Summary
Denna artikel visar hur kultur Arabidopsis thaliana plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform som begränsar den viktigaste roten och rothår till ett enda optiska plan. Denna plattform kan användas för realtid optisk avbildning av fina rot morfologi samt när det gäller högupplösta imaging med andra medel.
Abstract
Rothår öka rot yta för bättre vatten upptag och näringsämne absorption av anläggningen. Eftersom de är små i storlek och ofta skyms av deras naturliga miljö, är rotahåret morfologi och funktion svåra att studera och ofta utestängda från växtforskning. Under de senaste åren har mikroflödessystem plattformar erbjudit ett sätt att visualisera rotsystem med hög upplösning utan att störa rötterna under överföringen till en bildsystem. Mikroflödessystem plattformen presenteras här bygger på tidigare växt-på-ett-chip forskning genom att införliva en två-lagers enhet om du vill begränsa Arabidopsis thaliana huvudsakliga roten till samma optiska plan som rothår. Denna konstruktion möjliggör kvantifiering av rothår på en cellulär och organell nivå och även förhindrar z-axis drifting under tillägg av experimentella behandlingar. Vi beskriver hur du lagrar enheterna i en innesluten och återfuktad miljö, utan behovet av fluidic pumpar, samtidigt som en gnobiotisk miljö för plantan. Efter optisk imaging experimentet, kan enheten demonteras och används som ett substrat för atomic force eller svepelektronmikroskopi samtidigt hålla fina rot strukturer intakta.
Introduction
Fina rot funktioner ökar vatten och näringsämnen förvärv för anläggningen, att utforska ny mark blanksteg och öka den totala rot yta. Omsättningen för dessa fina rot funktioner spelar en viktig roll för att stimulera den underjordiska livsmedelskedjan1 och antalet fina rötter i vissa växtarter är beräknade att fördubblas under förhöjda koldioxidhalten i atmosfären2. Boten rotar generellt definieras som de mindre än 2 mm i diameter, även om nya definitioner förespråka kännetecknar Boten rotar av deras funktion3. Liksom många fina rötter rothår ger funktion upptag och absorption men tar upp mycket mindre plats med diametrar på order av µm. På grund av sin storlek, rothår svårt att bilden i situ och förbises ofta som en del av den övergripande arkitekturen för root i fältet skala experiment och modeller.
Ex terra rotahåret studier, exempelvis plantor odlas på agarplattor, har det vetenskapliga samfundet med värdefull information om celltillväxt och transport4,5. Agarplattor tillåta rotsystem att avbildas icke-förstörande och i realtid, erbjuder de inte hög miljökontroll för tillägg av experimentella behandlingar som näringsämnen, växt hormoner eller bakterier. En framväxande lösning för att underlätta hög upplösning imaging också ger dynamiska miljökontroll varit tillkomsten av mikrofabricerade plattformar för växt studier. Dessa plattformar har aktiverat oförstörande tillväxt och visualisering av flera växtarter för hög genomströmning fenotypning6,7,8,9, isolerade kemiska behandlingar 10, kraft mätningar11,12och tillägg av mikroorganismer13. Mikroflödessystem plattform mönster har fokuserat på användningen av enda öppet utrymme fluidic lager där rötterna får propagera, tillåter de rothår glida in och ut ur optisk fokus under tillväxt eller behandling.
Här presenterar vi ett förfarande för att utveckla en två-lagers mikroflödessystem plattform med foto och soft-litografi metoder som bygger på tidigare växt-på-ett-chip mönster genom inskränker de plantan rothår till samma imaging plan som huvudsakliga roten. Detta tillåter oss att spåra rotahåret utveckling i realtid, med hög upplösning, och hela processen experimentell behandling. Våra culturing metoder Tillåt Arabidopsis thaliana plantor att vara grodda från frö inom plattformen och odlade för upp till en vecka i en återfuktad och steril miljö som inte kräver användning av sprutan pumputrustning. När time-lapse imaging experimentet har ingått, kan den plattform som presenteras här öppnas utan att störa de finare rot-funktionerna position. Detta tillåter användning av andra högupplösta avbildningsmetoder. Här tillhandahåller vi representativa resultat för kvantifiering och visualisering av rotahåret morfologi i denna plattform av optisk, scanning electron microscopy (SEM), och atomic force microscopy tekniker (AFM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. två-lagers plattform Fabrication
- Tillverkning av multilayer masters
- Spin rock epoxy-baserat negativa fotoresist (~63.45% solider, 1.250 cSt) enligt tillverkarens specifikationer (2.000 rpm för 45 s) på en 4 tums diameter kisel wafer att erhålla önskad höjd 20 µm för första design skiktet.
- Soft-baka de motstå belagda Oblaten för 4 min vid 95 ° C. Tillåta wafer svalna för 5 min. exponera rånet till UV-ljus för 15 s (~ 150 mJ/cm2 på 365 nm) genom en photomasken i en UV-kontakta aligner för att definiera geometri av bottenlagret.
- Efter exponering baka rånet för 5 min vid 95 ° C. Utan att utveckla, återgå rånet till spin coater och snurra på ett andra lager av epoxi-baserade negativa fotoresist (~76.75% solider, 80.000 cSt) vid 3 000 rpm att uppnå ett andra Lagerhöjd 150-200 µm.
- Tillåta rånet vila i 5 min innan du överför till en 95 ° C värmeplatta för 45 min. Efter bakning på värmeplattan, avlägsna rånet och låt resist svalna och stelna i rumstemperatur i en annan 5 min platta plant underlag. Rikta in och exponera rånet till det andra lagret photomasken för 30 s i en UV kontakt aligner (dos om cirka 300 mJ/cm2).
- Utföra en efter exponering baka genom att placera rånet på en värmeplatta för 15 min vid 95 ° C, och sedan låta rånet svalna på ett platt underlag för 5 min innan utveckla.
- Utveckla båda motstå lagren samtidigt genom att placera rånet i en plast skål och dränka rånet i lämpliga utvecklaren (se Material tabell). Skaka försiktigt skålen ibland för att tvätta ny exploatören över rånet.
- Efter 17 min, skölj rånet med isopropanol (IPA). Om en vit film visas, fortsätter du att iterera mellan sköljning rånet med utvecklare och IPA tills filmen försvinner. Torka mönstrade kisel rånet med kväve.
- Polydimetylsiloxan Soft-litografi
- Exponera kisel rånet till en luft plasma för 30 s i plasma renare inställd på hög (se material tabell) för att rengöra. Silanize rånet med triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octyl) silan i en kemisk huva på en värmeplatta under flampunkten för silan (85 ° C) för 2 h.
- Häll förhållandet 10:1 av Polydimetylsiloxan (PDMS) till härdare på kisel master rånet. Avlufta den blandade PDMS i en vakuumkammare och sedan bota polymeren i 70 ° C ugn i 1 h eller tills PDMS är helt botad.
- Med en skalpell skär PDMS enheter och skala dem från silicon master rånet. Använd en 1,5 mm biopsi punch för att skapa utsäde och behandling vikar, stansning utsäde inloppet i 45° vinkel att uppmuntra rottillväxt i huvudkanalen.
- Använd tydliga tejp för att ta bort skräp från PDMS enheten och placera enheten utformningen sidan nedåt på ett täckglas. Autoklav monterade enheter.
2. plantera enheter
- Arabidopsis thaliana utsäde förberedelse
- Yta sterilisera A. thaliana frön i ett mikrofugrör med en lösning av 30% kommersiellt tillgängliga blekmedel utspätt i avjoniserat vatten och 0,1% Triton X tvättmedel för 7 min. Tvätta frön 4 gånger med sterilt vatten.
- Stratifiera frön av kylar mikrofugrör över natten eller upp till en vecka vid 4 ° C.
- Enheten förberedelse
- Placera steriliserad enheter i ett vakuum avgasning kammaren för att ta bort luft från gas permeabla PDMS och fluidic kanaler för att förbättra användarvänlighet fyllning.
- Ta bort enheterna från vakuumkammare och omedelbart dränka enheter i en petriskål fylld med flytande ¼ styrka växtbaserad media vid pH 5,7.
- Med pipett, dra vätskan genom öppningarna att fylla enheten. Se till att inga luftbubblor kvar inom kanaler genom okulärbesiktning.
- Överföra enskilda enheter till nya torra petriskålar. Häll eller Pipettera heta agar runt enheten tills agar är nästan jäms med toppen av PDMS enheten. Tillåta agar stelnar.
Obs: Enheter är nu redo för plantering frön eller kan lagras vid 4 ° C tills den behövs.
- Plantera frön inom enheter
- I en steril miljö, överföra en steriliserad utsäde till öppningen av varje enhet som använder en liten pipett.
- Täcka petriskål med vax film (se Material tabell) och placera i en ljus och mörker cykling tillväxt kammare eller fönsterbrädet i rumstemperatur. Orient petriskål så att enheterna är vertikala och gravitation kommer att uppmuntra rötterna att växa genom kanalen.
3. behandling
- Experimentella behandlingar
- Vid önskad tid i plantans utveckling, lägga till experimentell behandling till plantan genom att lägga till en föreskriven mängd behandling varje 8 sida port via pipett.
- Återförslut petriskål och återgå till tillväxt kammare eller fönsterbrädan.
- Fortsätt med imaging prover vid önskad tid att fånga enskilda tidpunkter eller börja tid förflutit imaging.
4. optisk Imaging
- Lägre upplösning (4-20 X) Imaging
- Placera hela petriskål som innehåller enhet och plantan under en inverterad ljusa fält Mikroskop för lägre upplösning (4-20 X) ljusa fält eller differentiell störningar kontrast (DIC) imaging. Optimera ljusförhållanden för att belysa morfologiska egenskaper av intresse genom att justera exponering gånger, lampans ljusstyrka, bländare och polariteten av ljus. Kör på scenen på önskat område av roten och fokusera på roten eller root hair(s) av intresse.
- Förvärva en enda tidpunkt eller en tidsserie av bilder. För att visualisera tillväxten av rothår, image växande rothår en gång per minut. Att visualisera tillväxten av huvudsakliga roten, förvärva en bild var 30 min. avkastning petriskål och plantorna till tillväxt kammare eller fönsterbrädet i vertikal position efter imaging är klar.
- Högre upplösning (20-63 X) Imaging
- När plantan har vuxit under önskad tid, använda pincett för att ta bort täckglas och enhet från ägarn. Rensa bort botten av den täckglas använder en etanol befuktas laboratorium vävnad.
- Gälla mål som föreslagits av mikroskop lins tillverkaren Rekommenderad nedsänkning media. Placera täckglaset ner på Mikroskop scenen och höja scenen för att kontakta nedsänkning media på målet. Optimera ljusförhållanden genom att justera exponering gånger, lampans ljusstyrka, bländare och polariteten av ljus. Kör scenen till önskat område och fokus på root hair(s) av intresse.
Obs: DIC behövs att visualisera cytoplasmiska streaming och fluorescens markörer behövs för att visualisera organell rörelse. - För att kvantifiera rot hårtillväxt över tid, förvärva en bild per min. För att visualisera organell rörelse, minimera fluorescens exponeringstiden samtidigt behålla en identifierbar fluorescens signal från organeller. Skaffa bilder av organeller så snabbt som exponeringstiden tillåter. För längre time-lapse imaging, Använd en live-cell imaging scenen inkubator för att underhålla omgivande temperatur och fukt.
Obs: Ett 63 X olja mål rekommenderas för imaging rotahåret organeller.
5. icke-optisk Imaging
- Enheten förberedelse
- När plantan har vuxit för önskad tid,
- Sätta in en tunn (~ 20 nm) lager av krom på roten och omgivande PDMS använder en dubbla Gun Electron Beam avdunstning kammare.
- Överföra rot och PDMS-enhet till en svepelektronmikroskop kammare.
Obs: Imaging villkoren, dvs spänning, nuvarande och arbeta avstånd kommer att behöva optimeras för att uppnå önskad upplösning för en given tillämpning.
- Montera rotsidan PDMS enheten upp på en AFM preparathållare. Att öka kontrasten i kameran och lättare skilja roten från PDMS, placera PDMS enheten på en plan reflekterande substrat (t.ex. mica täckt i guld) innan du monterar enheten på AFM preparathållaren.
- Säkra en flytande väl bifogad ovanpå PDMS enheten och fyll den med vatten för att hålla rötterna hydrerad under imaging.
- Läsa in preparathållaren i AFM. Justera z-kontrollen för tjocklek av PDMS enheten och köra uthänget till regionen av intresse i roten som använder en kamera för vägledning.
- Rikta in lasern med spetsen av uthänget. För bästa resultat med kontakt läge imaging, Använd utliggare med fjäder konstanter på 0,01 eller 0,03 N/m för att utöva minimal kraft på roten under avsökningen.
- Sakta sänka skanning mekanismen tills uthänget bara kommer i kontakt med provet. Justera skanningsstorlek för önskad region och välj scan hastighet på 1 rad/s med 256 spänningspunkter per rad. Förvärva scan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De två-lagers PDMS mikroflödessystem anordningar som beskrivs här har en 200 µm hög kanal för huvudsakliga Arabidopsis roten och en 20 µm hög kammare att begränsa sidled växande rothår (figur 1A). Denna design kan användas för växtarter med liknande root diametrar som Arabidopsis thaliana och kan lätt ändras för att rymma arter av olika storlekar. Den innehåller ett inlopp för anläggningen samt 8 sida vikar för någon önskad kemisk eller biologisk behandling. Prefilling enheter med media och hälla agar runt enheten håller rot miljön hydrerad under hela försöket utan behov av extern fluidic utrustning. (Figur 1B) Ägarn stabiliserar också enheten inom petriskål, så att plantorna odlas vertikalt att uppmuntra rottillväxt ner huvudkanal. Petriskål håller plantorna i en gnobiotisk miljö och tillåter rotsystemet att avbildas genom petriskål till förstoringar upp till 20 X. Ett annat alternativ skulle vara att direkt täta PDMS enheten till en glasbotten petriskål för ännu högre optisk förstoringar.
Arabidopsis thaliana frön kan planteras direkt till enheten inlet som är stansade i 45 graders vinkel att underlätta rottillväxt i huvudkanalen. (Figur 1 c) Höjden av PDMS enheten bör inte överstiga några millimeter, så bladen måste kunna växa ut från toppen av plattformen. På grund av sin storlek är Arabidopis frön mycket svårt att orientera så att den framväxande rot radikalen vetter mot kanalen vid grobarhet. Därför ungefär hälften av fröna planteras kommer att gro med sina blad i kanaler och kan inte användas för roten visualisering experiment. Enheter från dessa plantor kan vara re-autoklaveras och användas igen början från steg 2.2. För att uppmuntra phototrophic tillväxt av Arabidopsis thaliana skott, kan visning kammaren av enheten täckas i aluminiumfolie att blockera ljuset och förbättra framgång. Arabidopsis thaliana rötter har vuxit stadigt i denna plattform för en vecka, vid vilken punkt tillväxt blir riktad mot laterala rot bildandet. (Figur 1 d) Ökningen av rötter i denna plattform är jämförbara med tillväxttal på Arabidopsis thaliana rötter i andra mikroflödessystem plattformar. 13 två-lagers konstruktion framgångsrikt begränsar rothår till samma imaging plan som huvudsakliga roten. (Figur 1E) Dock vissa rothår kan fortsätta växa i den viktigaste kanalen optiska ofokuserad och framtida konstruktioner bör syfta till att mer gradvis vägleda rothår in i rotahåret kammaren.
Figur 1: Tillväxt av Arabidopsis thaliana i två lager mikroflödessystem plattform. (A) enheten består av två lager att begränsa rothår till samma imaging plan som huvudsakliga roten (skala 1 mm). A. thaliana plantor kan vara (B) som ingår i en gnobiotisk miljö, (C) grodde från utsäde inom enheten, skala bar = 400 µm, (D) och övervakas för tillväxt under loppet av en vecka (felstaplar är standardavvikelsen, SD) . (E) A representativa rot är avbildade i plattformen, skala bar = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Inom mikroflödessystem plattformen, kan rothår kvantifieras på cellulär nivå när det gäller deras längd, täthet och att vinkeländring av deras tillväxt från roten. (Figur 2A) Rot hårets längd och täthet av A. thaliana vildtyp plantor som odlas i vår plattform är inom räckhåll för plantor odlas vertikalt på agarplattor. 14 vinkeln på roten hårväxt är vanligtvis vinkelrätt mot ytan av roten. I vår plattform vara att vinkeländring av Roten hårtillväxt mot spetsen en artefakt av förlossningen av rothår till ett 2-dimensionellt plan. Mekanisk stimulering, har i detta fall av väggarna i ultrakalla enheten, visat sig framkalla förändringar i rottillväxt och orientering vilket kan förklara skillnaden mellan en trånga mikroflödessystem plattform och en öppen agarplatta. 15 det är osannolikt att denna fenotyp är resultatet av ett näringsämne stress i vår plattform som A. thaliana plantor utnyttjar lagrad mat reserver från frö i de första dagarna av tillväxt. Trots hypoxi kan vara en oro i helt mättade rotsystem, visat tidigare biokompatibiliteten av polymeren med syre beroende vävnader syre genomträngligheten av PDMS. 16 , 17
En av de starkaste fördelarna med mikroflödessystem plattformar över agar plattan metoder är jämnt lägga exakta koncentrationer av kemiska behandlingar att organismerna till. I enda kanal mikroflödessystem plattformar, kan tillägg av behandlingar potentiellt förskjuta fina rothår från optiska fokus. Här visar vi underhåll av rotahåret optiska fokus i vår två-lagers mikroflödessystem plattform under tillägg av fluorescerande pärlor. I figur 2B är en fröplanta avbildas (i) före och (ii) efter tillsats av fluorescerande carboxylated polystyren pärlor (blå och röd). Tillägg av denna abiotiska behandling inte störa den orientering eller optiska fokus för plantans rothår.
Högre förstoring bildhantering och fluorescerande markörer kan användas för att bild och kvantifiera organell nivåförändringar i rotahåret utveckling (figur 2 c). Cytoplasmiska streaming kan ses i ett rot hår från en (i) differential störningar kontrast bild och i en annan rot hår från en fröplanta som innehåller en trippel organell markör18, bana och rumslig distribution av tre organeller ii) Golgi (mCherry), (iii) peroxisomes (GFP), och (iv) mitokondrier (YFP) kan ses från den högsta ljusstyrka projektionen i varje respektive panel. Förflyttning av dessa tre organeller fångas i en kumulativ fördelning tomt i figur 2 c.
Figur 2: rotahåret karakterisering och behandling. Rothår kvantifierades på en cellulär lEvel av (A) längd, täthet och vinkeländring för n = 4 vildtyp (WT) plantor (felstaplar är SD). Vinkeländring bestäms som vinkeln mellan de främsta bakomliggande spets och rot hår tips med främsta bakomliggande spetsen definieras som 0° märket. (B), optiska fokus för rothår förblir oförändrad (i) före och (ii) efter att behandla dem med polystyren fluorescerande pärlor (skalstapeln = 100 µm). (C) organell nivå kvantifiering framgår av imaging a cytoplasmiska strömning från en differentiell störningar kontrast bild och i ett separat rot hår, fluorescensen av tre organeller: (ii) Golgi (iii) peroxisomes och (iv) mitokondrierna (skalstapeln = 10 µm). Organell banor var visualiserat genom en sammanslagning av fluorescerande bilder tagna varje 23-32 s för 20 s. Förflyttningar av de tre organeller spårades automatiskt och kumulativa hastighet distributioner ritade till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
PDMS enheten presenteras här har inte varit kemiskt bundna till ett täckglas men snarare bildar en svagare fysisk bond som upprättas under autoklavering steg. Detta gör att enheten kan demonteras efter optisk imaging experimentet slutförts. PDMS enheten kan vara skalade från glaset, inverterad och används som substrat för högre upplösning icke-optisk imaging rot morfologi (figur 3A). Plattformen rymmer bekvämt roten på plats under kontakt med en fribärande under atomic force microscopy (figur 3B). Vidare, om man är försiktig under processen demontering, förblir rothår ställning på PDMS substratet. Detta framgår från optiska bilden av roten innan demonteringen (figur 3 c) och efter demontering av plattformen och beläggning plantan i en 20 nm konduktiv krom lager för imaging med ett svepelektronmikroskop (figur 3D ). För att ytterligare bevara plantan innan deconstructing plattformen, injiceras en aldehyd-baserade fixativ i plattformen till crosslink växt vävnaden proteinerna på plats.
Figur 3: enheten dekonstruktion och icke-optisk Imaging. (A), ultrakalla plattformen kan demonteras och används som substrat för högupplösta icke-optiska avbildningsmetoder. (B) en Arabidopsis thaliana roten tips ytan topografi (diffraktion bild) är avbildade med kontakt läge atomic force microscopy, skala bar = 2 µm. Placeringen av uthänget på roten indikeras av en svart pil i infällt, skala bar = 100 µm. (C) optisk bild och (D) motsvarande scanning electron Mikrograf av samma plantan före och efter enheten är demonteras. Pilar betona rothår som förblir opåverkade, skala bar = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i denna artikel för att skapa en plattform för växt-på-ett-chip är unik genom att den två-lagers utforma ramarna rothår till en enda bildplanen och plattform kan dekonstrueras och användas som substrat för högupplösta icke-optisk imaging . Med hjälp av högupplösta icke-optisk imaging kan ge värdefull information om den växtvävnad som inte kunde erhållas från optisk imaging ensam. AFM imaging kan exempelvis ge kraft mätningar för att beräkna elasticiteten i roten vävnader under utveckling eller efter en specifik kemisk eller biologisk behandling. Likaså, SEM imaging kan ge högupplösta Detaljer för ytans topografi av root vävnad och, när den kombineras med kemiska imaging, kan ge information om elementär sammansättning av vävnader. 19 framtida generationer av denna mikroflödessystem plattform kommer att omfatta optimering för kompatibilitet med andra kemiska bildsystem som matris-assisted laser desorption/jonisering-massa spektroskopi (MALDI-MS) och sammanhängande anti Stokes Raman spektroskopi (bilar).
Kritiska steg i den här metoden innebära att vi använder agar att säkra enheten och ger återfuktning till växten utan behov av komplicerade vätskeflöde förfaranden. Man måste också vara försiktig när deconstructing PDMS enheten från glassubstrat för att hålla roten morfologi intakt. Om den experimentella mål är enbart för låg till medelhög upplösning optisk avbildning utan behov av enheten dekonstruktion, kan förfarandet ändras till kemiskt bond enheten till underliggande glassubstrat med syre plasma. Högre upplösning optiska bilder kan erhållas utan att ta bort enheten från dess gnobiotisk miljö av kemiskt limning av PDMS direkt i ett glas botten petriskål och sedan hälla agar runt PDMS som tidigare beskrivits.
Utformningen av 8 behandling sida kanaler var ett försök att begränsa behandlingar till vissa regioner av roten. Denna design var dock misslyckat för att förhindra spridningen av behandling till andra områden av roten på grund av konduktans i det öppna området i främsta bakomliggande kanalen. För att lokalt behandla roten, kommer enhet arkitekturen antingen behöva omformas för att begränsa behandlingar eller behandling kommer att behöva införas via en trögflytande medier till tillfälligt långsam diffusion i hela enheten.
Om det är önskvärt för experimentella behandlingar som ska läggas till via flöde, blir också ändringar för denna plattform. För närvarande tillägg av flöde till någon av plattform vikar resultaten i utvisningen av utsäde från dess inlopp och svårigheter att kontrollera placeringen av de fluidic behandlingarna. Denna metod fungerar bra för plantor till en veckas ålder. Det begränsas i hur länge plantor kan fortsätta att växa i plattformen, på grund av längden av den främsta kanalen. Framtida ändringar kommer att innebära elongating huvudkanal och införliva fler 200 µm hög kanaler för laterala rötter bibehållen 20 µm lång kammaren för rotahåret inneslutningen. Denna ändring kräver kunskap om förväntade lokalisering av laterala rot uppkomsten för utformning av en lämplig anordning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta manuskript har skrivits UT-Battelle, LLC under Kontraktsnr DE-AC05-00OR22725 med US Department of Energy. Förenta staternas regering behåller och förlaget, genom att godkänna artikeln för publicering, erkänner att Förenta staternas regering behåller en icke-exklusiv, inbetalda, oåterkallelig, världsomfattande licens att publicera eller reproducera det publicerade formuläret för Detta manuskript, eller tillåta andra att göra det, för Förenta staternas regering ändamål. Department of Energy kommer att ge allmänheten tillgång till dessa resultat av federalt sponsrade forskning i enlighet med DOE allmänhetens tillgång planen (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Detta arbete stöds delvis av den genomiska Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiska och miljöforskning, som en del av anläggningen mikrob gränssnitt vetenskapliga fokusområdet (http://pmi.ornl.gov). Tillverkning av mikrofabricerade plattformarna genomfördes i Nanotekniklaboratoriet forskning vid centrum för Nanophase materialvetenskaper, som är en DOE Office av vetenskap användaren anläggning. JAA stöds av en NSF graduate research fellowship DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
