Summary
Denne artikkelen viser hvordan du kultur Arabidopsis thaliana planter i en to-lags microfluidic plattform som begrenser det hovedavdeling rot og rot hår til et enkelt optisk plan. Denne plattformen kan brukes ved sanntid optisk avbildning av fine rot morfologi så vel som for høy oppløsning bilder på andre måter.
Abstract
Rot hår øke rot overflate område for bedre vann opptak og næringsstoffer absorpsjon av anlegget. Fordi de er små i størrelse og ofte skjult av naturen, er roten håret morfologi og funksjon vanskelig å studere og ofte utelatt fra planteforskning. De siste årene, har microfluidic plattformer tilbudt en måte å visualisere rotsystem med høy oppløsning uten å forstyrre røttene under overføring til en tenkelig system. Den microfluidic plattformen presenteres her bygger på tidligere anlegget på-chip forskning ved å innlemme en to-lags enhet for å begrense Arabidopsis thaliana viktigste roten til samme optiske plan som root hårene. Denne utformingen gjør kvantifisering av rot hår på en mobilnettet og organelle nivå og også forhindrer z drivende lagt eksperimentelle behandlinger. Beskriver vi hvordan du lagrer enhetene i et inneholdt og hydrert miljø uten behov for fluidic pumper, mens et gnotobiotic miljø for frøplante. Etter optisk tenkelig eksperimentet, kan enheten være demontert og brukt som et medium for atomic force eller skanning elektronmikroskop samtidig fine rot strukturer intakt.
Introduction
Fin rot funksjoner øke vann og næringsstoffer oppkjøp for anlegget, utforske nye jord områder og øker arealet totalt rot. Omsetningen av funksjonene fine rot spiller en stor rolle i å stimulere t næringskjeden1 og fine røtter i visse plantearter er forventet å doble under opphøyet atmosfærisk karbondioksid2. Fin røtter er generelt definert som mindre enn 2 mm i diameter, selv om nye definisjoner talsmann for å karakterisere fine røtter av deres funksjon3. Som mange fine røtter, rot hår gir funksjonen i opptak og absorpsjon, men tar opp mye mindre plass med diameter på mikron. På grunn av sin lille størrelse, rot hår er vanskelig å image i situ og er ofte oversett som en del av den samlede root arkitekturen i feltet skala eksperimenter og modeller.
Ex terra roten håret studier, eksempel fra planter dyrket på agar plater, har gitt det vitenskapelige samfunnet med verdifull informasjon om mobilnettet vekst og transport4,5. Mens agar plater tillater rotsystem til å avbildes ikke-ødeleggende måte og i sanntid, at de ikke gir høy miljøkontroll for tillegg av eksperimentelle behandlinger som næringsstoffer, plantehormoner eller bakterier. En nye løsning å tilrettelegge høyoppløselig imaging mens også affording dynamisk miljøkontroll har vært ankomsten av microfluidic plattformer for plante studier. Disse plattformene har aktivert ikke-destruktiv vekst og visualisering av flere plantearter for høy gjennomstrømning phenotyping6,7,8,9, isolerte kjemiske behandlinger 10, force målinger11,12og tillegg av mikroorganismer13. Microfluidic plattform design fokusert på bruk av én åpen plass fluidic lag der røttene kan videreføres, tillater rot hårene til drift av optisk fokus under vekst eller behandling.
Her presenterer vi en prosedyre for å utvikle en to-lags microfluidic plattform bruke bilde og myk-litografi metoder som bygger på tidligere anlegget på-chip design av confining frøplante rot hårene på samme tenkelig planet som det hovedavdeling rot. Dette kan vi spore rot hår utvikling i sanntid, med høy oppløsning, og gjennom eksperimentell behandlingsprosessen. Våre culturing metoder kan Arabidopsis thaliana planter å være spirer fra frø i plattformen og kultivert for opptil en uke i et hydrert og sterilt miljø som ikke krever bruk av sprøyten pumpe utstyr. Når time-lapse tenkelig eksperimentet er avsluttet kan plattformen presenteres her åpnes uten å forstyrre plasseringen av de finere rot-funksjonene. Dette tillater bruk av andre høy resolution tenkelig metoder. Her gir vi representant resultater for kvantifisering og visualisering av roten håret morfologi i denne plattformen av optisk, skanning elektronmikroskop (SEM) og atomic force mikroskopi teknikker (AFM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. to-lags plattform fabrikasjon
- Fabrikasjon av flerlags masters
- Spin pels epoxy-baserte negative photoresist (~63.45% faste stoffer, 1250 cSt) i henhold til produsentens spesifikasjoner (2000 rpm for 45 s) på en 4 tommers diameter silisium wafer å få ønsket høyde på 20 µm for første design laget.
- Soft-bake motstå belagt wafere for 4 min på 95 ° C. Tillate wafer å kjøle for 5 min. utsette kjeks for UV-lys for 15 s (~ 150 mJ/cm2 på 365 nm) gjennom en photomask i en UV kontakt aligner definere geometri i det nederste laget.
- Etter eksponering bake kjeks i 5 min på 95 ° C. Uten å utvikle tilbake kjeks til spin coater og spinn på et ekstra lag med epoxy-baserte negative photoresist (~76.75% faste stoffer, 80.000 cSt) på 3000 rpm å oppnå en andre lag høyde på 150-200 µm.
- Tillate wafer til hvile i 5 minutter før du overfører til en 95 ° C kokeplate i 45 minutter. Etter bakervarer på varmeplaten, fjerne kjeks og la resist Avkjøl og stivne ved romtemperatur for en annen 5 min på flat jevnt underlag. Juster og utsette wafer til det andre laget photomask for 30 s i en UV kontakt aligner (dose av ca 300 mJ/cm2).
- Utføre en post-eksponering bake ved å plassere kjeks på en kokeplate i 15 min på 95 ° C, og deretter la kjeks avkjøles på en flat plan overflate for 5 min før utvikling.
- Utvikle både motstå lag samtidig ved å plassere kjeks i en plast parabol og submerging kjeks i riktig utvikleren (se Materialer tabell). Forsiktig rock parabolen mellomrom for å vaske frisk utvikler over kjeks.
- Etter 17 minutter, skyll kjeks med isopropanol (IPA). Hvis en hvit film vises, Fortsett å veksle mellom skylling kjeks med utvikler og IPA til filmen forsvinner. Tørr mønstret silisium kjeks med nitrogen.
- Polydimethylsiloxane Soft-Litografi
- Utsette silisium wafer til en luft plasma for 30 s i en plasma renere på høy (se materialer tabell) å rengjøre. Silanize kjeks med trichloro (1H 1H 2H, 2H-perfluoro-n-octyl) silane i en kjemisk panseret på en kokeplate under flashpoint av silane (85 ° C) 2 h.
- Hell 10:1 forholdet polydimethylsiloxane (PDMS) til herding agent på silisium master kjeks. Degas blandet PDMS i et vakuum kammer og deretter kurere polymer i en 70 ° C ovnen i 1 time eller til PDMS er fullstendig kurert.
- Ved hjelp av en skalpell, kuttet PDMS enhetene og Skrell dem fra silicon master kjeks. Bruke en 1,5 mm biopsi punch til å lage frø og behandling viker, stansing frø innløp i 45° vinkel å oppmuntre akselerere veksten i viktigste kanalen.
- Bruke klar teip å fjerne rusk fra PDMS enheten og plassere enheten design siden ned på et glass dekkglassvæske. Autoclave sammensatte enheter.
2. planting enheter
- Arabidopsis thaliana frø forberedelse
- Overflaten sterilisere A. thaliana frø i et microfuge rør med en løsning på 30% kommersielt tilgjengelig blekemiddel fortynnet i de-ionisert vann og 0,1% Triton X vaskemiddel for 7 min. vask frø 4 ganger med sterilt vann.
- Stratify frø av kjøle microfuge rør over natten eller opptil en uke på 4 ° C.
- Enheten forberedelse
- Setter steriliserte enheter i et vakuum avgassing kammer å fjerne luft fra gass permeabel PDMS og fluidic kanaler for å lette fylling.
- Fjerne enheter fra vakuum kammeret og umiddelbart dukke enhetene i en Petriskål fylt med flytende ¼ styrke plantebaserte media ved pH 5.7.
- Bruker en pipette, tre flytende viker å fylle enheten. Kontroller at ingen luftbobler forbli innenfor kanaler ved by visuell inspeksjon.
- Overføre personlige enheter til nye tørr Petri retter. Hell eller Pipetter varme agar rundt enheten til agar er nesten i flukt med toppen av PDMS enheten. Tillate agar å stivne.
Merk: Enheter er nå klare for planting frø eller kan lagres på 4 ° C inntil nødvendig.
- Planting frø i enheter
- I et sterilt miljø, overføre ett sterilisert frø i innløpet til hver enhet bruker en liten pipette.
- Deksel Petriskål med voks film (se Materialer tabell) og plasser i lys/mørke sykling vekst kammer eller vinduskarmen ved romtemperatur. Plasser Petriskål slik at enhetene er loddrett og tyngdekraften vil oppmuntre røttene å vokse gjennom kanalen.
3. behandling
- Eksperimentell behandlinger
- Samtidig ønsket frøplantes utvikling, legge til eksperimentell behandling frøplante ved å legge en foreskrevne mengde behandling til hver av de 8 side portene via pipette.
- Forsegle Petriskål og tilbake til vekst kammer eller vinduskarmen.
- Fortsett med imaging prøver samtidig ønsket å ta individuelle poeng eller starte tid forfalle bildebehandling.
4. optisk tenkelig
- Lavere oppløsning (4-20 X) bildebehandling
- Plassere hele Petriskål inneholder enheten og frøplante under en invertert lyse feltet mikroskop for lavere oppløsning (4-20 X) lyse felt eller differensiell forstyrrelser kontrast (DIC) bildebehandling. Optimalisere lysforhold å belyse morfologiske funksjoner av interesse ved å justere eksponeringstider, Lyspærens skarphet, aperture og polariteten til lys. Kjøre scenen til ønsket område i roten og fokus på rot eller root hair(s) rundt.
- Anskaffe et enkelt punkt eller en gang-serie med bilder. For å visualisere veksten av rot hår, bilde voksende rot hår en gang per min. Visualisere veksten av det hovedavdeling rot, få ett bilde hver 30 min. tilbake Petriskål og seedlings vekst kammer eller vinduskarmen i vertikal posisjon når imaging er fullført.
- Høyere oppløsning (20-63 X) bildebehandling
- Når frøplante har vokst i ønsket tid, bruke pinsett fjerne dekkglassvæske og enheten fra agar. Rengjør av bunnen av dekkglassvæske ved hjelp av en etanol wetted laboratorium vev.
- Gjelde målet som foreslått av mikroskopet linsen produsenten anbefalte nedsenking media. Plasser dekkglassvæske ned på mikroskopet scenen og heve scenen for å kontakte nedsenking media på målet. Optimalisere lysforholdene ved å justere eksponeringstider, Lyspærens skarphet, aperture og polariteten til lys. Kjøre scenen til ønsket område og fokus på root hair(s) rundt.
Merk: DIC er nødvendig for å visualisere cytoplasmatiske streaming, og fluorescens markører er nødvendig for å visualisere organelle bevegelse. - For å kvantifisere rot hårvekst over tid, kan du kjøpe ett bilde per min. For å visualisere organelle bevegelse, minimere fluorescens eksponeringstid mens du fremdeles beholder en identifiserbar fluorescens signalet fra organeller. Hente bilder av organeller så raskt som eksponeringstid. For lenger tidsinnstilt bildebehandling, bruker du en live-celle tenkelig scenen inkubator for å opprettholde Omgivelses temperatur og fuktighet.
Merk: En 63 X oljeobjektiv anbefales for bildebehandling roten håret organeller.
5. ikke-optisk tenkelig
- Enheten forberedelse
- Når frøplante vokst for ønsket tid,
- Sette inn en tynn (~ 20 nm) laget av krom på roten og omkringliggende PDMS bruker en dobbel pistol elektron strålen fordampning kammer.
- Overføre roten og PDMS enheten til en scanning elektron mikroskop kammer.
Merk: Imaging forhold, dvs. spenning, nåværende og arbeider avstand må være optimalisert for å oppnå ønsket oppløsning for en gitt applikasjon.
- Montere PDMS enheten roten siden opp på en AFM prøveholder. Økt kontrast i kameraet og enklere skille roten fra PDMS, plassere PDMS enheten på et flatt reflekterende substrat (for eksempel belagt i gull glimmer) før du monterer enheten på prøveholderen AFM.
- Sikre en flytende godt feste på PDMS enheten og fyll den med vann for å holde røtter hydrert under bildebehandling.
- Legg prøveholderen i AFM. Justere z-kontrollen til tykkelsen på PDMS enheten og kjøre hengende i regionen rundt på roten bruker et kamera for veiledning.
- Justere laseren spissen hengende. Best resultater med kontakt modus bildebehandling, kan du bruke utkragning med våren konstanter av 0,01 eller 0,03 N/m for å utøve minimal kraft på roten under skanning.
- Sakte senke skanning mekanismen til hengende bare kommer i kontakt med prøven. Justere størrelsen på skanning for ønsket område og velg en skanning fart av 1 linje/s med 256 spenning poeng per linje. Erverve skanningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To-lags PDMS microfluidic enhetene beskrevet her har en 200 µm høy kanal for det hovedavdeling Arabidopsis rot og en 20 µm høy chamber begrense sideveis voksende rot hår (figur 1A). Denne utformingen kan brukes for plantearter med lignende root diameter som Arabidopsis thaliana og lett kan endres til arter av forskjellige størrelser. Utformingen omfatter en vik for anlegget og 8 side viker for ønsket kjemiske eller biologiske behandling. Prefilling enhetene med medier og helle agar rundt enheten holder rot miljøet hydrert for varigheten av forsøket uten behov for eksterne fluidic utstyr. (Figur 1B) Agar stabiliserer også enheten i Petriskål, slik at seedlings være voksen loddrett å oppmuntre akselerere veksten ned viktigste kanalen. Petriskål holder seedlings i et gnotobiotic miljø og lar rotsystemet avbildes gjennom Petriskål til størrelser opptil 20 X. Et annet alternativ ville være å forsegle direkte PDMS enheten til et glass-bottom Petriskål enda høyere optisk forstørrelser.
Arabidopsis thaliana frø kan plantes direkte til enheten mengden som er hullet i 45-graders vinkel å lette akselerere veksten i viktigste kanalen. (Figur 1 c) Høyden på PDMS enheten må ikke overstige noen millimeter, som bladene må kunne vokse opp på toppen av plattformen. På grunn av sin lille størrelse er Arabidopis frø svært vanskelig å orientere slik at den nye rot radikale ansikter kanalen på spiring. Derfor omtrent halvparten av frø plantet vil spire med sine blader i kanaler og kan ikke brukes for rot visualisering eksperimenter. Enheter fra disse planter kan være re-autoklaveres og brukes igjen begynner fra trinn 2.2. For å oppmuntre phototrophic vekst av Arabidopsis thaliana skudd, kan ser Mysteriekammeret enheten være dekket i aluminiumsfolie blokkere lys og forbedre suksessrate. Arabidopsis thaliana røtter har vokst jevnt i denne plattformen for uken, da vekst blir rettet mot lateral rot formasjon. (Figur 1 d) Veksten av røtter i denne plattformen kan sammenlignes med vekstrate på Arabidopsis thaliana røtter i andre microfluidic-plattformer. 13 to-lags design vellykket begrenser rot hårene på samme tenkelig planet som det hovedavdeling rot. (Figur 1E) Men noen rot hår kan fortsette å vokse i hovedkanalen optisk uskarpt og fremtidige design bør sikte på å lede mer gradvis rothår i roten håret kammeret.
Figur 1: Vekst av Arabidopsis thaliana i to-lags Microfluidic plattform. (A) enhet består av to lag begrense rot hår på samme tenkelig planet som viktigste rot (skala 1 mm). A. thaliana frøplanter kan være (B) finnes i et gnotobiotic miljø, (C) spirer fra frø i enheten, skalere bar = 400 µm, (D) og overvåkes for vekst i løpet av uken (feilfelt er standardavvik, SD) . (E) A representant rot er avbildet i plattformen, skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Innen microfluidic plattformen, kan rot hår kvantifiseres på cellenivå lengden, tetthet og geometrisk deres vekst fra roten. (Figur 2A) Rot hår lengde og tetthet av A. thaliana vill type planter dyrket i vår plattform er innen rekkevidde av planter dyrket vertikalt på agar plater. 14 av rot hårvekst er vanligvis vinkelrett på overflaten av roten. I vår plattform være geometrisk rot hår vekst mot spissen en gjenstand confinement av hår roten til et 2-dimensjonal plan. Mekanisk stimulering, har i dette tilfellet av microfluidic enheten, vist seg å skape rot vekst og retning som kan forklare avvik mellom en begrenset microfluidic plattform og en åpen agar plate. 15 det er usannsynlig at denne fenotypen er resultatet av et næringsstoff stress i vår plattform som A. thaliana frøplanter bruke lagrede mat reserver fra frø i de første dagene av vekst. Selv om hypoksi kan være et problem i mettede rotsystem, har oksygen permeabiliteten av PDMS tidligere vist biokompatibilitet av polymer med oksygen avhengige vev. 16 , 17
En av de sterkeste fordelene av microfluidic over agar plate metoder er evnen å tilføye jevnt presis konsentrasjoner av kjemiske behandlinger å organismer. I enkelt kanal microfluidic plattformer, kan tillegg av behandlinger potensielt fortrenge fine rot hår fra optisk fokus. Her viser vi vedlikehold av roten håret optisk fokus på våre to-lags microfluidic plattform fluorescerende perler ble lagt. I figur 2B er en frøplante fotografert (i) før og (ii) etter tilsetning av lysrør carboxylated polystyren perler (blå og rød). Tillegg av denne abiotiske behandlingen ikke avbryte retning eller optisk fokus for frøplantes rot hår.
Høyere forstørrelse tenkelig og fluorescerende indikatorer kan brukes til bilde og kvantifisere organelle endringer i roten håret utvikling (figur 2C). Cytoplasmatiske streaming kan sees i en rot hår fra en (i) differensial forstyrrelser kontrast bildet og i en rot hår fra en frøplante inneholder en trippel organelle markør18, bane og romlige fordelingen av tre organeller ii) Golgi (mCherry), (iii) peroxisomes (CFP), og (iv) mitokondrier (YFP) kan sees fra maksimale intensitet projeksjon i hvert respektive panel. Flytting av disse tre organeller er fanget i en kumulativ plot i figur 2C.
Figur 2: roten håret karakterisering og behandling. Rot hår kvantifisert på en Mobiltlf lEvel av (A) lengde, tetthet og geometrisk n = 4 vill type (WT) planter (feilfelt er SD). Geometrisk bestemmes som vinkelen mellom hovedavdeling rot tips og rot hårtuppene hovedavdeling rot spissen definert som 0° merket. (B) optisk fokus for root hårene uendret (i) før og (ii) etter behandle dem med polystyren fluorescerende perler (skala bar = 100 µm). (C) Organelle nivå kvantifisering er demonstrert av imaging (i) cytoplasmatiske streaming fra en differensiell forstyrrelser kontrast bilde og i en egen rot hår, fluorescens av tre organeller: (ii) Golgi (iii) peroxisomes og (iv) mitokondrier (skala bar = 10 µm). Organeller baner var visualisert ved å flette fluorescerende bilder tatt alle 23-32 s for 20 s. Bevegelser av tre organeller ble sporet automatisk og kumulative hastighet distribusjoner tegnet til høyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
PDMS enheten presentert her har ikke blitt kjemisk festet til et glass dekkglassvæske men heller danner en svakere fysiske bånd som er opprettet under det autoklavering steget. Dette gjør at enheten kan deles når optisk tenkelig eksperimentet er fullført. PDMS enheten kan være skrelles fra glass, invertert, og brukt som et medium for høyere oppløsning ikke-optisk avbilding av rot morfologi (figur 3A). Plattformen holder beleilig roten på plass under kontakt med en cantilever under atomic force mikroskopi (figur 3B). Videre, hvis omsorg er tatt under demontering prosessen, blir rot hår i posisjon på PDMS underlaget. Dette er demonstrert av optisk bildet av rot før demontering (Figur 3 c) og etter demontering av plattformen og belegg frøplante i et 20 nm ledende krom lag for bildebehandling med en scanning elektron mikroskop (figur 3D ). For å ytterligere for å bevare frøplante før nedbygging plattformen, kan en aldehyd-baserte bindemiddel sprøytes inn plattformen til krysskobling anlegget vev proteinene i stedet.
Figur 3: enheten dekonstruksjon og ikke-optisk tenkelig. (A) microfluidic plattformen kan demonteres og brukt som et medium for høy oppløsning ikke-optisk tenkelig metoder. (B) overflate topografien (Diffraksjon bilde) en Arabidopsis thaliana rot tips er fotografert ved hjelp kontakt modus atomic force mikroskopi, skala bar = 2 µm. Plassering for hengende på roten angis med en svart pil i senket, skala bar = 100 µm. (C) optisk image og (D) tilsvarende skanning elektron mikroskop-bilde av samme frøplante før og etter enheten er demontert. Piler understreke rot hår som forblir uforstyrret, skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikkelen for å opprette en plante-on-a-chip plattform er unik ved at den to-lags design rammen rot hårene til et enkelt tenkelig fly og plattformen kan dekonstruerte og brukt som et medium for høy oppløsning ikke-optisk tenkelig . Med høy oppløsning ikke-optisk imaging kan gi verdifull informasjon om anlegget vev som ikke kunne hentes fra optisk tenkelig alene. For eksempel kan AFM bildebehandling gi kraft målene for å beregne elastisitet av rot vev under utvikling eller etter en bestemt kjemiske eller biologiske behandling. Tilsvarende SEM bildebehandling kan gi høy oppløsning detaljene i form av rot vev og, når kombinert med kjemiske bildebehandling, kan gi informasjon om grunnleggende sammensetningen av vev. 19 fremtidige generasjoner av denne microfluidic plattform inkluderer optimalisering for kompatibilitet med andre kjemiske tenkelig systemer som matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering-masse spektroskopi (MALDI-MS) og sammenhengende anti-Stokes Raman spektroskopi (biler).
Avgjørende skritt i denne metoden innebærer bruker agar sikre enheten og gir fuktighet til anlegget uten behov for komplisert strømning prosedyrer. Hensyn må også tas når nedbygging PDMS enheten fra glass underlaget for å holde rot morfologi intakt. Hvis eksperimentelle målet er for lav til middels oppløsning optisk tenkelig uten behov for enheten dekonstruksjon, kan prosedyren endres til kjemisk obligasjon enheten til det underliggende barometer substratet bruker oksygen plasma. Høyere oppløsning optisk bilder kan fås uten å fjerne enheten fra omgivelsene gnotobiotic av kjemisk binding PDMS direkte til et glass bunn Petriskål og deretter helle agar rundt PDMS beskrevet som tidligere.
Utformingen av 8 behandling siden kanaler var et forsøk på å begrense behandlinger til visse områder av rot. Men var dette mislykket i å forebygge spredningen av behandling til andre områder av roten på grunn av konduktans av det åpne området i hovedavdeling rot kanalen. For å lokalt behandle roten, vil enheten arkitekturen må være redesignet for å begrense behandlinger eller behandling må introduseres via en tyktflytende medier å midlertidig redusere spredningen hele enheten.
Hvis det er ønskelig for eksperimentell behandlinger legges via flyt, vil endringer også være nødvendig for denne plattformen. Foreløpig tillegg av flyt til noen av plattform viker resultatene i utvisningen av frø fra innløpet og vanskeligheter med å kontrollere plasseringen av fluidic behandlinger. Denne metoden fungerer bra for planter 1 uke alder. Det er begrenset i hvor lenge seedlings kan fortsette å vokse i plattformen, på grunn av lengden på den viktigste kanalen. Modifikasjoner vil innebære elongating viktigste kanalen og innlemme 200 µm høy kanaler for sideveis røtter samtidig beholde 20 µm høye kammeret for roten håret confinement. Denne endringen krever kunnskap om forventet plasseringen av lateral rot fremveksten utforme en passende enhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette manuskriptet er skrevet av UT-Battelle, LLC under Kontraktnr. DE-AC05-00OR22725 med US Department of Energy. USAs regjering beholder og utgiveren, godtar artikkelen for publikasjonen, erkjenner at myndighetene i USA beholder en ikke-eksklusiv, innbetalt, ugjenkallelig, verdensomspennende lisens til å publisere eller reprodusere publisert form av dette manuskriptet, eller tillate andre å gjøre det, for USA regjeringen formål. Department of Energy vil gi publikum tilgang til disse resultatene av føderalt sponset forskning i samsvar med DOE offentlig tilgang Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Dette arbeidet var støttes delvis av genomisk Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiske og miljøforskning, som en del av anlegget mikrobe grensesnitt vitenskapelige fokusområdet (http://pmi.ornl.gov). Fabrikasjon av microfluidic plattformene ble gjennomført i forskningslaboratoriet Nanofabrication ved Center for Nanophase materialer fag, som er en DOE kontoret av vitenskap bruker anlegget. JAA støttes av en NSF graduate forskningsstipend DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
