Summary
Este artículo muestra cómo cultivar plántulas de Arabidopsis thaliana en una plataforma de dos capas de microfluidos que confina la raíz principal y pelos de la raíz a un solo plano óptico. Esta plataforma puede utilizarse para imágenes ópticas en tiempo real de la morfología de la raíz fina, así en cuanto a la proyección de imagen de alta resolución por otros medios.
Abstract
Pelos de la raíz aumentar la superficie de la raíz para la mejor absorción de agua y absorción de nutrientes por la planta. Porque son de tamaño pequeño y a menudo obscured por su entorno natural, la función y morfología del pelo de la raíz son difíciles de estudiar y a menudo excluidos de la investigación de la planta. En los últimos años, las plataformas microfluídicas han ofrecido una manera de visualizar sistemas radiculares en alta resolución sin perturbar las raíces durante la transferencia a un sistema de proyección de imagen. La plataforma de microfluidos presenta aquí construye en investigaciones anteriores de la planta en un chip mediante la incorporación de un dispositivo de dos capas para limitar la raíz principal de Arabidopsis thaliana en el mismo plano óptico como los pelos de raíz. Este diseño permite la cuantificación de los pelos de la raíz en un celular y organelas nivel y también evita el eje z a la deriva durante la adición de tratamientos experimentales. Se describe cómo almacenar los dispositivos en un ambiente contenido e hidratado, sin necesidad de bombas fluídicas, manteniendo un ambiente gnotobiótico para la plántula. Tras el experimento de proyección de imagen óptico, el dispositivo puede desmontado y utilizado como sustrato de fuerza atómica o microscopía electrónica de barrido manteniendo estructuras fina raíz intacta.
Introduction
Características del bien raíz aumentan agua y adquisición de nutrientes para la planta, explorar nuevos espacios de suelo y el aumento de la superficie total de la raíz. El volumen de negocios de estas características de raíz fina juega un papel importante en estimular la cadena alimenticia metro1 y el número de raíces finas en determinadas especies de plantas es que doble en dióxido de carbono atmosférico elevado2. Raíces finas se definen generalmente como aquellos menores de 2 mm de diámetro, aunque nuevas definiciones de abogan para la caracterización de las raíces finas por su función3. Como muchas raíces finas, pelos de la raíz proporciona la función de absorción y absorción pero ocupan un espacio mucho más pequeño con un diámetro del orden de micras. Debido a su pequeño tamaño, pelos radicales son difíciles de imagen en situ y son a menudo pasados por alto como parte de la estructura general de la raíz en el campo escala experimentos y modelos.
Ex terra pelos estudios, como las plántulas cultivadas en placas de agar, han proporcionado información valiosa sobre el crecimiento celular y transporte4,5a la comunidad científica. Mientras que las placas de agar permiten sistemas de raíz a ser reflejada de forma no destructiva y en tiempo real, no ofrecen alto control ambiental por la adición de tratamientos experimentales tales como nutrientes, hormonas de plantas o bacterias. Una solución emergente para facilitar la proyección de imagen de alta resolución mientras que también ofrezcan control ambiental dinámico ha sido el advenimiento de las plataformas de microfluidos para estudios de la planta. Estas plataformas han permitido el crecimiento no destructiva y la visualización de varias especies de plantas de alto rendimiento phenotyping6,7,8,9, tratamientos químicos aislados 10, de11,de las medidas de fuerza12y la adición de microorganismos13. Diseños de plataforma de microfluidos se han centrado en el uso de capas fluídicas único espacio abierto en el que pueden propagar las raíces, permitiendo los pelos de la raíz a la deriva dentro y fuera de foco óptico durante el crecimiento o el tratamiento.
Aquí presentamos un procedimiento para desarrollar una plataforma de microfluidos dos capas utilizando métodos de litografía suave y foto que por el confinamiento de los pelos de la raíz de plántulas en el mismo plano de proyección de imagen que la raíz principal se basa en los diseños de planta-en-un-chip. Esto nos permite seguir el desarrollo de pelos radicales en tiempo real, en alta resolución y en todo el proceso de tratamiento experimental. Nuestros métodos de cultivo permiten plántulas de Arabidopsis thaliana a germinado de la semilla dentro de la plataforma y culta por hasta una semana en un ambiente estéril e hidratada que no requiere el uso de equipo de la bomba de jeringa. Una vez que ha concluido el experimento de Time-lapse, la plataforma presentada aquí puede abrirse sin perturbar la posición de las características más finas de raíz. Esto permite el uso de otros métodos de proyección de imagen de alta resolución. Aquí proporcionamos resultados representativos para la cuantificación y visualización de la morfología del pelo de la raíz en esta plataforma por microscopía óptica, exploración (SEM) y la fuerza atómica técnicas de microscopía (AFM).
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Protocol
1. dos capas fabricación de plataforma
- Fabricación de múltiples maestros
- Vuelta capa de photoresist negativo basado en epoxy (~63.45% sólidos, 1.250 cSt) según las especificaciones del fabricante (2.000 rpm durante 45 s) sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas de diámetro para obtener la altura deseada de 20 μm para la primera capa de diseño.
- Suave-cueza al horno las obleas recubierta resisten durante 4 min a 95 ° C. Permiten oblea enfriar durante 5 minutos expone la oblea a la luz por 15 UV s (~ 150 mJ/cm2 a 365 nm) a través de un photomask en UV en contacto con alineador para definir la geometría de la capa inferior.
- Post-exposición cueza al horno la oblea por 5 min a 95 ° C. Sin desarrollar, retomar la oblea el recubridor spin y spin en una segunda capa de photoresist negativo de epoxy-basado (~76.75% sólidos, 80.000 cSt) a 3.000 rpm para conseguir una segunda altura de la capa de 150-200 μm.
- Permiten la oblea descansar 5 minutos antes de transferirlas a una placa de 95 ° C por 45 min. Después de hornear sobre la placa, retirar la oblea y permite resistir a enfriar y endurecer a temperatura ambiente durante otros 5 minutos sobre una superficie plana. Alinee y exponer la oblea a la segunda capa photomask durante 30 s en un alineador contacto UV (dosis de aproximadamente 300 mJ/cm2).
- Realizar un horneado posterior a la exposición mediante la colocación de la oblea sobre una placa durante 15 min a 95 ° C y luego permitir que la oblea se enfríe sobre una superficie plana durante 5 minutos antes de desarrollar.
- Desarrollar ambas capas de resistir simultáneamente colocando la oblea en un plato plástico y sumergir la oblea en el revelador adecuado (véase Tabla de materiales). Muévalo suavemente el plato de vez en cuando para lavar revelador fresco sobre la oblea.
- Después de 17 minutos, enjuague la oblea con isopropanol (IPA). Si aparece una película blanca, continúan iterar entre enjuague la oblea con el desarrollador y la IPA hasta que desaparezca la película. Seque la oblea de silicio con motivos con nitrógeno.
- Polydimethylsiloxane suave-litografía
- Exponer la oblea de silicio a un plasma de aire para 30 s en un limpiador de plasma en alta (ver la tabla de materiales) para limpiar. Silanize la oblea con tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octilo) silano en una campana química sobre una placa por debajo el punto de inflamación de silano (85 ° C) durante 2 h.
- Vierta una relación 10:1 de polidimetilsiloxano (PDMS) de agente de curado en la oblea de silicio principal. Desgasificar la mezcla PDMS en una cámara de vacío y después curar el polímero en un horno de 70 ° C durante 1 hora o hasta que el PDMS esté completamente seca.
- Con un bisturí, cortar los dispositivos PDMS y pelar de la oblea de silicio principal. Utilizar un punch de biopsia de 1,5 mm para crear entradas de semilla y tratamiento, perforando la entrada de la semilla en un ángulo de 45° para promover el crecimiento de la raíz en el canal principal.
- Utilizar cinta adhesiva transparente para eliminar los residuos desde el dispositivo PDMS y coloque el lado de diseño del dispositivo hacia abajo sobre un cubreobjetos de vidrio. Autoclave de los dispositivos montados.
2. dispositivos de siembra
- Preparación de la semilla de Arabidopsis thaliana
- Superficie de esterilizar las semillas de a. thaliana en un tubo de microcentrífuga con una solución de cloro disponibles en el mercado 30% diluido en desionizada agua 0,1% Triton X detergente para 7 minutos semillas de lavado 4 veces con agua estéril.
- Estratificar semillas por tubo de microcentrífuga de refrigeración durante la noche o hasta por una semana a 4 ° C.
- Preparación del dispositivo
- Colocar dispositivos esterilizados en un cámara para eliminar el aire del gas de desgasificación al vacío permeable al PDMS y canales fluídicos para mejorar la facilidad de llenado.
- Quite los dispositivos de la cámara de vacío y sumergir inmediatamente los dispositivos en una placa Petri con líquido ¼ fuerza planta basado en los medios de comunicación a pH 5.7.
- Usando una pipeta, tirar el líquido a través de las entradas para llenar el dispositivo. Asegúrese de que no hay burbujas de aire siguen siendo dentro de canales por inspección visual.
- Transferencia de los dispositivos individuales para nuevos platos de Petri seca. Vierta o pipeta agar caliente alrededor del dispositivo hasta que el agar es casi al ras con la parte superior del dispositivo PDMS. Permita que el agar solidifique.
Nota: Dispositivos ahora están listos para plantar semillas o pueden almacenarse a 4 ° C hasta que se necesite.
- Plantar semillas dentro de los dispositivos
- En un ambiente estéril, transferir una semilla esterilizada a la entrada de cada dispositivo con una pipeta pequeña.
- Cubierta de la caja Petri con cera (véase Tabla de materiales) de la película y colocar en una cámara de crecimiento ciclo luz/oscuridad o alféizar de la ventana a temperatura ambiente. Orientar la placa de Petri para que los dispositivos son verticales y gravedad animará las raíces para crecer a través del canal.
3. tratamiento
- Tratamientos experimentales
- En el tiempo deseado en el desarrollo de la plántula, añadir el tratamiento experimental a la plántula mediante la adición de una cantidad indicada del tratamiento a cada uno de los puertos 8 laterales a través de la pipeta.
- Volver a cerrar herméticamente la caja Petri y vuelve a cámara de crecimiento o alféizar de la ventana.
- Proceder con muestras de la proyección de imagen en el tiempo deseado para capturar puntos de tiempo individuales o comenzar imágenes de lapso de tiempo.
4. óptica imágenes
- Baja resolución (4-20 X) imagen
- Lugar la toda placa de Petri que contiene el dispositivo y la plántula bajo un microscopio de campo brillante invertida para campo brillante de baja resolución (4-20 X) o proyección de imagen de interferencia diferencial (DIC) de contraste. Optimizar las condiciones de iluminación para dilucidar las características morfológicas de interés mediante el ajuste de tiempos de exposición, brillo de la lámpara, diafragma y la polaridad de la luz. Conducir la etapa a la zona deseada de la raíz y el enfoque en la raíz o root hair(s) de interés.
- Adquirir un momento único o una serie de tiempo de imágenes. Para visualizar el crecimiento de los pelos radicales, la imagen cada vez más pelos de la raíz una vez por minuto. Para visualizar el crecimiento de la raíz principal, adquirir una imagen cada 30 minutos regreso la caja Petri y las plantas de semillero a cámara de crecimiento o alféizar de la ventana en posición vertical después de la proyección de imagen.
- Proyección de imagen de mayor resolución (20-63 X)
- Una vez que la plántula ha crecido en un tiempo deseado, utilizar pinzas para quitar el cubreobjetos y el dispositivo del agar. Limpie la parte inferior del cubreobjetos utilizando un laboratorio etanol humedecido.
- Aplicar los medios de comunicación de inmersión recomendada para el objetivo según lo sugerido por el fabricante de la lente del microscopio. Coloque el cubreobjetos sobre la platina del microscopio y levantar la etapa para comunicarse con los medios de inmersión en el objetivo. Optimizar las condiciones de iluminación mediante el ajuste de tiempos de exposición, brillo de la lámpara, diafragma y la polaridad de la luz. Conducir la etapa el área deseada y en root hair(s) de interés.
Nota: DIC es necesaria para visualizar la corriente citoplasmática, y marcadores de fluorescencia son necesarios para visualizar el movimiento de organelas. - Para cuantificar el crecimiento del pelo de raíz con el tiempo, adquirir una imagen por minuto. Para visualizar el movimiento de organelas, minimizar el tiempo de exposición de fluorescencia conservando una señal identificable de la fluorescencia de los organelos. Adquirir tan pronto como el tiempo de exposición permite imágenes de los organelos. Para más imágenes de lapso de tiempo, utilizar una incubadora de escenario imágenes de células vivas para mantener la humedad y la temperatura ambiente.
Nota: Se recomienda un objetivo de aceite X 63 para proyección de imagen de pelo de la raíz de organelos.
5. no-imágenes ópticas
- Preparación del dispositivo
- Una vez que la plántula ha crecido para el tiempo deseado,
- Depositar una delgada (~ 20 nanómetro) capa de cromo sobre la raíz y alrededor de PDMS con un arma de electrón viga evaporación bicamerales.
- Transferencia de la raíz y el dispositivo PDMS para una cámara de microscopio electrónico de barrido.
Nota: Condiciones, es decir, voltaje, corriente y trabajo a distancia de la proyección de imagen tendrá que ser optimizado para lograr la resolución deseada para una aplicación determinada.
- Monte lo PDMS dispositivo raíz para arriba en un sostenedor del espécimen de la AFM. Para aumentar el contraste en la cámara y más fácil distinguir la raíz de los PDMS, coloque el dispositivo PDMS sobre un sustrato plano reflectante (como la mica revestida en oro) antes de montar el dispositivo en el soporte de espécimen AFM.
- Asegurar un accesorio bien líquido sobre el dispositivo PDMS y llenarlo con agua para mantener las raíces hidratadas durante proyección de imagen.
- Cargue el soporte del espécimen en la AFM. Ajuste el control z para el grueso del dispositivo PDMS y conducir el voladizo a la región de interés en la raíz usando una cámara para la dirección.
- Alinear el láser con la punta del voladizo. Para obtener mejores resultados con la proyección de imagen modo de contacto, utilizar voladizos con constantes del resorte de 0.01 o 0.03 N/m para ejercer fuerza mínima en la raíz durante la exploración.
- Baje lentamente el mecanismo de exploración hasta el voladizo en contacto con la muestra. Ajustar el tamaño de exploración de la región deseada y elija una velocidad de exploración de 1 línea/s con 256 puntos de voltaje por línea. Adquirir la exploración.
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Representative Results
Los dispositivos de microfluidos PDMS dos capas descritos aquí tienen un canal alta de 200 μm en la principal raíz de Arabidopsis y una cámara alta de 20 μm a confinar lateralmente crecientes pelos de la raíz (figura 1A). Este diseño puede usarse para especies con diámetros de raíz similares como Arabidopsis thaliana y puede ser fácilmente modificado para alojar especies de diferentes tamaños. El diseño incorpora una entrada para la planta, así como 8 entradas de lado para cualquier tratamiento químico o biológico deseado. Prefilling los dispositivos con los medios de comunicación y verter agar alrededor del dispositivo mantiene el entorno root hidratado durante la duración del experimento sin necesidad de equipo neumático externo. (Figura 1B) El agar también estabiliza el dispositivo dentro de la caja Petri, permitiendo que las plantas de semillero cultivar verticalmente para promover el crecimiento de la raíz por el canal principal. La caja Petri mantiene las plántulas contenidas en un entorno de gnotobiótico y permite que el sistema de la raíz ser reflejada a través de la caja Petri para ampliaciones hasta 20 X. Otra opción sería sellar directamente el dispositivo PDMS para un fondo de cristal plato de Petri para más aumentos ópticos.
Thaliana de Arabidopsis las semillas pueden sembrarse directamente en la entrada de dispositivo que es perforada en un ángulo de 45 grados para facilitar el crecimiento de la raíz en el canal principal. (Figura 1) La altura del dispositivo PDMS no debe exceder de unos pocos milímetros, como las hojas deben ser capaces de crecer en la parte superior de la plataforma. Debido a su pequeño tamaño, las semillas de Arabidopis son muy difíciles de Oriente de modo que el ascenso radical raíz enfrenta el canal sobre la germinación. Por lo tanto, aproximadamente la mitad de las semillas plantadas germinarán con sus hojas en los canales y no se puede utilizar para los experimentos de visualización de raíz. Dispositivos de estas plantas de semillero pueden ser re-esterilizado y usado otra vez comenzando desde el paso 2.2. Para estimular crecimiento phototrophic de brotes de Arabidopsis thaliana , la cámara de visualización del dispositivo puede ser cubierta en papel de aluminio para bloquear la luz y mejorar la tasa de éxito. Las raíces de Arabidopsis thaliana han crecido constantemente en esta plataforma durante una semana, momento en el que crecimiento se convierte en dirigido hacia la formación de raíces laterales. (Figura 1) La tasa de crecimiento de las raíces en esta plataforma son comparables a las tasas de crecimiento de las raíces de Arabidopsis thaliana en otras plataformas microfluídicas. 13 el diseño de dos capas limita con éxito el vello de raíz en el mismo plano de proyección de imagen que la raíz principal. (Figura 1E) Sin embargo, algunos pelos de la raíz puede seguir creciendo en el canal principal fuera de foco óptico y diseños futuros deben procurar guiar gradualmente más pelos de la raíz en la cámara de pelo de la raíz.
Figura 1: Crecimiento de Arabidopsis thaliana en plataforma de microfluídica de dos capas. (A) dispositivo consta de dos capas para confinar los pelos de la raíz en el mismo plano de proyección de imagen que la raíz principal (escala de 1 mm). A. thaliana plántulas pueden ser (B) contenidos en un entorno de gnotobiótico, (C) germinado de semilla dentro del dispositivo, la escala de la barra = 400 μm, (D) y monitoreados para el crecimiento a lo largo de una semana (barras de error son de desviación estándar, SD) . (E) A representante raíz es reflejada en la plataforma, escala de la barra = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Dentro de la plataforma de microfluidos, pelos de la raíz se puede cuantificar a nivel celular en términos de su longitud, densidad y la angulosidad de su crecimiento de la raíz. (Figura 2A) Longitud del pelo de raíz y la densidad del tipo salvaje de a. thaliana plántulas cultivadas en nuestra plataforma están dentro del rango de las plantas de semillero crecido verticalmente en placas de agar. 14 el ángulo del crecimiento del vello de raíz es normalmente perpendicular a la superficie de la raíz. En nuestra plataforma, la angulosidad del crecimiento del pelo de la raíz hacia la punta puede ser un artefacto de la reclusión de los pelos de raíz a un plano de 2 dimensiones. Estímulo mecánico, en este caso por las paredes del dispositivo microfluídico, se ha demostrado para inducir cambios en el crecimiento de la raíz y orientación que puede explicar la discrepancia entre una plataforma de microfluidos confinados y una placa de agar abiertas. 15 es probable que este fenotipo es el resultado de un estrés nutritivo en nuestra plataforma como plántulas de a. thaliana utilizan alimento almacenado reservas de la semilla en los primeros días de crecimiento. Aunque la hipoxia puede ser un motivo de preocupación en los sistemas de raíz completamente saturados, la permeabilidad al oxígeno de PDMS ha demostrado previamente la biocompatibilidad de los polímeros con los tejidos dependientes de oxígeno. 16 , 17
Uno de las más fuertes ventajas plataformas microfluídicas agar placa es la habilidad de agregar uniformemente las concentraciones precisas de tratamientos químicos a los organismos. En plataformas de solo canal microfluídico, la adición de tratamientos potencialmente puede desplazar finos pelos de la raíz del enfoque óptico. Aquí demostramos el mantenimiento del foco óptico de pelo de la raíz en nuestra plataforma de microfluidos dos capas durante la adición de granos de la fluorescentes. En la figura 2B es reflejada una plántula (i) antes y (ii) después de la adición de granos del poliestireno carboxylated fluorescente (azules y rojos). La adición de este tratamiento abiótico no alterar la orientación o enfoque óptico de pelos de la raíz de la plántula.
Mayor ampliación imagen y fluorescentes marcadores se pueden utilizar para la imagen y cuantificar cambios en el nivel organelo en el desarrollo del pelo de la raíz (figura 2). Citoplasmática puede verse un cabello de la raíz de (i) imagen de contraste de interferencia diferencial y en otro pelo de la raíz de una planta de semillero que contienen un orgánulo triple marcador18, la trayectoria y distribución espacial de tres organelos Golgi ii) (mCherry), (iii) peroxisomas (PPC) y (iv) las mitocondrias (YFP) pueden verse en la proyección de máxima intensidad en cada panel respectivo. El movimiento de estos tres orgánulos es capturado en una parcela de distribución acumulativa en figura 2.
Figura 2: caracterización de la raíz de cabello y tratamiento. Pelos de la raíz se cuantificaron en un celular lEvel por longitud (A), la densidad y la angulosidad para n = 4 plántulas de tipo salvaje (WT) (barras de error son SD). Angularidad está determinada como el ángulo entre la punta de la raíz principal y pelos de punta con la punta de la raíz principal definida como la marca de 0°. (B) el enfoque óptico de los pelos de la raíz permanece sin cambios (i) antes y (ii) después de tratamiento con poliestireno granos fluorescentes (barra de escala = 100 μm). (C) organelo nivel cuantificación es demostrada por proyección de imagen la (i) citoplasmática de una imagen de contraste de interferencia diferencial y, en un pelo de la raíz separado, la fluorescencia de tres organelos: peroxisomas (iii) (ii) Golgi y (iv) las mitocondrias (barra de escala = 10 μm). Trayectorias de organelas fueron visualizados por la fusión de imágenes fluorescentes cada s 23-32 por 20 s. Los movimientos de los tres organelos fueron seguidos automáticamente y distribuciones acumulativas velocidad grafica a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El dispositivo PDMS presentado aquí ha no sido químicamente enlazado a un cubreobjetos de vidrio pero más bien forma un vínculo físico más débil que se establece durante la etapa de autoclavado. Esto permite al dispositivo ser desmontado después de completar el experimento de proyección de imagen óptico. El dispositivo PDMS puede pelado de la Copa, invertido y utilizado como un sustrato de mayor resolución no ópticos de proyección de imagen de la morfología de la raíz (Figura 3A). La plataforma mantiene convenientemente la raíz en su lugar durante el contacto con un voladizo en microscopía de fuerza atómica (figura 3B). Además, si se tiene cuidado durante el proceso de desmontaje, pelos de la raíz permanecerá en posición sobre el sustrato PDMS. Esto se demuestra desde la óptica de la imagen de la raíz antes de desarmar (figura 3) y después del desmontaje de la plataforma y la plántula en una capa de cromo conductor nm 20 obtener imágenes con un microscopio electrónico de barrido (figura 3D de la capa ). Para preservar aún más la plántula antes de deconstrucción de la plataforma, un fijador de aldehídos se puede inyectar en la plataforma para la reticulación las proteínas de tejido de la planta en su lugar.
Figura 3: dispositivo deconstrucción y la proyección de imagen óptica-no. (A) la plataforma de microfluidos pueden desmontar y utilizar como sustrato para los métodos de imagen no óptica alta resolución. (B) la topografía superficial (imagen de difracción) de una punta de raíz de Arabidopsis thaliana es reflejada mediante microscopía de fuerza atómica de modo de contacto, escala de la barra = 2 μm. La ubicación del voladizo en la raíz se indica con una flecha negra en el margen, escala de la barra = 100 μm. (C) de imagen óptico y micrografía electrónica análisis correspondiente (D) de la misma planta antes y después de que se desmonte el dispositivo. Las flechas enfatizan pelos radicales que permanecen inalterados, escala de la barra = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método descrito en este artículo para crear una plataforma de planta-en-un-chip es único en que las dos capas diseño confines los pelos de la raíz a un solo plano de proyección de imagen y la plataforma puede deconstruyen y utilizados como sustrato para la proyección de imagen de alta resolución no ópticos . Usando proyección de imagen no ópticos de alta resolución puede proporcionar información valiosa sobre el tejido de la planta que no se podía obtener de la proyección de imagen óptica sola. Por ejemplo, proyección de imagen de AFM puede proporcionar las medidas de fuerza para calcular la elasticidad de los tejidos de la raíz durante el desarrollo o después de un tratamiento químico o biológico específico. Asimismo, la proyección de imagen de SEM puede proporcionar datos de alta resolución de la topografía de la superficie de los tejidos de la raíz y, junto con la proyección de imagen química, puede proporcionar información sobre la composición elemental de los tejidos. 19 generaciones de futuro de esta plataforma de microfluidos incluye optimización para la compatibilidad con otros sistemas de proyección de imagen química como espectroscopia de desorción/ionización-masa de láser asistida por matriz (MALDI-MS) y Raman anti-Stokes coherente Espectroscopia (coches).
Pasos críticos en este método implican utilizando agar para asegurar el dispositivo y proporcionar hidratación a la planta sin la necesidad de flujo de fluidos complicados procedimientos. También se debe tener cuidado cuando desmontando el dispositivo PDMS del substrato de vidrio con el fin de mantener intacta la morfología de la raíz. Si el objetivo experimental es únicamente que baja a la imagen óptica de resolución media sin la necesidad de deconstrucción del aparato, el procedimiento puede modificar químicamente Bond el dispositivo al sustrato subyacente de vidrio usando plasma de oxígeno. Mayor resolución de imágenes ópticas pueden obtenerse sin extraer el producto de su ambiente gnotobiótico por vinculación químicamente el PDMS directamente en un vaso con fondo de plato de Petri y luego verter agar alrededor de los PDMS como se describió anteriormente.
El diseño de canales de lado de tratamiento 8 fue un intento de limitar los tratamientos a ciertas regiones de la raíz. Sin embargo, este diseño no tuvo éxito en la prevención de la difusión del tratamiento a otras áreas de la raíz debido a la conductancia de la zona abierta en el canal de la raíz principal. Con el fin de tratar localmente la raíz, la arquitectura del dispositivo será necesitan ser rediseñadas para limitar los tratamientos o el tratamiento tendrá que ser introducido a través de un medio viscoso a temporalmente lenta difusión en todo el dispositivo.
Si es deseable para los tratamientos experimentales agregarse vía flujo, modificaciones también se requiere para esta plataforma. Actualmente además del flujo a ninguna de las entradas de plataforma da como resultado la expulsión de la semilla de su entrada y dificultad en el control de la situación de los tratamientos fluídicos. Este método trabaja bien para las plantas de semillero hasta una semana de edad. Es limitado en cuánto tiempo las plantas de semillero pueden continuar creciendo en la plataforma, debido a la longitud del canal principal. Futuras modificaciones implicará alargar el canal principal y la incorporación de más 200 μm alta canales de raíces laterales manteniendo la cámara alta de 20 μm para el confinamiento de pelo de la raíz. Esta modificación requiere conocimiento sobre la situación esperada de aparición de raíces laterales con el fin de diseñar un dispositivo apropiado.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este manuscrito ha sido publicado por UT-Battelle, LLC bajo contrato no. DE-AC05-00OR22725 con el Departamento de energía de Estados Unidos. El gobierno de Estados Unidos retiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno de Estados Unidos mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, mundial para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito, o permitir que otros lo hagan, para los propósitos del gobierno de Estados Unidos. El Departamento de energía dará acceso público a estos resultados de la investigación patrocinada por el gobierno federal según el Plan de acceso público DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Este trabajo fue apoyado en parte por el programa de Ciencias Genómicas, Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, biológicas y la investigación ambiental, como parte de la planta de microbio Interfaces científicas área de enfoque (http://pmi.ornl.gov). La fabricación de las plataformas de microfluidos se llevó a cabo en el laboratorio de investigación de nanofabricación en el centro de Ciencias de materiales Nanophase, que es un DOE de ciencia usuario oficina. JAA es apoyado por una beca de investigación NSF DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
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