Summary
Cet article montre comment la culture de semis de Arabidopsis thaliana en une plate-forme microfluidique de deux couches qui confine la racine principale et les poils absorbants pour un seul plan optique. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie optique en temps réel de la morphologie de racines fines aussi bien en ce qui concerne l’imagerie haute résolution par d’autres moyens.
Abstract
Poils absorbants augmentent la surface racinaire pour une meilleure absorption de l’eau et l’absorption des nutriments par la plante. Parce qu’ils sont de petite taille et souvent masquée par leur environnement naturel, fonction et morphologie des poils absorbants sont difficiles à étudier et souvent exclus de la recherche sur les plantes. Ces dernières années, les plateformes microfluidiques ont offert un moyen de visualiser le système racinaire à haute résolution sans déranger les racines lors du transfert d’un système d’imagerie. La plate-forme microfluidique présentée ici s’appuie sur des recherches antérieures de plante-on-a-chip en incorporant un dispositif deux couches pour confiner la racine principale de l’Arabidopsis thaliana au même plan optique comme les poils absorbants. Cette conception permet la quantification des poils absorbants sur un téléphone cellulaire et organelle niveau et également empêche l’axe z à la dérive lors de l’ajout de traitements expérimentaux. Nous décrivons comment stocker les appareils dans une ambiance confinée et hydratée, sans la nécessité pour les pompes fluidiques, tout en maintenant un environnement gnotobiotiques pour le semis. Après l’expérience d’imagerie optique, l’appareil peut être démonté et utilisé comme substrat pour la force atomique ou la microscopie électronique à balayage tout en gardant les structures fines racines intactes.
Introduction
Caractéristiques de radicelles augmentent l’eau et l’acquisition de nutriments pour la plante, explorer de nouveaux espaces de sol et d’accroître la superficie totale des racines. Le chiffre d’affaires de ces fonctionnalités de radicelles joue un rôle important dans la stimulation de l' underground chaîne alimentaire1 et le nombre de racines fines dans certaines espèces de plantes est devrait doubler en dioxyde de carbone atmosphérique élevé2. Les radicelles sont généralement définis comme ceux inférieurs à 2 mm de diamètre, bien que les nouvelles définitions préconisent pour caractériser les racines fines par leur fonction3. Comme beaucoup de fines racines, radicelles offrent les fonctions d’absorption et d’absorption mais occupent un espace beaucoup plus petit avec des diamètres de l’ordre du micron. En raison de leur petite taille, poils absorbants sont difficiles à image in situ et sont souvent négligés dans le cadre de l’architecture globale de la racine dans les modèles et les expériences en champ.
Ex terra poil étudie, tel à partir de plants cultivés sur milieu gélosé, ont présenté à la communauté scientifique des renseignements précieux sur la croissance cellulaire et de transport4,5. Tandis que les boîtes de gélose permettent des systèmes racinaires à être photographiée en temps réel et de façon non destructive, ils ne proposent pas de contrôle de l’environnement élevé pour l’ajout de traitements expérimentaux tels que les éléments nutritifs, hormones de plantes ou de bactéries. Une nouvelle solution pour faciliter l’imagerie haute résolution tout en offrant également contrôle dynamique de l’environnement a été l’avènement de plateformes microfluidiques pour les études de l’usine. Ces plates-formes ont permis la croissance non destructif et la visualisation de plusieurs espèces de plantes à haut rendement phénotypage6,7,8,9, traitements chimiques isolés 10, force dimensions11,12et l’ajout de micro-organismes13. Conceptions de plate-forme microfluidiques ont mis l’accent sur l’utilisation de couches fluidique unique espace ouvert dans lequel les racines peuvent se propager, autorisant les poils de la racine à la dérive dans et hors de l’optique mise au point au cours de la croissance ou le traitement.
Nous présentons ici une procédure pour l’élaboration d’une plateforme de microfluidique de deux couches à l’aide de photo et les méthodes douces-lithographie qui s’appuie sur les conceptions précédentes de plante-on-a-chip en limitant les poils absorbants des semis pour le plan d’imagerie de la racine principale. Cela nous permet de suivre le développement de poils absorbants en temps réel, à haute résolution et tout au long du processus de traitement expérimental. Nos méthodes de culture permettent des semis d’Arabidopsis thaliana à être mises à germer des graines au sein de la plate-forme et d’élevage pour une semaine en milieu hydraté et stérile qui ne nécessite pas l’utilisation d’équipements de pompe seringue. Après que l’expérience d’imagerie Time-lapse a conclu, la plateforme présentée ici peut être ouverte sans déranger la position des caractéristiques plus fines racines. Ceci permet l’utilisation d’autres méthodes d’imagerie haute résolution. Nous fournissons ici résultats représentatifs pour la quantification et la visualisation de la morphologie des poils absorbants dans cette plate-forme par microscopie optique, balayage (SEM) et à force atomique techniques de microscopie (AFM).
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Protocol
1. deux-couche Fabrication de plate-forme
- Fabrication des maîtres multicouches
- Spin manteau à base d’époxy de résine photosensible négative (~63.45% solides, 1 250 cSt) selon les spécifications du fabricant (2 000 tr/min 45 s) sur une plaquette de silicium de diamètre de 4 pouces pour obtenir la hauteur souhaitée de 20 µm pour la première couche de conception.
- Soft-cuire les gaufres resist couché pendant 4 min à 95 ° C. Permettre la plaquette refroidir pour 5 min. exposer la plaquette aux UV pour 15 s (~ 150 mJ/cm2 à 365 nm) à travers un photomasque dans un UV contact aligneur pour définir la géométrie de la couche inférieure.
- Après l’exposition cuire la galette pendant 5 min à 95 ° C. Sans développer, retourner la gaufrette au spin coater spin et sur une seconde couche de RESINE PHOTOSENSIBLE négative à base d’époxy (~76.75% solides, 80 000 cSt) à 3 000 tr/min pour atteindre une hauteur de deuxième couche de 150 à 200 µm.
- Permettre la gaufrette se reposer pendant 5 min avant de les transférer à une plaque chauffante à 95 ° C pendant 45 min. Après la cuisson sur la plaque de cuisson, retirer la plaquette et laisser la résistance se refroidir et durcir à température ambiante pendant 5 min sur une surface plane. Aligner et exposer la gaufrette à la deuxième photomask couche pendant 30 s dans un aligneur de contact UV (dose d’environ 300 mJ/cm2).
- Effectuer une cuisson post-exposition en plaçant les tranches sur une plaque de cuisson à 95 ° C pendant 15 minutes et laisser ensuite la plaquette à refroidir sur une surface plane pendant 5 min avant de développer.
- Développer les deux couches de résister en même temps en plaçant la plaquette dans un plat en plastique et submergeant la plaquette dans le développeur approprié (voir la Table des matières). Balançant doucement le plat occasionnellement pour lavis développeur fraîche sur la plaquette.
- Après 17 minutes, rincez la plaquette avec de l’isopropanol (IPA). Si une pellicule blanche apparaît, continuer à parcourir entre rinçage la plaquette avec le développeur et l’UIE, jusqu'à ce que le film disparaît. Sécher la plaquette de silicium à motifs avec de l’azote.
- Polydiméthylsiloxane Soft-Lithographie
- Exposer la plaquette de silicium d’un plasma d’air pendant 30 s dans un plasma cleaner mis en haut (voir Table des matières) pour nettoyer. Silyler l’hostie du silane trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-octyl) sous une hotte chimique sur une plaque chauffante sous le point d’éclair du silane (85 ° C) pendant 2 h.
- Verser un ratio 10:1 de polydiméthylsiloxane (PDMS) agent de durcissement sur la plaquette de silicium de maître. Dégazer le PDMS mélangés dans une chambre à vide et puis guérir le polymère dans un four à 70 ° C pendant 1 h ou jusqu'à ce que le PDMS est complètement guéri.
- À l’aide d’un scalpel, couper les dispositifs PDMS et pelez-les de la plaquette de silicium de maître. Un coup de poing biopsie 1,5 mm permet de créer des entrées de semences et le traitement, poinçonnage de l’entrée de la graine à un angle de 45° pour encourager la croissance des racines dans le chenal principal.
- Ruban adhésif transparent permet d’enlever les débris de l’appareil PDMS et placez le côté design de périphérique sur une lamelle de verre. Stériliser les appareils assemblés.
2. dispositifs de plantation
- Préparation de semences de Arabidopsis thaliana
- Surface de stériliser les graines d’Arabidopsis dans un tube à centrifuger avec une solution d’eau de Javel commercialement disponible 30 % dilué dans un détergent Triton X déminéralisée à eau et 0,1 % pour les semences de lavage de 7 min. 4 fois avec de l’eau stérile.
- Stratifier les graines par réfrigération tube à centrifuger pendant la nuit ou jusqu'à une semaine à 4 ° C.
- Préparation de l’appareil
- Placer des dispositifs stérilisés dans un vide dégazage chambre pour enlever l’air du gaz perméable PDMS et canaux fluidiques pour améliorer la facilité de remplissage.
- Enlever les dispositifs de la chambre à vide et plonger immédiatement les dispositifs dans une boîte de Pétri remplie de ¼ force végétale un milieu liquide à pH 5,7.
- À l’aide d’une pipette, tirer le liquide à travers les bras de mer pour remplir l’appareil. Veillez à ce qu’aucune bulle d’air ne reste au sein de canaux par inspection visuelle.
- Transfert des unités individuelles à nouveau Pétri sec. Verser ou une pipette agar chaud autour de l’appareil jusqu'à ce que le niveau de gélose affleure presque au dessus de l’appareil PDMS. Permettre à agar se solidifier.
NOTE : Les dispositifs sont maintenant prêtes à planter des graines ou peuvent être conservés à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Planter des graines dans les dispositifs
- Dans un environnement stérile, transférer une graine stérilisée à l’entrée de chaque appareil à l’aide d’une petite pipette.
- Couverture de la boîte de Pétri avec de la cire du film (voir Table des matières) et placer dans une chambre de croissance cycle lumière/obscurité ou le rebord de la fenêtre à la température ambiante. Orienter la boîte de Pétri afin que les périphériques sont verticaux et gravité va encourager les racines à se développer à travers le canal.
3. le traitement
- Traitements expérimentaux
- Au moment voulu dans le développement de la plantule, ajouter le traitement expérimental à la plantule en ajoutant un montant prescrit du traitement à chacun des ports 8 côté par pipette.
- Refermer la boîte de Pétri et revenir à la chambre de croissance ou une fenêtre.
- Aller de l’avant avec l’imagerie des échantillons au moment voulu pour capturer des moments individuels ou commencer imagerie de laps de temps.
4. optique imagerie
- Abaisser l’imagerie de résolution (4-20 X)
- Placer l’ensemble boîte de Pétri contenant l’appareil et le semis sous un microscope inversé champ lumineux pour le champ lumineux de basse résolution (4-20 X) ou l’imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel. Optimiser les conditions d’éclairage pour élucider les caractéristiques morphologiques d’intérêt en réglant le temps d’exposition, la luminosité de la lampe, ouverture et la polarité de la lumière. Conduire la scène à l’endroit désiré de la racine et se concentrer sur la racine ou le root hair(s) d’intérêt.
- Acquérir un moment unique ou une série temporelle d’images. Pour visualiser la croissance des poils absorbants, image croissante des poils absorbants une fois par minute. Pour visualiser la croissance de la racine principale, acquérir une image chaque 30 min. retour la boîte de Pétri et les semis à la chambre de croissance ou le rebord de la fenêtre en position verticale après l’imagerie est terminée.
- Imagerie de résolution (20-63 X) supérieur
- Lorsque la plantule est trop grand pour un temps désiré, utilisez pinces pour retirer la lamelle couvre-objet et dispositif de l’agar. Nettoyer le fond de la lamelle à l’aide d’un tissu de laboratoire éthanol humidifiée.
- Appliquer les médias recommandée d’immersion à l’objectif tel que suggéré par le fabricant de lentilles du microscope. Placez le couvre-objet sur la platine du microscope et soulever la scène pour communiquer avec les médias de l’immersion sur l’objectif. Optimiser les conditions d’éclairage en réglant le temps d’exposition, la luminosité de la lampe, ouverture et la polarité de la lumière. Conduire la scène à l’endroit désiré et de se concentrer sur root hair(s) d’intérêt.
Remarque : La DIC est requis pour visualiser la cyclose et marqueurs fluorescence sont nécessaires pour visualiser le mouvement des organites. - Afin de quantifier la croissance des cheveux de la racine au fil du temps, acquérir une image par min. Afin de visualiser le mouvement des organites, réduire au minimum le temps d’exposition de fluorescence tout en conservant un signal de fluorescence identifiable d’organelles. Acquérir dès que le temps d’exposition permet des images des organites. Pour plus de Time-lapse imagerie, utiliser un incubateur de stade d’imagerie de cellules vivantes pour maintenir l’humidité et la température ambiante.
Remarque : Un objectif à huile 63 X est recommandé pour imagerie organites de poils absorbants.
5. non optique imagerie
- Préparation de l’appareil
- Lorsque des semis sont trop grand pour la durée souhaitée,
- Déposer une fine (~ 20 nm) couche de chrome sur la racine et qui entourent le PDMS en utilisant une double Gun Electron Beam évaporation chambre.
- Transférer la racine et le dispositif de PDMS devant une chambre du microscope électronique à balayage.
NOTE : Conditions, c'est-à-dire de tension, distance actuelle et fonctionnel de l’imagerie devra être optimisé pour atteindre la résolution souhaitée pour une application donnée.
- Du côté de racine du périphérique PDMS montent sur un porte-échantillon AFM. Pour augmenter le contraste dans la caméra et la racine plus facilement distinguer le PDMS, placez l’appareil PDMS sur un substrat plat réfléchissant (comme mica revêtu en or) avant de monter l’appareil sur le porte-échantillon AFM.
- Fixer une attache bien liquide sur le dessus de l’appareil PDMS et remplissez-le d’eau pour garder les racines hydratés pendant la formation image.
- Insérez le porte-échantillon dans l’AFM. Réglage de la z-pour l’épaisseur de l’appareil PDMS et conduire le cantilever à la région d’intérêt sur la racine à l’aide d’une caméra pour l’orientation.
- Aligner le laser avec la pointe du levier. Pour de meilleurs résultats avec l’imagerie mode de contact, utilisez poutres en porte-à-faux avec des constantes de printemps de 0,01 ou 0,03 N/m à exercer une force minimale sur la racine lors de la numérisation.
- Abaissez lentement le mécanisme de balayage jusqu'à ce que le levier soit juste en contact avec l’échantillon. Ajustez la taille de numérisation pour la région souhaitée, puis choisissez une vitesse de balayage de 1 ligne/s avec 256 points de tension par ligne. L’analyse de l’acquisition.
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Representative Results
La microfluidique PDMS diploblastique décrits ici ont un canal élevé de 200 µm pour la racine principale d’Arabidopsis et une chambre haute de 20 µm à confiner latéralement de plus en plus les poils (Figure 1 a). Cette conception peut être utilisée pour les espèces de plantes avec un diamètre racine semblable comme Arabidopsis thaliana et peut être facilement modifiée pour tenir compte des espèces de différentes tailles. La conception intègre une entrée de l’usine, ainsi que 8 entrées de côté pour tout traitement chimique ou biologique. Déclarants les appareils avec les médias et couler la gélose autour de l’appareil maintient l’environnement racinaire hydratée pendant la durée de l’expérience sans la nécessité d’un équipement externe fluidique. (Figure 1 b) La gélose stabilise également l’appareil dans la boîte de Pétri, permettant les plants à cultiver verticalement afin d’encourager la croissance des racines vers le bas le chenal principal. La boîte de Pétri conserve les semis contenues dans un environnement gnotobiotiques et permet au système de racine d’être photographié par le biais de la boîte de Pétri à grossissements jusqu'à 20 X. Une autre option consisterait à sceller directement l’appareil PDMS à un fond en verre Pétri de grossissement optique encore plus élevé.
Arabidopsis thaliana graines peuvent être plantées directement dans l’entrée du dispositif qui est coup de poing à un angle de 45 degrés pour faciliter la croissance des racines dans le chenal principal. (Figure 1) La hauteur de l’appareil PDMS ne doit pas dépasser quelques millimètres, comme les feuilles doivent être capables de se développer hors de la partie supérieure de la plate-forme. En raison de leur petite taille, facteur de graines sont très difficiles à orienter de sorte que le radical de racine émergente trouve le canal à la germination. Par conséquent, environ la moitié des graines plantées germeront avec leurs feuilles dans les canaux et ne peut être utilisée pour des expériences de visualisation de racine. Dispositifs de ces semis peuvent être re-stérilisés à l’autoclave et utilisée à nouveau début de l’étape 2.2. Afin d’encourager la croissance phototrophe des tiges de Arabidopsis thaliana , la chambre Regarde un du dispositif peut-être être couverts en papier d’aluminium pour bloquer la lumière et améliorer le taux de réussite. Racines d’Arabidopsis thaliana ont cessé de croître dans cette plateforme pendant une semaine, à quel point la croissance devient orientée vers la formation de racines latérales. (Figure 1) Le taux de croissance des racines dans cette plate-forme sont comparables aux taux de croissance des racines d’Arabidopsis thaliana en autres plateformes microfluidiques. 13 la conception de deux-couche limite avec succès les poils absorbants pour le plan d’imagerie de la racine principale. (Figure 1E) Toutefois, certains poils absorbants peuvent continuer à croître dans le chenal principal hors foyer optique et conceptions futures devraient s’efforcer de guider plus progressivement les poils dans la chambre de poils absorbants.
Figure 1 : Croissance de Arabidopsis thaliana en deux couches Microfluidic plate-forme. (A) dispositif se compose de deux couches de confiner les poils absorbants pour le plan d’imagerie de la racine principale (échelle 1 mm). A. thaliana semis peuvent être (B) contenues dans un environnement gnotobiotiques, (C) mises à germer des graines au sein de l’appareil, à l’échelle bar = 400 µm, (D) et surveillé pour la croissance, au cours d’une semaine (barres d’erreur sont a déviation standard, SD) . Racine de représentant (E) A est photographiée sur la plateforme, balance bar = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Au sein de la plate-forme de la microfluidique, les poils peuvent être quantifiées au niveau cellulaire en fonction de leur longueur, la densité et l’angularité de leur croissance de la racine. (Figure 2 a) Longueur des poils absorbants et densité de type sauvage d’a. thaliana plants cultivés dans notre plateforme sont à portée des plantules verticalement sur milieu gélosé. 14 l’angle de la croissance des cheveux de la racine est généralement perpendiculaire à la surface de la racine. Dans notre plateforme, l’obliquité de la croissance des cheveux de la racine vers la pointe peut être un artefact du confinement des poils racine sur un plan 2D. Une stimulation mécanique, en l’occurrence par les parois du dispositif microfluidique, a été démontrée pour induire des changements dans la croissance des racines et l’orientation qui pourrait expliquer la différence entre une plate-forme microfluidique confiné et une boîte de gélose ouvert. 15 il est peu probable que ce phénotype est le résultat d’une contrainte de nutriments dans notre plateforme comme semis d’a. thaliana utilisent des réserves de nourriture stockée de la graine dans les premiers jours de croissance. Bien que l’hypoxie peut poser problème dans les systèmes racinaires complètement saturées, la perméabilité à l’oxygène du PDMS a déjà démontré la biocompatibilité du polymère avec tissus dépendant de l’oxygène. 16 , 17
Un des avantages des plateformes microfluidiques plus fortes par rapport aux méthodes plaque agar est la possibilité d’ajouter uniformément des concentrations précises de traitements chimiques pour les organismes. Dans les plates-formes de microfluidique monocanal, l’ajout de traitements peut potentiellement déplacer fines radicelles de focus optique. Nous démontrons l’entretien des poils absorbants optique mise au point dans notre plate-forme microfluidique deux couches lors de l’ajout de perles fluorescentes. Figure 2 b un semis est imagé (i) avant et (ii) après l’ajout de billes de polystyrène carboxylés fluorescent (bleus et rouges). L’ajout de ce traitement abiotique ne pas perturber l’orientation ou l’optique principale de poils absorbants de la plantule.
Marqueurs supérieurs de grossissement fluorescents et d’imagerie peuvent servir d’image et de quantifier les changements de niveau organelle dans le développement de poils absorbants (Figure 2). Cyclose peut être vu dans un cheveu de la racine d’un (i) image contraste interférentiel différentiel et, dans un autre poil d’une plantule contenant un organite triple marqueur18, la trajectoire et la distribution spatiale des trois organites Golgi ii) (mCherry), (iii) peroxysomes (PCP) et (iv) mitochondries (YFP) il ressort de la projection de l’intensité maximale dans chaque panneau respectif. Le mouvement de ces trois organites est capturé dans une parcelle de distribution cumulative en Figure 2.
Figure 2 : caractérisation des poils absorbants et le traitement. Poils absorbants ont été quantifiés sur un cellulaire ln iveau de longueur (A), la densité et angularité pour n = 4 plants de type sauvage (WT) (barres d’erreur sont SD). Angularité est déterminée par l’angle entre la pointe de la racine principale et la pointe de cheveux de la racine avec la pointe de la racine principale définie comme la marque de 0°. (B), l’optique principale des poils de la racine reste inchangée (i) avant et (ii) après avoir traiter avec billes de polystyrène fluorescents (barre d’échelle = 100 µm). (C) Organelle quantification niveau attestent d’imagerie le (i) cytoplasmique d’une image de contraste interférentiel différentiel et, dans un poil distinct, la fluorescence des trois organites : appareil de Golgi (ii) (iii) peroxysomes et (iv) mitochondries (Echelle = 10 µm). Trajectoires de l’organite ont été visualisées par fusion d’images fluorescentes pris chaque s 23-32 pour 20 s. Les mouvements des trois organites étaient suivies automatiquement et les distributions cumulatives vitesse tracées sur la droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Le périphérique PDMS présenté ici n'a pas été lié chimiquement à une lamelle de verre, mais constitue plutôt un lien physique plus faible qui est créé lors de l’étape du passage à l’autoclave. Cela permet à l’appareil être démonté après que l’expérience d’imagerie optique est complète. Le dispositif PDMS peut-être être Pelé diagonalement, inversé et utilisé comme substrat pour l’imagerie non optiques résolution plus élevée de la morphologie de la racine (Figure 3 a). La plateforme tient idéalement la racine en place lors d’un contact avec un porte-à-faux au cours de la microscopie à force atomique (Figure 3 b). En outre, si le soin pendant le processus de démontage, poils absorbants restera en position sur le substrat PDMS. Cela ressort de l’optique de l’image de la racine avant le démontage (Figure 3) et après démontage de la plate-forme et le revêtement de la plantule dans une couche de chrome conductrice 20 nm pour l’imagerie avec un microscope électronique à balayage (Figure 3D ). Pour préserver davantage la plantule avant déconstruction de la plate-forme, un fixatif axée sur l’aldéhyde peut être injecté dans la plate-forme pour relier les protéines de tissus végétaux en place.
Figure 3 : dispositif déconstruction et imagerie non-optiques. (A), la plate-forme microfluidique peut être démonté et utilisé comme substrat pour les méthodes d’imagerie non optiques à haute résolution. (B), la topographie de surface (image de diffraction) de l’extrémité radiculaire de Arabidopsis thaliana est photographié à l’aide de la microscopie à force atomique mode de contact, échelle bar = 2 µm. L’emplacement du levier sur la racine est indiqué par une flèche noire sur l’encart, échelle bar = 100 µm. (C) image optique et (D) correspondant balayage Micrographie électronique de la plantule même avant et après l’appareil est démonté. Flèches mettent l’accent sur les poils qui ne sont pas perturbés, échelle bar = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode décrite dans cet article pour la création d’une plate-forme centrale-on-a-chip est unique car les deux couches design confins les poils absorbants pour un seul plan d’imagerie et de la plate-forme peut être déconstruits et utilisés comme substrat pour l’imagerie non optiques de haute résolution . Imagerie non optiques à haute résolution peut fournir des informations précieuses sur le tissu de la plante qui ne peut pas être obtenu de l’imagerie optique seul. Par exemple, l’imagerie AFM peut fournir des mesures de forces pour calculer l’élasticité des tissus de la racine au cours du développement ou après un traitement chimique ou biologique spécifique. De même, l’imagerie SEM peut fournir des détails à haute résolution de la topographie de la surface du tissu racinaire et, lorsqu’il est couplé avec l’imagerie chimique, peut fournir des informations sur la composition élémentaire des tissus. 19 les générations futures de cette plate-forme microfluidique comprendra optimisation pour assurer la compatibilité avec d’autres systèmes d’imagerie chimiques telles que la spectroscopie de masse/ionisation-désorption laser assistée par matrice (MALDI-MS) et cohérente anti-Stokes Raman spectroscopie (RAC).
Des étapes cruciales dans cette méthode impliquent l’utilisation de gélose pour fixer l’appareil et fournissent l’hydratation de la plante sans le besoin de procédures de l’écoulement des fluides complexes. Aussi veiller lors de déconstruire l’appareil PDMS du substrat de verre afin de garder la morphologie de la racine intacte. Si expérimental vise uniquement à faible à moyenne résolution optique d’imagerie sans la nécessité d’une déconstruction de l’appareil, la procédure peut être modifiée à bond chimiquement l’appareil sur le substrat de verre sous-jacent à l’aide de plasma d’oxygène. Une meilleure résolution des images optiques peuvent être obtenues sans retirer l’appareil de son environnement gnotobiotiques par collage chimiquement le PDMS directement dans un verre à fond plat de Pétri et ensuite agar verser autour le PDMS comme décrit précédemment.
La conception de 8 canaux secondaires de traitement a été une tentative de limiter les traitements à certaines régions de la racine. Cependant, cette conception ne réussit pas à empêcher la diffusion du traitement à d’autres domaines de la racine en raison de la conductance de la zone ouverte dans le canal de la racine principale. Afin de traiter localement la racine l’architecture du dispositif aura besoin d’être repensé afin de limiter les traitements ou le traitement devra être introduite par un média visqueux à ralentir temporairement diffusion tout au long de l’appareil.
Si il est souhaitable que les traitements expérimentaux à ajouter par l’intermédiaire de flux, modifications seront également nécessaires pour cette plateforme. Actuellement l’ajout de flux à tout les bras de mer de plate-forme entraîne l’expulsion de la semence de son entrée et de la difficulté à contrôler l’emplacement des traitements fluidiques. Cette méthode fonctionne bien pour semis vers le haut à une semaine d’âge. Il est limité en combien de temps les semis peuvent continuer à croître dans la plate-forme, en raison de la longueur du chenal principal. Futures modifications impliquera allongeant le chenal principal et incorporant plus 200 canaux haute µm pour les racines latérales tout en conservant la chambre haut de 20 µm pour le confinement de poils absorbants. Cette modification nécessitera des connaissances sur le lieu prévu d’émergence des racines latérales afin de concevoir un dispositif approprié.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce manuscrit a été écrit par UT-Battelle, LLC sous le contrat no. DE-AC05-00OR22725 avec l’US Department of Energy. Le gouvernement des Etats-Unis maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement des États-Unis conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondial pour publier ou reproduire le formulaire publié de Ce manuscrit, ou permettre aux autres de le faire, aux fins du gouvernement des États-Unis. Le Department of Energy fournira l’accès du public à ces résultats de recherche parrainé par le gouvernement fédéral conformément au Plan de l’accès Public DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Ce travail a été soutenu en partie par le programme de sciences génomiques, U.S. Department of Energy, Office of Science, biologique et recherche sur l’environnement, dans le cadre de la plante Microbe Interfaces scientifique Focus Area (http://pmi.ornl.gov). La fabrication des plateformes microfluidiques a été réalisée dans le laboratoire de recherche de Nanofabrication au Centre pour les Sciences des matériaux Nanophase, qui est un bureau d’installations de la Science utilisateurs DOE. JAA est soutenu par une bourse d’études supérieures de NSF DGE-1452154
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
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