Summary
Denne artikel viser, hvordan du kultur Arabidopsis thaliana stiklinger i en to-lags mikrofluid platform, der begrænser de vigtigste rod og rodtråde til et enkelt optisk fly. Denne platform kan bruges til real-time optiske billeddannelse af fine root morfologi såvel som for høj opløsning imaging med andre midler.
Abstract
Rodtråde øge root areal for bedre vand optagelse og næringsstof absorption af anlægget. Fordi de er små i størrelse og ofte skjules af deres naturlige miljø, er rod hår morfologi og funktion svær at studere og ofte udelukket fra planteforskning. I de seneste år, har mikrofluid platforme tilbudt en måde at visualisere rodsystemer med høj opløsning uden at forstyrre rødderne under overførsel til et billedbehandlingssystem. Mikrofluid platform præsenteres her bygger på tidligere plante-on-a-chip forskning ved at indarbejde en to-lags enhed for at begrænse Arabidopsis thaliana hovedrod af samme optiske flyet som root hår. Dette design giver mulighed for kvantificering af rodtråde på en cellulær og organelle plan og også forhindrer z-aksen drivende under tilsætning af eksperimentelle behandlinger. Vi beskriver, hvordan du gemmer enhederne i et indesluttet og hydreret miljø, uden behov for fluidic pumper, samtidig opretholde en kimfri miljø for sætteplante. Efter den optiske billeddannelse eksperiment, kan enheden afmonteret og bruges som substrat for atomic force eller scanning elektronmikroskopi samtidig med fine root strukturer intakt.
Introduction
Fine rod funktioner øger vand og næringsstoffer anskaffelse for anlægget, udforske nye jord rum og øge den samlede rod overflade areal. Omsætningen af disse fine rod funktioner spiller en stor rolle i at stimulere den underjordiske fødevarekæden1 og antallet af fine rødder i visse plantearter er forventede fordobling under forhøjet atmosfærisk kuldioxid2. Fine rødder er generelt defineret som dem, mindre end 2 mm i diameter, selv om nye definitioner fortaler for kendetegner fine rødder af deres funktion3. Ligesom mange fine rødder, rodtråde give funktion af udbredelse og absorption men indtager et meget mindre rum med diametre på rækkefølgen mikron. På grund af deres lille størrelse, rodtråde er vanskelige at billedet i situ og ofte overses som en del af den overordnede rod arkitektur i feltet skala eksperimenter og modeller.
Ex terra rod hår undersøgelser, sådan fra planter dyrket på agar plader, har givet det videnskabelige samfund med værdifulde oplysninger om cellulære vækst og transport4,5. Mens agar plader tillade rodsystemer at være afbildet i ikke-destruktivt og i realtid, tilbyder de ikke høj miljøkontrol for tilsætning af eksperimentelle behandlinger som næringsstoffer, plantehormoner eller bakterier. En spirende løsning til at lette høj opløsning imaging samtidig også giver dynamisk miljøkontrol har været fremkomsten af mikrofluid platforme for anlægget undersøgelser. Disse platforme har aktiveret, ikke-destruktiv vækst og visualisering af flere plantearter for høj overførselshastighed fænotyper6,7,8,9, isolerede kemiske behandlinger 10, force målinger11,12, og tilsætning af mikroorganismer13. Mikrofluid platform designs har fokuseret på brugen af fælles friarealer fluidic lag hvor rødderne kan udbrede, tillader rodtråde til at glide ind og ud af optisk fokus under vækst eller behandling.
Her præsenterer vi en procedure for at udvikle en to-lags mikrofluid platform ved hjælp af foto og soft-litografi metoder, der bygger på tidligere plante-on-a-chip design ved at begrænse sætteplante rodtråde til samme tænkelig plan som de vigtigste rod. Dette gør det muligt for os at spore rod hår udvikling i realtid, med høj opløsning, og hele den eksperimentelle behandlingsproces. Vores dyrkningsbaserede metoder tillade Arabidopsis thaliana frøplanter at være spiret fra frø inden for platformen og kulturperler for op til en uge i en hydreret og sterile miljø, der ikke kræver brug af sprøjten pumpe udstyr. Når den time-lapse imaging eksperiment har indgået, kan platformen præsenteres her åbnes uden at forstyrre de finere root funktionernes position. Dette tillader brug af andre høj opløsning Billeddannende metoder. Her give vi repræsentative resultater for kvantificering og visualisering af rod hår morfologi i denne platform af optiske, scanning elektronmikroskopi (SEM), og atomic force mikroskopi-teknikker (AFM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. to-lags Platform fabrikation
- Fabrikation af flerlaget masters
- Spin pels epoxy-baserede negative photoresist (~63.45% legemer, 1.250 cSt) ifølge producentens specifikationer (2,000 rpm for 45 s) på en 4 tommer diameter silicium wafer at opnå den ønskede højde på 20 µm for det første design lag.
- Soft-bage modstå belagt vafler i 4 min. ved 95 ° C. Tillad wafer køle for 5 min. udsætte wafer for UV-lys for 15 s (~ 150 mJ/cm2 på 365 nm) gennem en photomask i en UV kontakt aligner definerer geometrien af det nederste lag.
- Efter eksponering bage wafer i 5 min. ved 95 ° C. Uden at udvikle, returnere wafer at spin coater og spin på et andet lag af epoxy-baserede negative photoresist (~76.75% legemer, 80.000 cSt) ved 3000 rpm for at opnå et andet lag højde af 150-200 µm.
- Tillad wafer hvile i 5 min før du overfører til 95 ° C kogeplade i 45 min. Efter bagning på en kogeplade, fjerne wafer og tillade modstå afkøles og hærde ved stuetemperatur i en anden 5 minutter på et fladt plan overflade. Juster og udsætte wafer til det andet lag photomask til 30 s i en UV kontakt aligner (dosis omkring 300 mJ/cm2).
- Udføre en efterfølgende Bages ved at placere wafer på en kogeplade i 15 min. ved 95 ° C, og lad derefter wafer til afkøling på et fladt plan overflade i 5 min før du udvikler.
- Udvikle både modstå lag samtidig ved at placere wafer i en plastik skål og nedsænkning wafer i passende udvikleren (Se Materialer tabel). Forsigtigt rock parabol lejlighedsvis at vaske nylavet udvikler over wafer.
- Efter 17 min., skyl wafer med isopropanol (IPA). Hvis en hvid film vises, fortsætte med at gentage mellem skylle wafer med forfatter og IPA, indtil filmen forsvinder. Tør den mønstrede silicium wafer med kvælstof.
- Polydimethylsiloxan Soft-litografi
- Udsætte silicium wafer til en luft plasma til 30 s i en renere plasma sæt på høj (Se materialer tabel) til at rense. Silanize wafer med trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octyl) silan i en kemisk hætte på en kogeplade under flammepunkt på silan (85 ° C) i 2 timer.
- Hæld forholdet 10:1 af Polydimethylsiloxan (PDMS) til hærdning agent på silicium master wafer. Degas den blandede PDMS i en vakuumkammer og derefter helbrede polymer i en 70 ºC ovn i 1 time eller indtil PDMS er fuldt hærdet.
- Ved hjælp af en skalpel skæres PDMS enheder og skræl dem fra silicon master wafer. Brug et 1,5 mm biopsi punch til at oprette frø og behandling fjorde, stansning frø indløb i en 45° vinkel at tilskynde rodvækst i den vigtigste kanal.
- Brug klar selvklæbende tape til at fjerne snavs fra PDMS enheden og placere enhed designsiden ned på et glas coverslip. Autoklave de forsamlede enheder.
2. plantning enheder
- Arabidopsis thaliana frø forberedelse
- Overfladen sterilisere A. thaliana frø i et mikrofuge rør med en opløsning af 30% kommercielt tilgængelige blegemiddel fortyndet i afioniseret vand og 0,1% Triton X vaskemiddel til 7 min. vask frøene 4 gange med sterilt vand.
- Stratificere frø af køleapparater mikrofuge tube natten over eller op til en uge ved 4 ° C.
- Enheden forberedelse
- Placer steriliseret enheder i et vakuum, afgasning kammer for at fjerne luft fra gassen gennemtrængelig PDMS og fluidic kanaler til at forbedre brugervenligheden af fyldet.
- Fjerne enheder fra den vakuumkammer og straks nedsænkes enheder i en petriskål, fyldt med flydende ¼ styrke plante baseret medier på pH 5.7.
- Ved hjælp af en pipette, trække væske gennem fjorde til at fylde enheden. Kontroller, at ingen luftbobler forblive inden for kanaler ved besigtigelse.
- Overføre enkelte enheder til nye tør petriskåle. Hæld eller pipette varm agar omkring enheden indtil agaren er næsten flugter med toppen af enheden PDMS. Tillad agar størkne.
Bemærk: Anordninger er nu klar til plantning frø eller kan opbevares ved 4 ° C indtil det skal bruges.
- Plantning frø inden for enheder
- I et sterilt miljø, skal du overføre en steriliseret frø til indløb af hver enhed ved hjælp af en lille pipette.
- Cover petriskål med voks film (Se Materialer tabel) og sted i en lys/mørke cykling vækst kammer eller vindueskarmen ved stuetemperatur. Orientere petriskålen, således at enhederne, der er lodret og tyngdekraften vil tilskynde rødderne vokser gennem kanalen.
3. behandling
- Eksperimentelle behandlinger
- På det ønskede tidspunkt i den sætteplante udvikling, skal du tilføje den eksperimentelle behandling til sætteplante ved at tilføje en foreskrevne mængde af behandlingen til hver af 8 side portene via pipette.
- Forsegl petriskålen og vende tilbage til vækst kammer eller vindueskarmen.
- Fortsætte med imaging prøver på det ønskede tidspunkt at fange enkelte tidspunkter eller begynde tid bortfalder imaging.
4. optiske billeddannelse
- Lavere opløsning (4-20 X) Imaging
- Placere hele petriskålen indeholdende enhed og sætteplante i en inverteret lysfelt mikroskop for lavere opløsning (4-20 X) lyse felt eller differential interferens kontrast (DIC) billeddannelse. Optimere lysforhold for at belyse morfologiske egenskaber af interesse ved at justere eksponering gange, lampe lysstyrke, blænde og polaritet af lys. Køre scenen til det ønskede område af rod og fokus på roden eller root hair(s) af interesse.
- Erhverve en enkelt tidspunkt eller en tidsserie af billeder. For at visualisere væksten af rodtråde, image voksende rodtråde én gang pr. min. At visualisere vækst af de vigtigste rod, erhverve ét billede hver 30 min. tilbagevenden petriskålen og stiklinger til vækst kammer eller vindueskarmen i en lodret position efter imaging er fuldført.
- Højere opløsning (20-63 X) Imaging
- Når sætteplante er vokset til en ønsket tid, bruge pincet til at fjerne coverslip og enhed fra agaren. Rense ned i bunden af coverslip ved hjælp af en ethanol chloroformvædet laboratorium væv.
- Gælde mål som foreslået af mikroskop linse fabrikanten anbefalede nedsænkning medier. Placer coverslip ned på stadiet mikroskop og hæve scenen for at kontakte fordybelse medier på målet. Optimere lysforholdene ved at justere eksponering gange, lampe lysstyrke, blænde og polaritet af lys. Køre på scenen til det ønskede område og fokus på root hair(s) af interesse.
Bemærk: DIC er nødvendig for at visualisere cytoplasmatisk streaming, og fluorescens markører er nødvendige for at visualisere organelle bevægelse. - For at kvantificere rod hårvækst over tid, erhverve ét billede pr. min. For at visualisere organelle bevægelse, minimere eksponeringstiden fluorescens samtidig stadig bevare en identificerbar fluorescens signal fra organeller. Erhverve billeder af organeller hurtigst eksponeringstiden tillader. For længere time-lapse imaging, skal du bruge en live-celle imaging fase inkubator til at vedligeholde omgivende temperatur og fugt.
Bemærk: En 63 X olie mål anbefales til billedbehandling rod hår organeller.
5. ikke-optiske billeddannelse
- Enheden forberedelse
- Når sætteplante vokset til ønsket tid,
- Deponere en tynd (~ 20 nm) lag af chrom på roden og de omkringliggende PDMS ved hjælp af en Dual pistol elektron Beam fordampning kammer.
- Overføre rod og PDMS enhed til en scanning elektron mikroskop kammer.
Bemærk: Imaging betingelser, dvs. spænding, aktuelle og arbejde afstand skal optimeres for at opnå den ønskede opløsning for en given ansøgning.
- Montere PDMS enhed roden side op på en AFM prøveholder. At forøge kontrast i kameraet og mere let skelne roden fra PDMS, placere PDMS enheden på en flad reflekterende substrat (såsom glimmer belagt med guld) før monteringsudstyret på præparatholderen AFM.
- Sikre en flydende godt udlæg på toppen af enhedens PDMS og fylde den med vand for at holde rødderne hydreret under imaging.
- Indlæse præparatholderen i AFM. Juster z-kontrol for tykkelsen af PDMS-enhed og køre cantilever til region af interesse på roden ved hjælp af et kamera til vejledning.
- Juster laser med spidsen af cantilever. For de bedste resultater med kontakt tilstand imaging, bruge udkragninger med foråret konstanter af 0,01 eller 0,03 N/m for at udøve minimal kraft i roden under scanningen.
- Langsomt sænke den scanning mekanisme indtil cantilever bare gør kontakt med prøven. Justere scanningsstørrelse for den ønskede region og vælge en scanning hastighed på 1 linje/s med 256 spændingspunkter pr. linje. Erhverve scanningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To-lags PDMS mikrofluid anordningerne, der beskrives her har en 200 µm høj kanal for de vigtigste Arabidopsis rod og en 20 µm store kammer begrænse sideværts voksende rodtråde (figur 1A). Dette design kan anvendes til plantearter med lignende root diametre som Arabidopsis thaliana og let kan ændres til at rumme arter af forskellige størrelser. Design inkorporerer et indløb for anlægget samt 8 side fjorde for enhver ønskede kemiske eller biologiske behandling. Prefilling enheder med media og hælde agar omkring enheden holder root miljøet hydreret for varigheden af forsøget uden behov for ekstern fluidic udstyr. (Figur 1B) Agaren også stabiliserer enhed i petriskålen, så planter skal dyrkes lodret at tilskynde rodvækst ned den vigtigste kanal. Petriskålen holder udplantningsplanterne indeholdt i en kimfri miljø og tillader rodsystem til afbildning gennem petriskål til forstørrelser op til 20 X. En anden mulighed ville være at direkte forsegle PDMS enheden til en glas-bund petriskål for endnu højere optisk forstørrelse.
Arabidopsis thaliana frø kan plantes direkte ind i enheden fjorden, der er udstanset på en 45-graders vinkel til lette rodvækst i den vigtigste kanal. (Figur 1 c) Højden af PDMS enhed bør ikke overstige et par millimeter, som bladene skal være i stand til at vokse ud af toppen af platformen. På grund af deres lille størrelse er Arabidopis frø meget vanskeligt at orientere så at de nye rod radikale står over kanalen efter spiring. Derfor, ca. halvdelen af frøene plantet vil spire med deres blade i kanalerne og kan ikke bruges til roden visualisering eksperimenter. Enheder fra disse planter kan være re-autoklaveres og bruges igen begynder fra trin 2.2. For at tilskynde fototopiske vækst af Arabidopsis thaliana skud, kan visning kammer i enheden dækkes i aluminiumsfolie at blokere lys og forbedre succesrate. Arabidopsis thaliana rødder er vokset støt i denne platform for en uge, hvorefter væksten bliver rettet mod laterale rod dannelsen. (Fig. 1 d) Væksten af rødder i denne platform kan sammenlignes med vækstrater i Arabidopsis thaliana rødder i andre mikrofluid platforme. 13 den to-lags konstruktion med held begrænser rodtråde til samme tænkelig plan som de vigtigste rod. (Figur 1E) Men nogle rodtråde kan fortsætte med at stige i den vigtigste kanal ud af optisk fokus og fremtidige design bør sigte mod at mere gradvist guide rod hår ind i root hår kammeret.
Figur 1: Vækst i Arabidopsis thaliana i to-lags mikrofluid Platform. (A) enhed består af to lag for at begrænse rodtråde til samme tænkelig plan som den vigtigste root (skala 1 mm). A. thaliana frøplanter kan være (B) indeholdt i en kimfri miljø, (C) spiret fra frø inden for enheden, skalere bar = 400 µm, (D) og overvåges for vækst i løbet af ugen (fejllinjer er standardafvigelsen, SD) . (E) A repræsentative rod er afbildet i platformen, skala bar = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Mikrofluid-platformen, kan rodtråde kvantificeres på en cellulært niveau med hensyn til deres længde, tæthed og kantethed af deres vækst fra roden. (Figur 2A) Rod hårlængde og tæthed af A. thaliana vildtype planter dyrket i vores platform er inden for rækkevidde af planter dyrket lodret på agar plader. 14 vinklen af rod hårvækst er typisk vinkelret på overfladen af roden. I vores platform, kan kantethed af rod hårvækst mod spidsen være en artefakt af indelukning af rod hår til en 2-dimensional plan. Mekanisk stimulation, har i dette tilfælde af vægge af mikrofluid enhed, vist sig at fremkalde ændringer i rodvækst og orientering, hvilket kan forklare forskellen mellem en begrænset mikrofluid platform og en åben agar plade. 15 det er usandsynligt, at denne Fænotypen er resultatet af et næringsstof stress i vores platform, som A. thaliana frøplanter udnytter lagrede fødevarer reserver fra frø i de første par dage af vækst. Selv om hypoxi kan være en bekymring i fuldt mættet rodsystemer, har ilt permeabilitet af PDMS tidligere påvist biokompatibilitet polymer med ilt afhængige væv. 16 , 17
En af de stærkeste fordele af mikrofluid platforme over agar plade metoder er muligheden for at tilføje ensartet præcise koncentrationer af kemiske behandlinger til organismerne. I single channel-mikrofluid platforme, kan tilsætning af behandlinger potentielt fortrænge fine rodtråde fra optisk fokus. Her viser vi vedligeholdelse af rod hår optisk fokus i vores to-lags mikrofluid platform under tilsætning af fluorescerende perler. I figur 2B er en sætteplante afbildet a før og (ii) efter tilsætning af fluorescerende carboxylated polystyren perler (blå og rød). Tilføjelsen af denne abiotiske behandling ikke forstyrre orientering eller optisk fokus for den sætteplante rodtråde.
Højere forstørrelse billedbehandling og fluorescerende markører kan bruges til billede og kvantificere organelle niveau ændringer i rod hår udvikling (figur 2 c). Cytoplasmatisk streaming kan ses i en rod hår fra en (i) differential interferens kontrast billede og i en anden rod hår fra en sætteplante, der indeholder en tredobbelt organelle markør18, bane og rumlige fordeling af tre organeller ii) Golgi (mCherry), (iii) peroxisomer (FFP), og (iv) mitokondrier (YFP) kan ses fra den maksimale intensitet projektion i hver respektive panel. Flytning af disse tre organeller er fanget i en kumulativ plottet i figur 2 c.
Figur 2: rod hår karakterisering og behandling. Rodtråde var kvantificeres på en cellulær lEvel af (A) længden, tæthed og kantethed for n = 4 vildtype (WT) stiklinger (fejllinjer er SD). Kantethed bestemmes som vinklen mellem hovedrod tip og rod hår tip med hovedrod spidsen defineret som 0° mark. (B) rodtråde optisk fokus forbliver uændret a før og (ii) efter behandle dem med polystyren fluorescerende perler (skalalinjen = 100 µm). (C) Organelle niveau kvantificering fremgår af imaging a cytoplasmatisk streaming fra en differential interferens kontrast billede og i en separat rod hår, fluorescens af tre organeller: II Golgi (iii) peroxisomer, og (iv) mitokondrier (skalalinjen = 10 µm). Organelle baner blev visualiseret ved en sammenlægning af fluorescerende billeder taget hver 23-32 s for 20 s. Bevægelser af de tre organeller blev sporet automatisk og kumulative hastighed distributioner afbildet til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
PDMS enheden præsenteret her har ikke været kemisk bundet til et glas coverslip men snarere udgør et svagere fysiske bånd, der er oprettet under trinnet autoklavering. Dette giver enheden skal være afmonteret efter den optiske billeddannelse eksperiment er fuldført. PDMS enhed kan skrælles fra glasset, inverteret og bruges som substrat for højere opløsning ikke-optiske billeddannelse af roden morfologi (figur 3A). Platformen bekvemt holder roden på plads under kontakt med en cantilever under atomic force mikroskopi (figur 3B). Yderligere, hvis pleje er taget demontering processen, rodtråde vil forblive i stilling på PDMS substrat. Dette er vist fra den optisk billede af roden før afmontering (figur 3 c) og efter afmontering af platformen og belægning sætteplante i en 20 nm ledende chrom lag for billeddannelse med en scanning elektron mikroskop (figur 3D ). For at bevare yderligere sætteplante før dekonstruere platformen, kan en aldehyd-baserede fiksativ injiceres i platform til bitmapgenkendelse plante væv proteiner i sted.
Figur 3: enhed dekonstruktion og ikke-optiske billeddannelse. (A) mikrofluid-platformen kan skilles ad og bruges som substrat for høj opløsning ikke-optiske Billeddannende metoder. (B) den overflade topografi (diffraktion billede) af en Arabidopsis thaliana root tip er afbildet ved hjælp af kontakt tilstand atomic force mikroskopi, skala bar = 2 µm. Placeringen af cantilever på roden er angivet med en sort pil i indsatser, skala bar = 100 µm. (C) optisk billede og (D) tilsvarende scanning electron Mikrograf af samme sætteplante før og efter enheden er afmonteret. Pile understrege rodtråde, at forblive uforstyrret, skala bar = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikel for at skabe en plante-on-a-chip platform er unik, idet to-lags design begrænser rodtråde til et enkelt tænkelig plan og platformen kan dekonstrueret og bruges som substrat for høj opløsning ikke-optiske billeddannelse . Ved hjælp af høj opløsning ikke-optiske billeddannelse kan give værdifulde oplysninger om plantevæv, der ikke kunne hentes fra optiske billeddannelse alene. For eksempel, kan AFM imaging give kraft målinger for at beregne elasticiteten i root væv under udvikling eller efter en bestemt kemisk eller biologisk behandling. På samme måde, SEM imaging kan give høj opløsning detaljer af overflade topografi root væv, og når kombineret med kemiske imaging, kan give oplysninger om elementære sammensætning af væv. 19 fremtidige generationer af denne mikrofluid platform vil omfatte optimering for kompatibilitet med andre kemiske Billeddannende systemer som matrix assisted laser desorption/Ionisation-masse spektroskopi (MALDI-MS) og sammenhængende anti-Stokes Raman spektroskopi (biler).
Kritiske trin i denne metode indebærer bruge agar til enheden og give hydrering til anlægget uden behov for komplicerede væskestrøm procedurer. Også skal udvises forsigtighed ved deconstructing PDMS enheden fra glas substrat for at holde roden morfologi intakt. Hvis den eksperimentelle mål er udelukkende for lav til medium opløsning optisk tænkelig uden behov for enheden dekonstruktion, kan proceduren blive ændret til kemisk bond enhed til den underliggende glas substrat bruger ilt plasma. Højere opløsning, optiske billeder kan opnås uden at fjerne enheden fra omgivelserne kimfri ved kemisk binding PDMS direkte til et glas bund petriskål og derefter hælde agar omkring PDMS som tidligere beskrevet.
Design af 8 behandling side kanaler var et forsøg på at begrænse behandlinger til visse regioner af roden. Dette design var imidlertid forgæves at forhindre udbredelsen af behandling til andre områder af roden på grund af ledningsevne af det åbne område i den vigtigste rod kanal. For at lokalt behandle roden, vil enhed arkitektur enten nødt til at blive redesignet for at begrænse behandlinger eller behandling skal indføres via en tyktflydende medier til midlertidigt langsom diffusion i hele enheden.
Hvis det er ønskeligt for eksperimentelle behandlinger tilføjes via flow, være ændringer også nødvendige for denne platform. I øjeblikket tilsætning af flow til nogen af platform fjorde resulterer i udvisning af frø fra dets indsugnings- og svært ved at kontrollere placeringen af de fluidic behandlinger. Denne metode fungerer godt for frøplanter til en uge af alder. Det er begrænset hvor længe stiklinger kan fortsætte med at vokse i platformen, på grund af længden af den vigtigste kanal. Fremtidige ændringer vil involvere forlængede den vigtigste kanal og inkorporerer flere 200 µm høj kanaler for laterale rødder samtidig bevare 20 µm høje kammer for rod hår indespærring. Denne ændring vil kræver viden på den forventede placering af laterale root fremkomsten for at udforme en passende anordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette manuskript har været forfattet af UT-Battelle, LLC under Kontraktnr. DE-AC05-00OR22725 med det amerikanske Department of Energy. USA 's regering bevarer og udgiveren, ved at acceptere artikel til offentliggørelse, erkender, at de Forenede Staters regering bevarer en ikke-eksklusiv, indbetalte, uigenkaldelig, verdensomspændende licens til at udgive eller reproducere den offentliggjorte form af Dette manuskript, eller tillade andre at gøre det, for USA 's regering formål. Department of Energy vil give offentligheden adgang til disse resultater af føderalt sponsoreret forskning i overensstemmelse med DOE aktindsigt Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Dette arbejde blev delvist understøttet af genomisk Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiske og miljømæssige forskning, som en del af den plante mikrobe grænseflader videnskabelige fokusområde (http://pmi.ornl.gov). Fabrikation af mikrofluid platforme blev udført i Nanofabrication Research Laboratory på Center for Nanophase materialer Sciences, som er en DOE Office of Science bruger Facility. JAA understøttes af en NSF graduate research fellowship DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
