Summary
يوضح هذا المقالة كيفية الثقافة شتلات نبات التمويل في منصة طبقتين موائع جزيئية أن يحصر الجذر الرئيسي والشعر الجذر لطائرة بصري واحد. يمكن استخدام هذا البرنامج للتصوير الضوئي في الوقت الحقيقي مورفولوجيا الجذر غرامة كذلك أما بالنسبة للتصوير عالي الدقة بوسائل أخرى.
Abstract
زيادة الشعر الجذر جذر المساحة السطحية لامتصاص المياه أفضل وامتصاص العناصر الغذائية بالنبات. لأنها صغيرة الحجم وغالباً ما تحجب ببيئتهم الطبيعية، مورفولوجيا الجذر الشعر والدالة صعبة لدراسة وغالباً مستبعدة من بحوث النبات. في السنوات الأخيرة، عرضت منصات موائع جزيئية طريقة لتصور نظم الجذور بدقة عالية دون إزعاج الجذور أثناء نقلها إلى نظام تصوير. قدم منصة موائع جزيئية هنا يبني على البحوث النباتية على رقاقة السابقة بإدراج جهاز طبقتين حصر جذر نبات التمويل الرئيسي لنفس الطائرة الضوئية كجذر الشعر. يتيح هذا التصميم للتحديد الكمي للشعر الجذر على هاتف خلوي وعضيه المستوى وأيضا يمنع محور ع الانجراف أثناء إضافة علاجات تجريبية. ونحن تصف كيفية تخزين الأجهزة في بيئة الواردة ورطب، دون الحاجة لمضخات فلويديك، مع الحفاظ على بيئة جنوتوبيوتيك للشتلات. بعد تجربة التصوير الضوئي، يمكن تفكيكها الجهاز والمستخدمة كركيزة للقوة الذرية أو المسح الضوئي المجهر الإلكتروني مع الحفاظ على هياكل الجذر غرامة سليمة.
Introduction
ميزات الجذر غرامة زيادة المياه واقتناء المواد المغذية للنبات، استكشاف مساحات جديدة من التربة وزيادة مساحة السطح الجذر مجموع. دوران هذه الميزات الجذر غرامة يلعب دوراً رئيسيا في تنشيط السلسلة الغذائية تحت الأرض1 وعدد جذور غرامة في بعض الأنواع النباتية من المتوقع أن يتضاعف تحت مرتفعة من ثاني أكسيد الكربون الجوي2. جذور غرامة عموما تعرف بأنها تلك أصغر من 2 مم في القطر، وعلى الرغم من أن تعريفات جديدة للدعوة لوصف جذور غرامة على الدالة3. مثل العديد من جذور غرامة، توفير وظيفة امتصاص واستيعاب جذر الشعر لكن تحتل مساحة أصغر من ذلك بكثير مع أقطار يقارب ميكرون. بسبب صغر حجمها، يصعب على الصورة في الموقع الشعر الجذر وكثيراً ما يتم التغاضي عنها كجزء من بنية الجذرية الشاملة في تجارب على المستوى الميداني والنماذج.
الدراسات، مثل اعتبارا من الشتلات المزروعة في لوحات أجار السابقين تيرا جذر الشعر، قدمت الأوساط العلمية بمعلومات قيمة عن النمو الخلوي والنقل4،5. بينما لوحات أجار تسمح أنظمة الجذر تصويرها غير المدمر وفي الوقت الحقيقي، أنها لا توفر الرقابة البيئية العالية لإضافة علاجات تجريبية مثل المواد الغذائية، والهرمونات النباتية، أو البكتيريا. وقد حلاً ناشئة لتسهيل التصوير عالية الدقة مع إتاحة مراقبة البيئة الحيوية أيضا ظهور منصات موائع جزيئية للدراسات النباتية. ومكنت هذه المنصات بالنمو غير المدمرة والتصور للعديد من الأنواع النباتية للإنتاجية العالية phenotyping6،7،،من89، العلاجات الكيميائية المعزولة 10وقوة القياسات11،12، وإضافة الكائنات الدقيقة13. تصاميم منصة موائع جزيئية تركز على استخدام طبقات فلويديك مساحة مفتوحة واحدة التي قد تنتشر الجذور، السماح للشعر الجذر الانجراف داخل وخارج التركيز البصري أثناء النمو أو العلاج.
نقدم هنا إجراء لتطوير منصة طبقتين موائع جزيئية باستخدام صور وأساليب الطباعة الحجرية الناعمة أن يبني على التصاميم النباتية على رقاقة السابقة بقصره الشعر الجذر الشتلات على نفس الطائرة التصوير كالجذر الرئيسي. وهذا يسمح لنا بتتبع التنمية الشعر الجذر في الوقت الحقيقي، بدقة عالية، وفي جميع مراحل عملية العلاج التجريبي. تسمح أساليب عملنا وتثقيف شتلات نبات التمويل أن نامي من البذور ضمن المنهاج ومثقف لتصل إلى أسبوع في محيط رطب والعقيمة التي لا تتطلب استخدام معدات الحقن مضخة. مرة واحدة وخلص الوقت الفاصل بين التصوير التجربة، يمكن فتح النظام الأساسي المعروض هنا دون الإخلال بموقف السمات الجذرية الدقيقة. وهذا يسمح باستخدام أساليب التصوير الأخرى عالية الدقة. هنا نقدم نتائج تمثيلية للقياس الكمي والتصور مورفولوجيا الجذر الشعر في هذا النظام الأساسي من المسح الضوئي، والمجهر الإلكتروني (SEM)، والقوة الذرية تقنيات الفحص المجهري (فؤاد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-طبقتين تصنيع منصة
- تصنيع شرائح رئيسية متعددة الطبقات
- تدور معطف مقاوم الضوء السلبية على أساس الإيبوكسي (المواد الصلبة ~63.45%، 1,250 لجنة العلم والتكنولوجيا) وفقا لمواصفات الجهة المصنعة (2,000 لفة في الدقيقة 45 s) على رقاقة سيليكون قطرها 4 بوصة للحصول على الارتفاع المطلوب من 20 ميكرومتر لطبقة التصميم الأولى.
- لينة-خبز رقائق مغلفة مقاومة لمدة 4 دقيقة عند 95 درجة مئوية. السماح ليفر بارد لفضح دقيقة 5 يفر إلى الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة لمدة 15 ق (~ 150 مللي جول/سم2 في 365 نانومتر) من خلال النبائط في الأشعة فوق البنفسجية اتصل راصفة لتعريف هندسة الطبقة السفلي.
- خبز بعد التعرض يفر لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية. دون تطوير، العودة يفر المغطى تدور وتدور على طبقة ثانية من مقاوم الضوء السلبية على أساس الإيبوكسي (المواد الصلبة ~76.75%، 80,000 لجنة العلم والتكنولوجيا) في 3000 دورة في الدقيقة لتحقيق ارتفاع طبقة ثانية من 150-200 ميكرون.
- السماح ليفر الراحة لمدة 5 دقائق قبل نقل إلى هوتبلت 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الخبز على هوتبلت، إزالة يفر وتسمح مقاومة لتبرد وتتصلب في درجة حرارة الغرفة لآخر 5 دقائق على سطح مسطح مستو. محاذاة وفضح يفر إلى النبائط الطبقة الثانية لمدة 30 ثانية في الأشعة فوق البنفسجية اتصال راصفة (جرعة من حوالي 300 مللي جول/سم2).
- القيام خبز بعد تعرض بوضع يفر على هوتبلت لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية وتسمح ثم يفر تبرد على سطح مسطح مستو لمدة 5 دقائق قبل وضع.
- وضع كل طبقات مقاومة في الوقت نفسه بوضع يفر إلى طبق بلاستيك وغمر الرقاقة في المطور المناسب (انظر الجدول المواد). روك بلطف الطبق أحياناً لغسل المطور جديدة أكثر الرقاقة.
- وبعد 17 دقيقة، شطف يفر مع الايزوبروبانول (IPA). إذا كان فيلم أبيض يظهر، تواصل التكرار بين الشطف الرقاقة مع المطور وأصد حتى يختفي الفيلم. رقاقة السيليكون منقوشة بالنيتروجين الجاف.
- بولي دايمثيل سيلوكسان لينة-الطباعة الحجرية
- تعريض رقاقة السيليكون لبلازما هواء لمدة 30 ثانية في بلازما أنظف تعيين على ارتفاع (انظر الجدول المواد) لتنظيف. سيلانيزي يفر مع سيلاني ثلاثي الكلور (ح 1، ح 1، ح 2، ح 2-perfluoro-n-أوكتيل) في غطاء كيميائية في هوتبلت أدناه اشتعال silane (85 درجة مئوية) ح 2.
- من أجل نسبة 10:1 من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) لعلاج عامل على رقاقة رئيسية السليكون. ديغا PDMS مختلطة في فراغ غرفة وعلاج ثم البوليمر في فرن 70 درجة مئوية لح 1 أو حتى يشفي تماما PDMS.
- استخدام مشرط، قطع أجهزة PDMS وقشر منهم من يفر الرئيسي السليكون. استخدام لكمه خزعة 1.5 مم لإنشاء مداخل البذور والعلاج، اللكم مدخل البذور بزاوية 45 درجة لتشجيع النمو الجذري في القناة الرئيسية.
- استخدم شريط لاصق واضحة لإزالة الحطام من الجهاز PDMS ووضع الجانب تصميم الجهاز لأسفل على ساترة زجاج. اﻷوتوكﻻف الأجهزة المجمعة.
2-زرع أجهزة
- إعداد بذور نبات التمويل
- سطح تعقيم البذور (أ) التمويل في [ميكروفوج] أنابيب مع إيجاد حل للتبييض المتوفرة تجارياً 30% المخفف في إزالة المتأين المنظفات "تريتون العاشر" المياه و 0.1% للحد الأدنى 7 أغسل البذور 4 مرات مع الماء المعقم.
- التجهيزة البذور بالتبريد [ميكروفوج] أنابيب بين عشية وضحاها أو حتى في أسبوع في 4 درجات مئوية.
- إعداد الجهاز
- وضع الأجهزة معقمة في فراغ ولﻵﻻت الدائرة لإزالة الهواء من الغاز نفاذية PDMS وقنوات فلويديك لتحسين سهولة التعبئة.
- إزالة الأجهزة من فراغ الغرفة وتغرق فورا الأجهزة في طبق بتري مليئة بالسائل قوام ¼ النباتات على أساس وسائل الإعلام على درجة الحموضة 5.7.
- استخدام ماصة، سحب السائل من خلال مداخل لملء الجهاز. تأكد من أن يظل لا فقاعات الهواء داخل قنوات بالمعاينة البصرية.
- نقل الأجهزة الفردية إلى أطباق بتري جافة جديدة. صب أو ماصة أجار الساخنة حول الجهاز حتى مستوى أجار تدفق تقريبا مع الجزء العلوي من الجهاز PDMS. تسمح أجار يصلب.
ملاحظة: الأجهزة جاهزة الآن لغرس بذور أو يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية حتى حاجة.
- زرع بذور داخل الأجهزة
- في بيئة معقمة، نقل بذور معقمة واحد إلى المدخل لكل جهاز باستخدام ماصة صغيرة.
- غطاء صحن بيتري مع الشمع فيلم (انظر الجدول المواد) ووضع في غرفة النمو ركوب الضوء/الظلام أو سيلز في درجة حرارة الغرفة. توجيه الطبق بيتري حيث تكون الأجهزة الرأسية والجاذبية سوف يشجع الجذور تنمو من خلال القناة.
3-معاملة
- علاجات تجريبية
- وفي الوقت المطلوب في التنمية الشتلات، إضافة العلاج التجريبي للشتلات بإضافة كمية محددة من العلاج لكل من المنافذ الجانبية 8 عبر ماصة.
- ختم طبق بيتري والعودة إلى دائرة النمو أو حافة النافذة.
- المضي قدما في تصوير العينات في الوقت المطلوب التقاط النقاط الزمنية الفردية أو البدء في التصوير بمرور الوقت.
4-بصري تصوير
- انخفاض تصوير القرار (4-20 X)
- ضع طبق بيتري كاملة تحتوي على الجهاز والشتلات تحت مجهر مقلوب حقل مشرق لحقل مشرق القرار (4-20 X) أقل أو تصوير التباين (DIC) التدخل التفاضلية. تحسين ظروف الإضاءة توضيح السمات المورفولوجية للاهتمام بضبط التعرض مرات وسطوع المصباح والفتحة والأقطاب من الضوء. محرك المرحلة إلى المنطقة المطلوبة من الجذر والتركيز على الجذر أو root hair(s) للفائدة.
- الحصول على نقطة مرة واحدة أو سلسلة زمنية من الصور. تصور نمو الشعر الجذر، صورة متزايدة جذر الشعر مرة واحدة كل دقيقة. أن تصور نمو الجذر الرئيسي، اكتساب صورة واحدة كل 30 دقيقة من عودة طبق بيتري والشتلات لدائرة النمو أو سيلز في وضع عمودي بعد الانتهاء من التصوير.
- التصوير العالي بالقرار (س 20-63)
- بمجرد الشتلات نمت لوقت المطلوب، استخدم الملقط لإزالة ساترة والجهاز من أجار. تنظيف قبالة الجزء السفلي من ساترة استخدام إيثانول تبلل الأنسجة المختبرية.
- تطبيق وسائل الإعلام الغمر الموصى بها إلى الهدف كما اقترحت الشركة المصنعة عدسة المجهر. ضع ساترة أسفل في مرحلة مجهر ورفع مرحلة الاتصال بوسائط الإعلام الانغماس في الهدف. تحسين ظروف الإضاءة بضبط التعرض مرات وسطوع المصباح، والفتحة والأقطاب من الضوء. محرك المرحلة إلى المنطقة المطلوبة، والتركيز على root hair(s) للفائدة.
ملاحظة: هناك حاجة إلى DIC لتصور لقطات هيولى، وعلامات فلورية ضرورية لتصور حركة عضية. - لقياس نمو جذور الشعر مع مرور الوقت، الحصول على صورة واحدة كل دقيقة. تصور حركة عضية، تقليل الوقت التعرض fluorescence بينما لا يزال الإبقاء على إشارة fluorescence شخصية من العضيات. الحصول على صور من العضيات بسرعة كما يسمح وقت التعرض. لفترة أطول من الوقت الفاصل بين التصوير، استخدم حاضنة مرحلة تصوير خلية يعيش للحفاظ على درجة الحرارة المحيطة والرطوبة.
ملاحظة: من المستحسن هدفا نفط X 63 للتصوير الشعر الجذر العضيات.
5-غير بصرية تصوير
- إعداد الجهاز
- مرة نمت الشتلات للوقت المطلوب،
- إيداع رقيقة (~ 20 nm) طبقة من الكروم على الجذر والمحيطة PDMS استخدام "غرفة التبخر شعاع الإلكترون بندقية مزدوجة".
- نقل الجذر وجهاز PDMS إلى دائرة المسح الإلكتروني المجهري.
ملاحظة: التصوير الشروط، أي الجهد، المسافة الحالية والعمل ستحتاج إلى أن يكون الأمثل لتحقيق الدقة المطلوبة لتطبيق محدد.
- تحميل الجانب جذر جهاز PDMS حتى على صاحب عينة فؤاد. لزيادة التباين في الكاميرا وأكثر بسهولة تمييز الجذر من PDMS، وضع الجهاز PDMS على الركازة عاكس مسطح (مثل ميكا مطلية بالذهب) قبل تركيب الجهاز على صاحب العينة فؤاد.
- تأمين ارتباط جيدا سائل على رأس الجهاز PDMS وملئه بالمياه للحفاظ على جذور رطب أثناء التصوير.
- تحميل صاحب العينة إلى فؤاد. ضبط z لسمك الجهاز PDMS ودفع ناتئ في المنطقة لمصلحة في الجذر باستخدام كاميرا للتوجيه.
- قم بمحاذاة الليزر بطرف ناتئ. للحصول على نتائج أفضل مع تصوير وضع الاتصال، استخدم cantilevers مع الثوابت الربيع من 0.01 أو 0.03 N/m إلى ممارسة الحد الأدنى من القوة على الجذر أثناء المسح الضوئي.
- انخفاض ببطء إليه المسح حتى ناتئ فقط يجعل الاتصال مع العينة. قم بضبط حجم المسح الضوئي للمنطقة المطلوبة واختر سرعة المسح الضوئي من سطر 1/s مع نقاط الجهد 256 كل سطر. الحصول على المسح الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد طبقتين PDMS موائع جزيئية الأجهزة الموضحة هنا قناة عالية 200 ميكرومتر لجذر نبات الرئيسي وغرفة عالية 20 ميكرومتر قصر المتزايد أفقياً جذر الشعر (الشكل 1A). هذا التصميم يمكن أن تستخدم للأنواع النباتية مع أقطار جذر مماثلة التمويل نبات ويمكن سهولة تعديل لاستيعاب الأنواع ذات الأحجام المختلفة. ويتضمن التصميم مدخل للمصنع وكذلك 8 المداخل الجانبية لأي علاج كيميائي أو بيولوجي المرجوة. بريفيلينج الأجهزة مع وسائط الإعلام، وصب أجار حول الجهاز تحافظ على البيئة الجذر رطب طوال فترة التجربة دون الحاجة إلى معدات فلويديك الخارجية. (الشكل 1B) كما تستقر أجار الجهاز داخل طبق بيتري، السماح لشتلات تزرع رأسياً لتشجيع نمو الجذر إلى أسفل القناة الرئيسية. طبق بيتري تبقى الشتلات الواردة في بيئة جنوتوبيوتيك وتسمح لنظام الجذر بتصويرها عن طريق طبق بيتري لتكبير تصل إلى 20 س. سيكون خيار آخر لختم مباشرة بجهاز PDMS لزجاج-قاع طبق بيتري لتكبير بصري حتى أعلى.
يمكن زرع بذور نبات التمويل مباشرة إلى مدخل الجهاز الذي هو اللكم بزاوية 45 درجة لتسهيل النمو الجذري في القناة الرئيسية. (الشكل 1) ارتفاع الجهاز PDMS ينبغي أن لا تتجاوز بضعة مليمترات، كالأوراق يجب أن تكون قادرة على النمو من أعلى المنصة. بسبب صغر حجمها، بذور أرابيدوبيس صعبة جداً لتوجيه ذلك أن الراديكالية الجذرية الناشئة تواجه القناة عند الإنبات. ولذلك، ما يقرب من نصف البذور المزروعة سوف تنبت مع أوراقها في القنوات ولا يمكن استخدامها لإجراء التجارب على التصور الجذر. قد تكون الأجهزة من هذه الشتلات re-يعقم وتستخدم مرة أخرى بدءاً من الخطوة 2، 2. لتشجيع النمو فوتوتروفيك براعم نبات التمويل ، قاعة عرض للجهاز قد تكون مشمولة في رقائق الألومنيوم حجب الضوء وتحسين معدل النجاح. جذور نبات التمويل قد نمت نمواً مطردا في هذا النظام الأساسي لمدة أسبوع، عند هذه النقطة يصبح توجيه النمو نحو تكوين الجذر الأفقي. (الشكل 1) معدل نمو الجذور في هذا المنهاج مماثلة لمعدلات النمو من جذور نبات التمويل في منصات موائع جزيئية أخرى. 13 تصميم طبقتين بنجاح يحصر الشعر الجذر على نفس الطائرة التصوير كالجذر الرئيسي. (الشكل 1E) ومع ذلك، قد يستمر بعض الشعر الجذر ينمو في القناة الرئيسية خارج التركيز البصري والتصاميم المستقبلية ينبغي أن تهدف إلى دليل جذر الشعر أكثر تدريجيا في قاعة الشعر الجذر.
الشكل 1: نمو نبات التمويل في منصة موائع جزيئية طبقتين. الجهاز (أ) يتكون من طبقتين إلى قصر الشعر الجذر على نفس الطائرة التصوير كالجذر الرئيسي (مقياس 1 مم). قد تكون الشتلات التمويل (أ) (ب) الوارد في بيئة جنوتوبيوتيك، (ج) نامي من البذور داخل الجهاز، مقياس بار = 400 ميكرون، (د) ورصد للنمو على مدى أسبوع (أشرطة الخطأ هي الانحراف المعياري، التنمية المستدامة) . يتم تصويرها الجذر الممثل (ه) في منهاج العمل، مقياس بار = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ضمن منهاج موائع جزيئية، يمكن قياسها كمياً الشعر الجذرية على مستوى خلوي من حيث طولها والكثافة، وأنجولاريتي من نموها من الجذر. (الشكل 2A) طول الشعر الجذر وكثافة من نوع البرية (أ) التمويل شتلات تزرع في برنامجنا ضمن مجموعة من الشتلات نمت عمودياً على لوحات أجار. 14 زاوية نمو الشعر الجذر عادة عمودياً على سطح الجذر. في برنامجنا، قد يكون أنجولاريتي نمو الشعر الجذر نحو التلميح قطعة أثرية من حبس الشعر الجذر لطائرة 2-الأبعاد. التحفيز الميكانيكي، وفي هذه الحالة بجدران الجهاز موائع جزيئية، لقد ثبت للحث على التغييرات في النمو الجذري والتوجه الذي قد يفسر التناقض بين منصة موائع جزيئية محصورة وصفيحة أجار مفتوحة. 15 من غير المرجح أن هذا النمط الظاهري هو نتيجة لإجهاد المغذيات في برنامجنا كما شتلة التمويل (أ) الاستفادة من الاحتياطيات الغذائية المخزنة من البذور في الأيام القليلة الأولى من النمو. على الرغم من أن نقص قد يكون مدعاة لقلق في نظم جذور مشبعة تماما، أثبت نفاذية الأكسجين PDMS توافق مع الحياة البوليمر مع أكسجين الأنسجة تعتمد سابقا. 16 , 17
واحدة من مزايا أقوى من منصات موائع جزيئية على أساليب لوحة أجار هو القدرة على إضافة شكل موحد التركيزات الدقيقة من العلاجات الكيميائية للكائنات الحية. في منصات موائع جزيئية قناة واحدة، يمكن أن يحتمل أن تشريد إضافة العلاجات غرامة الشعر الجذر من التركيز البصري. هنا نظهر الحفاظ على التركيز البصري الشعر الجذر في برنامجنا موائع جزيئية طبقتين أثناء إضافة الخرز الفلورسنت. في الشكل 2 يتم تصويرها شتلات (ط) قبل و (ثانيا) بعد إضافة الخرز البوليسترين كاربوكسيلاتيد نيون (زرقاء وحمراء). إضافة هذا العلاج اللاأحيائية عدم إخلال بالتوجه أو التركيز البصري لجذر الشعر الشتلات.
يمكن استخدام أعلى علامات التصوير ونيون التكبير الصورة، وتحديد التغييرات على مستوى عضية في تنمية الشعر الجذر (الشكل 2). يمكن رؤية الجري هيولى في شعر الجذر من (ط) التدخل التفاضلية تباين الصورة، وفي آخر الشعر الجذر من شتلات التي تحتوي على علامة عضية ثلاثية من18ومسار والتوزيع المكاني لثلاثة العضيات الثاني) غولجي (مشري)، بيروكسيسوميس (iii) (CFP)، و (رابعا) الميتوكوندريا (يفب) يتبين من الإسقاط أقصى شدتها في كل لوحة منها. يتم التقاط حركة هذه العضيات الثلاثة في مؤامرة توزيع تراكمي في الشكل 2.
رقم 2: توصيف جذر الشعر والعلاج- تم قياس كمية الشعر الجذر على ل الخلويةإيفل بالطول والكثافة أنجولاريتي ل n (A) = الشتلات البرية نوع (WT) 4 (أشرطة الخطأ هي التنمية المستدامة). أنجولاريتي يتحدد كزاوية بين تلميح الجذر الرئيسي وتلميح الجذر الشعر مع تلميح الجذر الرئيسي المحدد كعلامة 0°. (ب) التركيز البصري للشعر الجذرية لم يتغير (ط) قبل و (ثانيا) بعد التعامل معهم مع الخرز الفلورسنت البوليستيرين (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ج) عضية المستوى الكمي يتجلى في تصوير لقطات (ط) هيولى من صورة تباين تدخل تفاضلية، وفي شعر الجذر منفصلة، الأسفار العضيات ثلاثة: (ثانيا) غولجي (ثالثا) بيروكسيسوميس، و (الرابع) الميتوكوندريا (مقياس بار = 10 ميكرومتر). كانت تصور مسارات عضية بدمج الصور الفلورسنت التي اتخذت كل ق 23-32 ل 20 ثانية. تم تعقب تحركات العضيات ثلاثة تلقائياً وتوزيعات سرعة التراكمي المرسومة على الحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجهاز PDMS المقدمة هنا قد لا تم كيميائيا المستعبدين إلى ساترة زجاج ولكن بدلاً من أشكال سندات مادية ضعيفة التي يتم إنشاؤها أثناء خطوة التعقيم. يسمح هذا الجهاز ليتم تفكيكها بعد الانتهاء من تجربة التصوير الضوئي. الجهاز PDMS قد تكون مقشرة من الزجاج، مقلوب، والمستخدمة كركيزة لأعلى القرار التصوير الضوئية-مورفولوجيا الجذر (الشكل 3A). مريح يحمل المنصة الجذرية في مكان أثناء الاتصال مع ناتئ خلال مجهر القوة الذرية (الشكل 3B). علاوة على ذلك، إذا هو الحرص أثناء عملية التفكيك، سيظل الشعر الجذر في موقفها من الركازة PDMS. ويتضح ذلك من الصورة الضوئية من الجذر قبل التفكيك (الشكل 3)، وبعد تفكيك المنصة، وطلاء الشتلات في طبقة كروم موصلة 20 نانومتر للتصوير بالمسح الإلكتروني المجهري (3D الشكل ). كذلك المحافظة على الشتلات قبل تفكيك المنصة، مثبت أساس ألدهيد قد يكون حقن منصة التشعب بروتينات الأنسجة النباتية في مكان.
الشكل 3: تفكيك الجهاز والتصوير الضوئية-- (أ) منهاج موائع جزيئية يمكن تفكيكها واستخدامها كركيزة لأساليب التصوير غير الضوئية عالية الدقة. (ب) طبوغرافية السطح (صورة الحيود) نصيحة جذر نبات التمويل هو تصويرها باستخدام مجهر القوة الذرية وضع الاتصال، مقياس بار = 2 ميكرومتر. موقع ناتئ على الجذر يشار بواسطة سهم أسود في تدرج، مقياس بار = 100 ميكرومتر. (ج) الصورة الضوئية و (د) المقابلة المسح الإلكترون صورة مجهرية من الشتلات نفس قبل وبعد أن يتم تفكيك الجهاز. تؤكد سهام الشعر الجذرية التي تظل دون عائق، مقياس بار = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة الموضحة في هذه المقالة لإنشاء منصة معمل على رقاقة فريدة من نوعها في هذا التصميم طبقتين حدود قد فككت الشعر الجذر إلى طائرة واحدة تابعة لتصوير والمنهاج والمستخدمة كركيزة للتصوير غير الضوئية عالية الدقة . استخدام التصوير غير الضوئية عالية الدقة يمكن أن توفر معلومات قيمة عن الأنسجة النباتية التي لا يمكن الحصول عليها من وحدة التصوير الضوئي. على سبيل المثال، يمكن أن توفر تصوير فؤاد قياسات القوة لحساب مرونة أنسجة الجذر أثناء تطوير أو بعد علاج كيميائي أو بيولوجي محدد. وبالمثل، تصوير SEM يمكن تقديم تفاصيل عالية الدقة لتضاريس السطح من أنسجة الجذر، وعندما يقترن مع التصوير الكيميائية، يمكن تقديم معلومات عن تكوين عنصري من الأنسجة. 19 وأجيال المستقبل من هذا المنبر موائع جزيئية ستشمل الأمثل للتوافق مع أنظمة التصوير الكيميائية الأخرى مثل الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين-الكتلة الطيفي (استخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد) ومتماسكة لمكافحة ستوكس رامان التحليل الطيفي (السيارات).
الخطوات الحاسمة في هذه الطريقة تنطوي على استخدام أجار لتأمين الجهاز وتوفير الماء للنبات دون الحاجة إلى إجراءات معقدة تدفق السائل. ويجب أيضا توخي الحذر عند تفكيك الجهاز PDMS من الزجاج الركازة بغية الحفاظ على سلامة مورفولوجيا الجذر. إذا كان الهدف التجريبية لمنخفض للقرار المتوسطة التصوير الضوئي دون الحاجة إلى تفكيك الجهاز فقط، يجوز تعديل الإجراء للسندات كيميائيا الجهاز إلى الركيزة الزجاج الكامنة وراء استخدام الأوكسجين في البلازما. دقة أعلى ويمكن الحصول على الصور البصرية دون إزالة الجهاز من بيئتها جنوتوبيوتيك بالترابط PDMS مباشرة لزجاج كيميائيا القاع طبق بيتري وثم أجار صب حول PDMS كما تم وصفه سابقا.
تصميم 8 قنوات الجانب العلاج محاولة لحصر العلاج لمناطق معينة من الجذر. إلا أن هذا التصميم لم تنجح في منع نشر معاملة الجذر سبب الموصلية منطقة مفتوحة في القناة الجذرية الرئيسية إلى مناطق أخرى. من أجل علاج الجذر محلياً، سوف بنية الجهاز أما الحاجة إلى إعادة تصميم لقصر العلاجات أو المعاملة التي سوف تحتاج إلى إدخال عن طريق وسائل الإعلام لزج على بطء نشر في جميع أنحاء الجهاز مؤقتاً.
إذا كان من المستصوب لعلاجات تجريبية يمكن إضافتها عن طريق التدفق، كما سيلزم التعديلات لهذا النظام الأساسي. حاليا الإضافة لتدفق إلى أي نتائج مداخل منصة في الطرد من البذور من مدخل وصعوبة في السيطرة على موقع العلاجات فلويديك. يعمل هذا الأسلوب جيدا لشتلات إلى أسبوع واحد من العمر. ينحصر في كم من الوقت قد يستمر شتلة تنمو في منهاج العمل، بسبب طول القناة الرئيسية. وستشمل التعديلات المقبلة التمطيط القناة الرئيسية، وإدماج أكثر 200 ميكرومتر قنوات عالية للجذور الجانبية مع الإبقاء على قاعة طوله 20 ميكرومتر لحبس الشعر الجذر. وسيتطلب هذا التعديل المعرفة في الموقع المتوقع لظهور الجذر الأفقي من أجل تصميم جهاز مناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذه المخطوطة وقد تم تأليف UT-Battelle، شركة ذات مسؤولية محدودة تحت "رقم العقد" دي-AC05-00OR22725 مع وزارة الطاقة في الولايات المتحدة. وتحتفظ "حكومة الولايات المتحدة" والناشر، بقبول المادة للنشر، تعترف بأن "حكومة الولايات المتحدة" يحتفظ بترخيص غير حصري، المدفوع، ولا رجعة فيه، على نطاق العالم لنشر أو استنساخ النموذج المنشور من هذه المخطوطة، أو السماح للآخرين بالقيام بذلك، لأغراض "حكومة الولايات المتحدة". إدارة الطاقة سيوفر إمكانية وصول الجمهور إلى نتائج هذه البحوث التي ترعاها الحكومة الاتحادية وفقا "خطة وصول الجمهور" الفلاني (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
بتأييد هذا العمل جزئيا ببرنامج علوم الجينوم، ووزارة الطاقة في الولايات المتحدة، ومكتب العلوم والبيولوجية والبحوث البيئية، كجزء من "مصنع ميكروب الواجهات العلمية مجال التركيز" (http://pmi.ornl.gov). تصنيع منصات موائع جزيئية أجريت في "مختبر أبحاث النانومترى" في المركز "علوم المواد نانوفاسي"، وهو "منشأة" الكيان التشغيلي المعين للمستخدم مكتب العلوم. جا مدعومة زمالة أبحاث الدراسات عليا NSF تأيين-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
