-20 كيلو جول مول-1، ه إيقاف = 120 كيلو جول مول-1،أمثال = 1 × 10-14 ق-1،تتكشف = 5 × 1018، هأمثال =-80 كيلو جول مول-1، وهتتكشف = 120 كج مول-1 . كانت معلمات أرينيوس لتسيطر عليها كينيتيكالي ملزمة وقابلة للطيشأن = 5 × 10-3 م-1 ق-1،إيقاف = 1 × 1016 ق-1، هعلى =-20 كيلو جول مول-1، ه أ إيقاف = 120 كيلو جول مول-1،أمثال = 1 × 10-16 ق-1،تتكشف = 5 × 1016، هأمثال =-80 كيلو جول مول-1، وهتتكشف = 120 كج مول-1 . معلمات أرينيوس ليجند ثيرمولابيلي بطيئة وسرعة التحويل كانتبطيئة = 7.509 × 1010 ق-1، هبطيئة = 94.65 كيلو جول مول-1، وسريعة = 1 s-1، ه سريع = 10 كيلو جول مول-1. كانت معلمات أرينيوس للتجميع لا رجعة فيه بطيء علىagg. = 5 × 107 s-1 وهاءعلىagg. = 80 كيلو جول مول-1. وحسبت الطاقات الحرارة الزائدة مع ΔHالجبهة المتحدة (الجارية) و ΔHفرنك بلجيكي (ملزمة) ΔHAF (تجميع) = 200 و-140 و 50 كيلو جول مول-1، على التوالي. وصف DSC تسيطر عليها كينيتيكالي النظرية والتجارب مع يغاندس ثيرمولابيلي والبرنامج النصي لأداء هذه المحاكاة (والمعلمات الضرورية) متوفرة في التكميلية الملف 1- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ر. دبليو حاء الخامس أيده ماكغيل العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة) البرنامج التدريبي في بيونانوماتشينيس. أ. م. ك. وب. أ. ج. كانت تدعمها في منح الأموال 327028-09 (أ. ك. م) و 238562 (ب. أ. ج.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
- Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
- Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
- Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
- Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
- Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
- Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
- Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
- Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
- Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
- Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
- Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
- Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
- Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
- Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
- Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
- Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).
