Summary
Este artigo demonstra como a cultura de plântulas de Arabidopsis thaliana em uma plataforma de dois-camada microfluidic que restringe a raiz principal e cabelos de raiz para um único plano ótico. Esta plataforma pode ser usada para a imagem latente de óptica em tempo real da morfologia da raiz bem bem como quanto à geração de imagens de alta resolução por outros meios.
Abstract
Pelos radiculares aumentam a área de superfície de raiz para melhor absorção de água e absorção de nutrientes pela planta. Porque eles são pequenos em tamanho e muitas vezes obscurecido pelo seu ambiente natural, função e morfologia da raiz do cabelo são difíceis de estudar e muitas vezes excluídos da pesquisa da planta. Nos últimos anos, plataformas microfluidic tem oferecido uma maneira de visualizar os sistemas de raiz em alta resolução sem perturbar as raízes durante a transferência de um sistema de imagem. A plataforma microfluidic aqui apresentados compilações em pesquisas anteriores de planta-em-um-microplaqueta ao incorporar um dispositivo de duas camadas para confinar a raiz principal de Arabidopsis thaliana ao mesmo plano óptico como os pelos da raiz. Este projeto permite a quantificação dos cabelos de raiz em um celular e organela nível e também impede o eixo z à deriva durante a adição de tratamentos experimentais. Descrevemos como armazenar os dispositivos em um ambiente contido e hidratado, sem a necessidade de bombas fluídico, mantendo um ambiente de gnotobiotic para o seedling. Após a experiência de imagem óptica, o dispositivo pode ser desmontado e usado como um substrato para a força atômica ou microscópio eletrônico de varredura, mantendo estruturas bem raiz intacta.
Introduction
Características de bem de raiz aumentar água e aquisição de nutrientes para a planta, explorando novos espaços do solo e aumentar a área da superfície total da raiz. O volume de negócios desses recursos raiz bem desempenha um papel importante em estimular o metro cadeia alimentar1 e o número de raizes finas em determinadas espécies de plantas é esperado dobrar sob elevado de dióxido de carbono atmosférico2. Raizes finas são geralmente definidos como aqueles menores que 2 mm de diâmetro, embora novas definições defendem caracterizando raizes finas por sua função3. Como muitas raizes finas, cabelos de raiz fornecem a função de captação e absorção, mas ocupam um espaço muito menor com diâmetros da ordem de micra. Por causa de seu tamanho pequeno, pelos radiculares são difíceis de imagem em situ e são negligenciados frequentemente como parte da arquitetura geral da raiz em experimentos de campo escala e modelos.
Ex terra raiz cabelo estuda, tal a partir de mudas cultivadas em placas de ágar, forneceram a comunidade científica com informações valiosas sobre o crescimento celular e transporte4,5. Enquanto as placas de ágar permitem sistemas de raiz ser fotografada não-destrutiva e em tempo real, eles não oferecem alta controle ambiental para a adição de tratamentos experimentais como nutrientes, hormonas vegetais ou bactérias. Uma emergente solução para facilitar a alta resolução de imagem, enquanto também proporcionar controle ambiental dinâmico foi o advento das plataformas microfluidic para estudos de planta. Essas plataformas permitiram o crescimento não-destrutivos e visualização de várias espécies de plantas para alto throughput fenotipagem6,7,8,9, tratamentos químicos isolados 10, medições de força11,12e a adição de microorganismos13. Projetos de plataforma microfluidic centraram-se na utilização de camadas fluídico único espaço aberto, no qual as raízes podem propagar, permitindo que os cabelos de raiz à deriva dentro e fora de foco óptico durante o crescimento ou tratamento.
Aqui nós apresentamos um procedimento para o desenvolvimento de uma plataforma de dois-camada microfluidic usando métodos de macio-litografia e foto que baseia-se projetos de planta-em-um-microplaqueta anteriores por confinar os cabelos de raiz de mudas para o mesmo plano de imagem como a raiz principal. Isso nos permite acompanhar o desenvolvimento da raiz do cabelo em tempo real, em alta resolução e durante todo o processo de tratamento experimental. Nossos métodos de cultivo permitem Arabidopsis thaliana mudas a ser germinadas da semente dentro da plataforma e cultivadas por até uma semana em um ambiente estéril e hidratada que não requer o uso de equipamento de bomba de seringa. Uma vez que o lapso de tempo de imagem experimento concluiu, a plataforma apresentada aqui pode ser aberta sem perturbar a posição dos recursos raiz mais finas. Isto permite o uso de outros métodos de imagem de alta resolução. Aqui nós fornecemos resultados representativos para a quantificação e a visualização da morfologia da raiz do cabelo nesta plataforma por microscopia óptica, varredura (SEM) e de força atômica (AFM) de técnicas de microscopia.
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Protocol
1. dois-camada fabricação de plataforma
- Fabricação dos mestres multicamadas
- Rotação casaco fotorresiste negativa baseada em epóxi (~63.45% sólidos, 1.250 cSt) de acordo com as especificações do fabricante (2.000 rpm para 45 s) em uma bolacha de silicone de diâmetro de 4 polegadas para obter a altura desejada de 20 µm para a primeira camada de desenho.
- Macio-cozer as bolachas resist revestido por 4 min a 95 ° C. Permitir a bolacha esfriar por 5 min. expor o wafer de UV, luz para 15 s (~ 150 mJ/cm2 a 365 nm) através de uma Fotomáscara em um UV contatar alinhador para definir a geometria da camada inferior.
- Pós-exposição asse a hóstia durante 5 min à 95 ° C. Sem desenvolver, retornar a bolacha para o aplicador girar e girar em uma segunda camada de fotorresiste negativa baseada em epóxi (~76.75% sólidos, 80.000 cSt) a 3.000 rpm para atingir uma segunda altura de camada de 150-200 µm.
- Permita o wafer de descansar por 5 min antes de transferir para uma placa de 95 ° C por 45 min. Após o cozimento na placa de aquecimento, retirar a bolacha e deixar a resistir esfriar e endurecer em temperatura ambiente por mais 5 minutos em uma superfície plana e nivelada. Alinhar e expor a hóstia para a segunda camada Fotomáscara para 30 s em um alinhador de contato UV (dose de aproximadamente 300 mJ/cm2).
- Executar um Asse pós-exposição ao colocar a bolacha sobre uma placa quente por 15 min a 95 ° C e em seguida, permitir que a bolacha esfriar sobre uma superfície plana e nivelada por 5 min antes de desenvolver.
- Desenvolver as duas camadas de resistir simultaneamente colocando a bolacha em um prato de plástico e submergindo a bolacha no desenvolvedor apropriado (consulte a Tabela de materiais). Agitar suavemente o prato ocasionalmente para lavar desenvolvedor fresco sobre a bolacha.
- Depois de 17 min, enxague a bolacha com isopropanol (IPA). Se aparece um filme branco, continue a iterar entre enxaguar a bolacha com o desenvolvedor e IPA até o filme desaparece. Seque o wafer de silício estampados com nitrogênio.
- Polydimethylsiloxane Soft-litografia
- Expor o wafer de silício de um plasma de ar por 30 s em um plasma líquido de limpeza definido em alta (veja a tabela de materiais) para limpar. Silanize a bolacha com silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octil) em uma capa de química em uma placa de aquecimento abaixo do ponto de inflamação do silano (85 ° C) por 2 h.
- Despeje uma proporção de 10:1 do polydimethylsiloxane (PDMS) para agente de cura para o wafer de silício mestre. Desgaseificar o PDMS misturadas em uma câmara de vácuo e depois curar o polímero em um forno de 70 ° C por 1 h ou até o PDMS é totalmente curado.
- Usando um bisturi, corte os dispositivos PDMS e descascá-los a partir da pastilha de silício mestre. Use um soco de biópsia de 1,5 mm para criar entradas de semente e tratamento, a entrada da semente em um ângulo de 45° para incentivar o crescimento de raiz para o canal principal de perfuração.
- Use fita adesiva transparente para remover restos do dispositivo PDMS e coloque o dispositivo do projeto para baixo sobre uma lamela de vidro. Autoclave os dispositivos montados.
2. dispositivos de plantação
- Preparação de semente de Arabidopsis thaliana
- Superfície de esterilizar a. thaliana sementes em um tubo de microcentrífuga com uma solução de 30% disponível comercialmente lixívia diluída em detergente de Triton X água e 0,1% desionisado para sementes de lavagem de 7 min. 4 vezes com água estéril.
- Estratificar sementes por tubo de microcentrífuga de refrigeração durante a noite ou até uma semana a 4 ° C.
- Preparação do dispositivo
- Coloque dispositivos esterilizados em um vácuo de desgaseificação câmara para remover o ar do gás permeável PDMS e fluídico canais para melhorar a facilidade de enchimento.
- Remover os dispositivos da câmara de vácuo e mergulhe imediatamente os dispositivos em uma placa de Petri preenchida com media baseada em vegetais líquidos força ¼ em pH 5,7.
- Utilizando uma pipeta, puxe o líquido através das entradas de para preencher o dispositivo. Certifique-se que não há bolhas de ar permanecem dentro de canais por inspeção visual.
- Transferência de dispositivos individuais para novos pratos de Petri seco. Despeje ou pipeta ágar quente em torno do dispositivo até que o nível de ágar-ágar é quase alinhado com a parte superior do dispositivo PDMS. Permitir que agar para solidificar.
Nota: Os dispositivos agora estão prontos para o plantio de sementes ou podem ser armazenados a 4 ° C, até que seja necessário.
- Plantar sementes dentro de dispositivos
- Em um ambiente estéril, transferi uma semente esterilizada para a entrada de cada dispositivo usando uma pipeta pequena.
- Tampa da placa de Petri com cera filme (veja a Tabela de materiais) e coloque em uma câmara de crescimento ciclismo claro/escuro ou parapeito à temperatura ambiente. Oriente o prato de Petri de modo que os dispositivos são verticais e gravidade incentivará as raízes a crescer através do canal.
3. tratamento
- Tratamentos experimentais
- Ao tempo desejado no desenvolvimento do seedling, adicione o tratamento experimental para o seedling, adicionando uma quantidade prescrita do tratamento para cada uma das portas 8 lado através de uma pipeta.
- Reseal o prato de Petri e retornar para a câmara de crescimento ou peitoril da janela.
- Prossiga com as amostras de imagem no momento desejado para capturar pontos de tempo individuais ou começar a imagem latente de lapso de tempo.
4. optical Imaging
- Baixa resolução (4-20 X)
- Coloque o prato de Petri inteiro que contém o dispositivo e mudas sob um microscópio de campo claro invertido para campo claro de baixa resolução (4-20 X) ou imagens de interferência diferencial (DIC) de contraste. Otimize as condições de iluminação para elucidar características morfológicas de interesse, ajustando o brilho da lâmpada, tempos de exposição, abertura e a polaridade da luz. Dirigir o estágio para a área desejada da raiz e foco na raiz ou root hair(s) de interesse.
- Adquira um ponto de tempo único ou uma série temporal de imagens. Para visualizar o crescimento de pelos radiculares, imagem crescentes cabelos de raiz uma vez por min. Para visualizar o crescimento da raiz principal, adquira uma imagem cada 30 min. retorno de Petri e as mudas para câmara de crescimento ou janela na posição vertical após a conclusão da imagem latente.
- Imagens de maior resolução (20-63 X)
- Uma vez que o seedling cresceu para um momento desejado, use pinça para remover lamela e dispositivo de agar. Limpa o fundo da lamela usando um tecido de laboratório de etanol humedecido.
- Aplica os meios de comunicação de imersão recomendado para o objectivo, tal como sugerido pelo fabricante de lente do microscópio. Colocar a lamela para baixo no palco microscópio e levantar o estágio para entrar em contato com a mídia de imersão no objectivo. Otimize as condições de iluminação, ajustando o brilho da lâmpada, tempos de exposição, abertura e a polaridade da luz. Dirigir o estágio para a área desejada e foco na root hair(s) de interesse.
Nota: O DIC é necessário para visualizar a ciclose e marcadores de fluorescência são necessários para visualizar o movimento das organelas. - Para quantificar o crescimento da raiz do cabelo ao longo do tempo, adquira uma imagem por min. Para visualizar o movimento das organelas, minimize o tempo de exposição de fluorescência, mantendo ainda um sinal de fluorescência identificáveis das organelas. Adquira imagens das organelas mais rápido que permite que o tempo de exposição. Para mais imagens de lapso de tempo, use uma incubadora de palco viver-pilha de imagem para manter a umidade e a temperatura ambiente.
Nota: Um objectivo de óleo X 63 é recomendado para imagiologia organelas da raiz do cabelo.
5. não-ópticos Imaging
- Preparação do dispositivo
- Uma vez que mudas tem crescido para o tempo desejado,
- Depositar uma fina (~ 20 nm) camada de cromo para a raiz e em torno de PDMS utilizando uma câmara de evaporação feixe de elétron Dual arma.
- Transferi a raiz e o dispositivo PDMS para uma câmara de microscópio eletrônico de varredura.
Nota: Imagem condições, ou seja, tensão, distância atual e trabalho precisará ser otimizados para atingir a resolução desejada para um determinado aplicativo.
- Monte o lado de raiz do dispositivo PDMS em um suporte de amostra AFM. Para aumentar o contraste na câmera e mais facilmente distinguir a raiz o PDMS, coloque o dispositivo PDMS em um substrato plano reflexivo (tais como a mica revestida em ouro) antes de montar o dispositivo no suporte de amostra AFM.
- Fixar um acessório bem líquido sobre o dispositivo do PDMS e preenchê-lo com água para manter as raízes hidratadas durante a imagem latente.
- Carrega o suporte de amostra para o AFM. Ajustar o controle de z para a espessura do dispositivo PDMS e dirigir o cantilever para a região de interesse na raiz usando uma câmera para orientação.
- Ajustar o laser com a ponta do cantilever. Para obter melhores resultados com imagens de modo de contato, use cantilevers com constantes de mola de 0,03 ou 0,01 N/m para exercer força mínima na raiz durante a verificação.
- Abaixe lentamente o mecanismo de varredura até o cantilever só faz contato com a amostra. Ajustar o tamanho de varredura para a região desejada e escolha uma velocidade de varredura de 1 linha/s com 256 pontos de tensão por linha. Adquira o scan.
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Representative Results
Os dispositivos de microfluidic PDMS da dois-camada aqui descritos têm um canal de alta de 200 µm para a raiz principal de Arabidopsis e uma câmara alta de 20 µm para confinar lateralmente crescentes pelos radiculares (figura 1A). Este projeto pode ser utilizado para espécies de plantas com diâmetros de raiz semelhante como Arabidopsis thaliana e pode ser facilmente modificado para acomodar a espécie de diferentes tamanhos. O design incorpora uma entrada para a planta, bem como 8 entradas de lado para qualquer tratamento químico ou biológico desejado. Prefilling os dispositivos com mídia e derramando o ágar-ágar em torno o dispositivo mantém o ambiente de raiz hidratado para a duração da experiência sem a necessidade de equipamentos externos fluídico. (Figura 1B) O ágar também estabiliza o dispositivo dentro do prato de Petri, permitindo que as mudas ser crescido verticalmente para incentivar o crescimento da raiz para baixo o canal principal. O prato de Petri mantém as mudas contidas em um ambiente gnotobiotic e permite que o sistema de raiz ser fotografada através de Petri para ampliações até 20 X. Outra opção seria selar diretamente o dispositivo PDMS para um placa de Petri de vidro-fundo para mesmo ampliações ópticas.
Arabidopsis thaliana sementes podem ser plantadas diretamente na entrada de dispositivo que é um soco em um ângulo de 45 graus para facilitar o crescimento de raiz para o canal principal. (Figura 1) A altura do dispositivo PDMS não deve exceder alguns milímetros, como as folhas devem ser capazes de crescer fora do topo da plataforma. Por causa de seu tamanho pequeno, Arabidopis sementes são muito difíceis de Oriente de modo que o radical de raiz emergente enfrenta o canal após a germinação. Portanto, aproximadamente metade das sementes plantadas germinarão com suas folhas, os canais e não pode ser usado para experiências de visualização de raiz. Dispositivos destas mudas podem ser re-esterilizado e utilizado novamente a partir da etapa 2.2. Para incentivar o crescimento fototróficas dos rebentos de Arabidopsis thaliana , câmara do dispositivo de visualização pode ser coberta em papel alumínio, para bloquear a luz e melhorar a taxa de sucesso. Arabidopsis thaliana raízes têm crescido constantemente nesta plataforma durante uma semana, em que ponto crescimento torna-se voltada para a formação de raiz lateral. (Figura 1) A taxa de crescimento das raízes nesta plataforma são comparáveis às taxas de crescimento das raízes de Arabidopsis thaliana em outras plataformas microfluidic. 13 o design de duas camadas com êxito restringe os cabelos de raiz para o mesmo plano de imagem como a raiz principal. (Figura 1E) No entanto, alguns cabelos de raiz pode continuar a crescer no canal principal fora de foco óptico e projetos futuros devem procurar orientar gradualmente mais pelos radiculares na câmara da raiz do cabelo.
Figura 1: Crescimento de Arabidopsis thaliana no dois-camada Microfluidic plataforma. (A) dispositivo consiste de duas camadas de confinar os cabelos de raiz para o mesmo plano de imagem como a raiz principal (escala de 1 mm). A. thaliana mudas podem ser (B) contido em um ambiente de gnotobiotic, (C) germinado da semente dentro do dispositivo, escala bar = 400 µm, (D) e monitorados para crescimento ao longo de uma semana (barras de erro são desvio padrão, SD) . (E) A raiz representativa é fotografada na plataforma, escala bar = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Dentro da plataforma microfluidic, cabelos de raiz pode ser quantificados em um nível celular em termos de seu comprimento, densidade e a angularidade do seu crescimento da raiz. (Figura 2A) Comprimento da raiz do cabelo e a densidade da . thaliana selvagem tipo mudas cultivadas em nossa plataforma estão dentro do alcance de mudas cultivadas verticalmente em placas de ágar. 14 o ângulo do crescimento da raiz do cabelo é geralmente perpendicular à superfície da raiz. Em nossa plataforma, a angularidade do crescimento da raiz do cabelo em direção a ponta pode ser um artefato do confinamento dos pelos raiz para um avião 2-dimensional. Estimulação mecânica, neste caso pelas paredes do dispositivo microfluidic, foi mostrada para provocar alterações no crescimento da raiz e da orientação que pode explicar a discrepância entre uma plataforma microfluidic confinados e uma placa de ágar aberto. 15 ... é improvável que este fenótipo é o resultado de um nutriente estresse em nossa plataforma, como mudas da . thaliana utilizam alimentos armazenados reservas da semente nos primeiros dias de crescimento. Apesar de hipóxia pode ser uma preocupação em sistemas totalmente saturadas de raiz, a permeabilidade do oxigênio de PDMS anteriormente demonstrou a biocompatibilidade do polímero com tecidos dependentes de oxigênio. 16 , 17
Uma das vantagens mais fortes das plataformas microfluidic sobre métodos de placa de ágar-ágar é a capacidade de adicionar uniformemente concentrações precisas de tratamentos químicos para os organismos. Em plataformas de microfluidic único canal, a adição de tratamentos potencialmente pode deslocar pelos finos da raiz do foco óptico. Aqui vamos demonstrar a manutenção da raiz do cabelo foco óptico em nossa plataforma microfluidic da dois-camada durante a adição de grânulos fluorescentes. Na Figura 2B , um seedling é fotografado (i) antes e (ii) após a adição dos grânulos de poliestireno carboxilada fluorescente (azuis e vermelhos). A adição deste tratamento abióticos não perturbem a orientação ou o foco ótico de cabelos de raiz do seedling.
Maiores ampliação da imagem latente e fluorescentes marcadores podem ser usados para a imagem e quantificar as alterações de nível de organela em desenvolvimento de pelos radiculares (Figura 2). A ciclose pode ser vista em um cabelo de raiz de (i) imagem de contraste de interferência diferencial e, em outra raiz do cabelo de um seedling contendo uma organela triplo marcador18, a trajetória e a distribuição espacial de três organelas Golgi ii) (mCherry), (iii) peroxissomos (PCP) e (iv) as mitocôndrias (YFP) podem ser visto desde a projeção de intensidade máxima em cada respectivo painel. O movimento destas três organelas é capturado em um terreno de distribuição cumulativa em Figura 2.
Figura 2: caracterização da raiz do cabelo e tratamento. Pelos radiculares foram quantificados em um celular lEvel pelo (A) comprimento, densidade e angularidade para n = 4 mudas de tipo selvagem (WT) (barras de erro são SD). Angularidade é determinada como o ângulo entre a ponta da raiz principal e a ponta da raiz do cabelo com a ponta de raiz principal, definida como a marca de 0°. (B) o foco ótico dos pelos raiz permanece inalterado (i) antes e (ii) após tratá-los com esferas de poliestireno fluorescentes (barra de escala = 100 µm). (C) organela nível quantificação é demonstrada pela imagem a (i) a ciclose de uma imagem de contraste de interferência diferencial e, em um cabelo de raiz separado, a fluorescência de três organelas: Peroxissomos de Golgi (ii) (iii) e (iv) mitocôndrias (barra de escala = 10 µm). Trajetórias das organelas foram visualizadas mesclando fluorescentes imagens tiradas cada s 23-32 por 20 s. Os movimentos das três organelas foram rastreados automaticamente e distribuições cumulativas velocidade plotagem no lado direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O dispositivo PDMS apresentado aqui tem não sido quimicamente ligado a uma lamela de vidro, mas prefiro, forma uma ligação física mais fraca que é estabelecida durante a etapa de esterilização em autoclave. Isso permite que o dispositivo a ser desmontado após o experimento óptico de imagem completo. O dispositivo PDMS pode ser descascado do vidro, invertido e usado como substrato para a maior resolução não-ópticos imagem latente da morfologia da raiz (Figura 3A). A plataforma segura convenientemente a raiz no lugar durante o contato com um cantilever durante a microscopia de força atômica (Figura 3B). Além disso, se é tomado durante o processo de desmontagem, pelos radiculares permanecerá em posição sobre o substrato PDMS. Isso é demonstrado na imagem óptica da raiz antes da desmontagem (Figura 3) e após a desmontagem da plataforma e revestindo as mudas em uma camada de crómio condutora 20 nm para a imagem latente com um microscópio eletrônico de varredura (Figura 3D ). Para preservar ainda mais o seedling antes Desconstruindo a plataforma, um fixador de aldeído-baseado pode ser injetado na plataforma de ligação cruzada das proteínas do tecido de planta no lugar.
Figura 3: dispositivo de desconstrução e não-ópticos Imaging. (A), a plataforma microfluidic pode ser desmontado e usado como um substrato para métodos de imagem não-ópticos de alta resolução. (B), a topografia da superfície (imagem de difração) de uma ponta de raiz de Arabidopsis thaliana é fotografada usando microscopia de força atômica modo contato, escala bar = 2 µm. A localização do cantilever na raiz é indicada por uma seta preta no baixo-relevo, escala barra = 100 µm. (C) imagem óptica e (D) correspondente varredura micrografia eletrônica do seedling mesmo antes e depois de dispositivo é desmontado. Setas enfatizam cabelos de raiz que permaneça intacta, escala barra = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método descrito neste artigo para a criação de uma plataforma de planta-em-um-microplaqueta é o único que da dois-camada design limites os cabelos de raiz para um único plano de imagem e a plataforma pode ser desconstruídos e usados como um substrato para a imagem latente não-ópticos de alta resolução . Usando a imagem latente não-ópticos de alta resolução pode fornecer informações valiosas sobre o tecido de planta que não pode ser obtido da optical imaging em paz. Por exemplo, imagens de AFM podem fornecer medidas de força para calcular a elasticidade dos tecidos da raiz durante o desenvolvimento, ou após um tratamento químico ou biológico específico. Da mesma forma, SEM imagem pode fornecer detalhes de alta resolução da topografia da superfície do tecido raiz e, quando combinada com imagens de química, pode fornecer informações sobre a composição elementar dos tecidos. 19 as gerações do futuro desta plataforma microfluidic incluirá otimização para compatibilidade com outros sistemas de imagem químicos tais como espectroscopia de dessorção de ionização-massa de laser assistida por matriz (MALDI-MS) e coerente anti-Stokes Raman espectroscopia (carros).
Passos críticos neste método envolvem o uso de ágar para fixar o dispositivo e proporcionar hidratação à planta sem a necessidade de procedimentos complicados fluxo de fluido. Deve também ter cuidado ao desconstruir o PDMS dispositivo a partir do substrato de vidro a fim de manter intacta a morfologia da raiz. Se o objetivo experimental é unicamente para baixo a imagem latente ótica de média resolução sem a necessidade de desconstrução do dispositivo, o procedimento pode ser modificado quimicamente Bond o dispositivo ao substrato de vidro subjacente usando o plasma de oxigênio. Maior resolução ópticas imagens podem ser obtidas sem retirar o dispositivo do seu ambiente de gnotobiotic lig quimicamente o PDMS directamente para um copo com fundo de Petri e em seguida despejando agar em torno do PDMS conforme descrito anteriormente.
O desenho de 8 canais de lado de tratamento foi uma tentativa de limitar tratamentos para certas regiões da raiz. No entanto, este projeto teve sucesso em impedir a difusão do tratamento para outras áreas da raiz devido a condutância de área aberta, no canal da raiz principal. A fim de tratar localmente a raiz, a arquitetura do dispositivo irá precisa ser redesenhado para limitar tratamentos ou o tratamento precisa ser introduzido através de uma mídia viscosa para temporariamente lenta difusão em todo o dispositivo.
Se é desejável para tratamentos experimentais ser adicionado através do fluxo, as modificações também será necessárias para esta plataforma. Atualmente a adição de fluxo para qualquer uma das entradas da plataforma resulta na expulsão da semente de sua entrada e a dificuldade em controlar a localização dos tratamentos fluídico. Este método funciona bem para mudas até uma semana de idade. É limitada em quanto tempo mudas podem continuar a crescer na plataforma, por causa do comprimento do canal principal. Modificações futuras envolverá alongando o canal principal e incorporando mais 200 µm alta canais de raízes laterais, mantendo a câmara alta 20 µm para confinamento de raiz do cabelo. Esta modificação exigirá conhecimento sobre o local antecipado do surgimento de raiz lateral para projetar um dispositivo apropriado.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este manuscrito foi criado pela UT-Battelle, LLC sob contrato n º DE-AC05-00OR22725 com o departamento de energia dos EUA. O governo dos Estados Unidos mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos Estados Unidos mantém uma licença não-exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado de Este manuscrito, ou permitir que outros o façam, para fins de governo dos Estados Unidos. O departamento de energia irá fornecer o acesso do público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Este trabalho foi financiado em parte pelo programa de ciência genômica, departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, biológico e investigação ambiental, como parte da planta micróbio Interfaces foco área científica (http://pmi.ornl.gov). A fabricação das plataformas microfluidic foi realizada no laboratório de pesquisa de nanofabricação no centro para Nanophase Ciências dos materiais, que é uma facilidade do DOE escritório de ciência usuário. JAA é apoiada por uma bolsa de pós-graduação pesquisa de NSF DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
