Summary
ويرد نموذج ثقافة خلية مقاومة الشرايين، السماح بالتشريح لإشارات المسارات في البطانة، العضلات الملساء، أو بين البطانة والعضلات الملساء (ملتقى ميوندوثيليال). التطبيق الانتقائي ليضع أو عزل البروتين أو المجهر الإلكتروني الفلورة يمكن الاستفادة من استخدام هذا النموذج ثقافة الخلية.
Abstract
تقاطع ميوندوثيليال (ميج)، ميكرودومين مما يشير إلى فريدة من نوعها في القطر الصغير مقاومة الشرايين، يسلك التعريب من البروتينات المحددة وعمليات إرسال الإشارات التي يمكن التحكم في لهجة الأوعية الدموية وضغط الدم. كما هو إسقاط أما من الخلية البطانية أو العضلات الملساء، وسبب الصغيرة الحجم (في المتوسط، منطقة ~ 1 ميكرومتر2)، ميج من الصعب على الدراسة في عزلة. ومع ذلك، قمنا بتطوير نموذج ثقافة خلية تسمى الخلية الأوعية الدموية ثقافة المشارك (فككك) الذي يسمح في المختبر تشكيل ميج واستقطاب الخلية البطانية وتشريح لإشارات البروتينات والعمليات في جدار الأوعية الدموية للمقاومة الشرايين. فككك لديها العديد من التطبيقات، ويمكن تكييفها لتناسب أنواع مختلفة من الخلايا. النموذج يتكون من نوعين من الخلايا المزروعة على طرفي نقيض من عامل تصفية مع 0.4 ميكرومتر المسام فيها في المختبر ميس يمكن أن تشكل. هنا ونحن تصف كيفية إنشاء فككك عبر طلاء الخلايا وعزله بطانية، ميج، والكسور العضلات الملساء، التي يمكن استخدامها لعزل البروتين أو النشاط ثم فحوصات. يمكن أن تكون ثابتة عامل التصفية مع طبقات الخلية سليمة، جزءا لا يتجزأ، ومقطعة لتحليل إيممونوفلوريسسينت. الأهم من ذلك، العديد من الاكتشافات من هذا الطراز تم التأكد من استخدام الشرايين المقاومة سليمة، مما يؤكد أهميتها الفسيولوجية.
Introduction
في الشرايين مقاومة صغيرة القطر، يفصل الصفيحة مرنة داخلية رقيقة (IEL) بطانية (EC) وخلايا العضلات الملساء (SMC). الخلايا يمكن المشروع من خلال الثقوب في هذه المصفوفة مطاطا وإجراء اتصالات هيولى مباشرة عبر الفجوة تقاطع القنوات1،2. ويطلق على هذا الهيكل الفريد مفرق ميوندوثيليال (مج). ميج صغيرة (حوالي 0.5 ميكرون × 0.5 ميكرومتر، اعتماداً على السرير والأوعية الدموية) والإسقاط الخلوية مكونة أساسا من خلايا بطانية ولكن قد تنشأ من العضلات الملساء، فضلا عن3،4. وقد تظاهر عدد من المحققين تعقيدات هائلة مما يشير إلى الشبكات التي تحدث بشكل انتقائي في ميج، مما يجعله في موقع أهمية خاصة لتيسير إشارات ثنائية الاتجاه بين البطانة والعضلات الملساء5 ،،من67،،من89،10.
ومع ذلك، تشريح ميكانيكية من مسارات الإشارات في ميج أمر صعب في شريان سليمة. نظراً ميج إسقاطاً خلوية، من غير الممكن حاليا لعزل في فيفو ميج من جدار الأوعية الدموية. ولهذا السبب، تم تطوير نموذج فككك1 . الأهم من ذلك، فككك يتطابق مورفولوجيا غشائي الفسيولوجية11 واستقطاب الإشارات بين قمي وأجزاء ميج الخلية12. كان هذا النموذج الفريد التي تسهل اكتشاف أن الهيموغلوبين ألفا في الخلية بطانية، الاستقطاب إلى ميج. هذا على النقيض من خلايا بطانية المستزرعة تقليديا التي لا تعبر عن الهيموغلوبين ألفا13. للباحثين المهتمين في البطانة ميكروفاسكولار، قد يكون من الأنسب استخدام الخلايا البطانية التي قد تم مثقف في فككك، خاصة إذا كان القصد هو تشريح مسارات الإشارات التي تحدث في الشرايين مقاومة صغيرة القطر.
استخدام قوي إدراج بلاستيكية تحتوي على عامل تصفية مع مسام صغيرة القطر (0.4 ميكرومتر في القطر) لأنواع الخلايا المتميزة ثقافة المشارك الثاني يمنع الخلايا من الهجرة بين الطبقات. أنه يؤدي إلى مسافة 10 ميكرون بين الخلايا، والتي هي أطول بكثير في فيفو، ولكن لا يزال يتطابق العديد من الخصائص في فيفو ميس، بما في ذلك الترجمة البروتين ورسول الثاني يشير إلى1 , 14-وبالإضافة إلى ذلك، يسمح فككك لاستهداف الخلية إشارات عن طريق إضافة مؤثر أو خصم لحجرة الهاتف الخلوي محددة خاصة بنوع. على سبيل المثال، تحميل الجماعة الأوروبية مع باتا-صباحا يخلب الكالسيوم، وحفز SMC مع فينيليفريني14. وعلى النقيض من الأوصاف الأخرى من ثقافة المشارك15،نماذج16،18،17،19،،من2021، وهذا يوفر تعليمات بشأن عزل الكسور متميزة مرناً والبروتين، بما في ذلك الكسر مج متميزة داخل المسام عامل التصفية. الإضافة لهذه التقنية فككك يسمح للتحقيق محددة من التغييرات في التعريب مرناً أو النسخ22والبروتين الفسفرة12،23و نشاط البروتين12. هذه المادة سوف تصف الطلاء من الجماعة الأوروبية على رأس عامل التصفية و SMC في الجزء السفلي، على الرغم من أن من الممكن أن الثقافة أنواع الخلايا اثنين في والتشكلات المختلفة11،،من1824.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-"طلاء الخلايا" فككك
- الثقافة كبير 225 سم 2 قوارير من المفوضية الأوروبية و SMC تحت ظروف معقمة في 37 درجة مئوية، حتى روافد 70-90%. ضمان أن تستخدم المفوضية الأوروبية أكثر من SMC؛ في حالة استخدام المفوضية الأوروبية البشرية الأولية و SMC، عادة 3 قوارير كبيرة من المفوضية الأوروبية إلى 1 قارورة كبيرة من SMC.
استخدام الخلايا الأولية في الممرات السفلي
- ولا تستخدم في الماضي مرور 10. اختيار وسائل الإعلام ثقافة تستند إلى خلايا لتكون مثقف المشترك. للابتدائي الشريان التاجي البشرية "المفوضية الأوروبية"، استخدام الوسائط القاعدية EC EBM-2 مع عوامل النمو EGM2 MV. للابتدائي SMC التاجي البشري، استخدام الوسائط القاعدية SMC سمبم مع عوامل النمو سمجم-2. قبل استخدام مع الخلايا المستزرعة، إضافة عوامل النمو لوسائل الإعلام-
- البناء من 1 يوم فككك: رش أطباق بتري كبيرة (150 مم) وأغطية بمطهر (مثلاً، كافيسيدي) ومسح بعيداً مع منشفة ورقية أو مناديل خالية من الوبر. ثم رش أطباق بيتري مع 70% إيثانول (EtOH) ووضعها في غطاء محرك السيارة للهواء الجاف-
- فتح لوحة إدراج عامل تصفية (انظر الجدول للمواد) تحت ظروف معقمة، ومعطف الجانب SMC (الجانب السفلي من تصفية) يضاف مع الحل فيبرونيكتين. حفظ في الإدراج في لوحة 6-كذلك قدمت، الشقوق بيبيت فيبرونيكتين الحل من خلال الجانب إلى الجزء السفلي من اللوحة، مع التأكد من أن يغطي الجزء السفلي نصف عامل التصفية (لا يزيد عن 1 مل)-
- بعد 30 دقيقة من المعاملة مع الحل فيبرونيكتين في درجة حرارة الغرفة في هود ثقافة الخلية، تأخذ إدراجات خارج اللوحة، وفراغ أي حل الزائدة، والعكس، وضع في الجزء السفلي نصف طبق بيتري نظيفة. توضع جانبا. تأكد من عدم الإزعاج الغشاء إدراج عامل التصفية عند المص الحل الزائدة؛ وهذا يمكن تجنبها بلطف إمالة اللوحة، وكنس الحل بعيداً عن حافة الإدراج. قارورة تريبسينيزي 225 سم 2
- من SMC مع 3 مل من حرارة قبل حل X التربسين-يدتا 2، وحالما رفعت الخلايا خارج اللوحة، إضافة الوسائط SMC مل 9 لتحييد التربسين (3:1، وسائل الإعلام: التربسين). نقل إلى أنبوب مخروطي، وتخلط جيدا، وبيبيت 10 ميليلتر على هيموسيتوميتير لتحديد عدد الخلايا- مربعات
- عد عدد الخلايا في 5 × 5 (أي، 18)، اضرب هذا ب 10 آلاف للحصول على العدد الخلايا في 1 مل (180,000). ثم اضرب 12 مل (الحجم الإجمالي لتعليق خلية، SMC 2.16 مليون). التأكد من أن هناك ما يكفي SMC لوحة العدد المطلوب من الآبار-
ملاحظة: على سبيل المثال، 1 ينبغي أن يكون جيدا 75,000 SMC وهكذا سيكون 18 بئرا SMC مجموع 1.35 مليون. تقسيم الخلايا 1.35 مليون مطلوبة من قبل الخلايا 180,000 كل 1 مل، وهذا يؤدي إلى 7.5 مل تعليق الخلية التي ستكون هناك حاجة للطلاء. ثم حساب حجم النهائية اللازمة (ميليلتر 18 بئرا x 750 = 13.5 مل). وهكذا، يأخذ 7.5 مل تعليق خلية، إحضار وحدة التخزين تصل إلى 13.5 مل مع حرارة قبل SMC وسائط الإعلام، ومزيج جيد. - ميليلتر 750 لوحة تعليق الخلية التي تحتوي على حوالي 75,000 SMC على الجانب السفلي لكل مرشح، مع الحرص على عدم تسرب أي حل الوسائط والخلية. ضع الغطاء على أعلى ونقل بعناية طبق بيتري مع تدرج في الحضانة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: سوف تحتاج إلى كثافة الخلية المثلى لأنواع الخلايا الأخرى يحدد تجريبيا. - في اليوم 2، ملء الأطباق نظيفة 6-جيدا مع 2 مل الطازجة، تحسنت قبل SMC وسائط الإعلام. إزالة اللوحات من الحاضنة. تأخذ تدرج بها في وقت واحد وقم بإزالة الوسائط بالشفط، ثم وضع في الطبق 6-جيدا مع وسائل الإعلام SMC.
- معطف الجانب المعاكس لعامل التصفية (EC الجانب) مع 1 مل حلاً الجيلاتين البقري 0.5% لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية.
- تريبسينيزي flask(s) 2 سم 225 من المفوضية الأوروبية مع 3 مل من حرارة قبل 2 X التربسين-يدتا (10 x المخفف في دولبيكو العقيمة ' s برنامج تلفزيوني) الحل، بالتنصت على لطيف من قارورة من أجل رفع الخلايا خارج اللوحة.
ملاحظة: قد يكون من الضروري لوضع في قارورة مرة أخرى في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقيقة.- مرة رفعت الخلايا خارج اللوحة، إضافة الوسائط EC 9 مل لتحييد التربسين (3:1). نقل إلى أنبوب مخروطي، تجمع معا، وتخلط جيدا، وبيبيت 10 ميليلتر على هيموسيتوميتير لتحديد عدد الخلايا.
مربعات
- عد عدد الخلايا في 5 × 5 (أي 60)، اضرب هذا ب 10 آلاف للحصول على العدد الخلايا في 1 مل (600,000). ثم اضرب 12 مل (الحجم الإجمالي لتعليق خلية، 7.2 مليون من دولارات شرق الكاريبي). التأكد من أن هناك ما يكفي من المفوضية الأوروبية لوحة العدد المطلوب من الآبار-
ملاحظة: مطلوبة EC 360,000 تقريبا كل بئر. على سبيل المثال، تتطلب 18 بئرا 6.48 مليون الجماعة الأوروبية. تقسيم الخلايا 6.48 مليون مطلوبة من قبل المفوضية الأوروبية 600,000 كل 1 مل، وهذا يؤدي إلى 10.8 مل تعليق الخلية التي ستكون هناك حاجة للطلاء. ثم حساب حجم النهائية اللازمة (الآبار 18 × 1 مل = 18 مل). وهكذا، تتخذ 10.8 مل تعليق خلية، تجلب الحجم يصل إلى 18 مل مع استعد مسبقاً وسائل الإعلام الأوروبية، ولطف ريسوسبيند.
- عد عدد الخلايا في 5 × 5 (أي 60)، اضرب هذا ب 10 آلاف للحصول على العدد الخلايا في 1 مل (600,000). ثم اضرب 12 مل (الحجم الإجمالي لتعليق خلية، 7.2 مليون من دولارات شرق الكاريبي). التأكد من أن هناك ما يكفي من المفوضية الأوروبية لوحة العدد المطلوب من الآبار-
- مرة رفعت الخلايا خارج اللوحة، إضافة الوسائط EC 9 مل لتحييد التربسين (3:1). نقل إلى أنبوب مخروطي، تجمع معا، وتخلط جيدا، وبيبيت 10 ميليلتر على هيموسيتوميتير لتحديد عدد الخلايا.
مربعات
- بلايت 1 مل من المفوضية الأوروبية 360,000 على الجانب العلوي لكل مرشح إدراج. السماح للخلايا احتضانها دون عائق في 37 درجة مئوية للمتوسط استبدال 24 حاء في يوم 4. الحصاد في يوم 5-
2. حصاد الكسور من فككك
- القيام بالعزلة في غرفة 4 درجات مئوية وتبقى جميع الصكوك في مدت نأخذ في الاعتبار عدد إدراج فرادى عزل
- وإضافة تحلل المخزن المؤقت إلى أنبوب 50 مل المسمى ميج (للمرشحات معزولة). ثم قم بتسمية اثنين من الأطباق 10 مم؛ للمفوضية الأوروبية وآخر لتصريح خاص.
- ضبط حجم المخزن المؤقت لتحلل تبعاً لمركزه كيف يجب أن يكون ليساتي؛ 15 إدراج، 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت للأنبوب مج و 250 ميليلتر كل طبق بيتري هو أوصت.
- العمل مع لوح 6-بئر واحد من إدراج في وقت واحد. شفط قبالة المتوسطة في خلية ثقافة هود ثم نقل إلى غرفة باردة على مدت
ملاحظة: الإرشادات التالية لإدراج 1 العزلة. - بيبيت 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x على الجانب SMC للإدراج.
- استخدام الرافعة خلية كشط أسفل الخلايا إلى نهاية واحد من الإدراج، ونقل الخلايا من الرافعة إلى طبق بتري SMC يحتوي المخزن المؤقت لتحلل في إجرائه.
- مرة واحدة قد لمست رافع خلية تفسخ المخزن المؤقت في الطبق، لا يسمح لها أن تلمس عامل التصفية إدراج حتى أنه تم محوها تماما وتجفف على مناشف ورقية. كرر إلغاء عامل التصفية SMC على الأقل واحد لمرتين لإزالة الأنقاض خلية SMC المتبقية تماما. تحويل
- إدراج أكثر وبيبيت 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x إلى الجانب العلوي/EC لإدراج عامل التصفية. كرر الخطوتين 2.6 و 2.7 مع مكشطة خلية وطبق بيتري المفوضية الأوروبية-
- جمع الخلايا المتبقية والملاط برنامج تلفزيوني من جانب الجماعة الأوروبية لعامل التصفية باستخدام ماصة ونقل إلى طبق "بتري المفوضية الأوروبية" مع المخزن المؤقت لتحلل. أن يكون دقيقا جداً في إلغاء الخلايا من كلا الجانبين لعامل التصفية فيما يتعلق بترك الحد الأدنى EC/SMC التلوث في الكسر ميج-
- استخدام بعناية دون مشرط لقطع عامل التصفية من إدراج بلاستيكية. القيام بذلك بقطع 70-80% منه بعيداً عن البلاستيك واستخدام الملقط لسحب عامل التصفية تماما قبالة هيكل إدراج بلاستيكية. وضع عامل التصفية في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل المسمى ميج مع المخزن المؤقت لتحلل، والتأكد من أنه يجلس في المخزن المؤقت لتحلل ولا يزال الرطب.
- كرر الخطوات العزلة، في مجموعات من 6، حتى تم تجهيز كل من إدراج-
- ضمان الاحتفاظ بمجموعات مختلفة من العلاج في أنابيب منفصلة والاطباق.
- دوامة ميج 50 مل الأنبوبة المخروطية في كامل قوتها لمدة 15 ثانية أو حتى تمتزج جيدا. إزالة عوامل التصفية من ميج المخروطية مع الملقط، سحبها على طول الجدران الجانبية للأنبوب فيما يتعلق بترك الحد الأقصى لمقدار البروتينات والسائل في الأنبوب. وبعد هذه النقطة، تجاهل عوامل التصفية- هل
- بمجرد إزالة كافة عوامل التصفية من الأنبوبة المخروطية ميج، الدوران السريع (10-15 ثانية في أقصى سرعة x ~ 16,000 ز) في أجهزة الطرد مركزي لسحب جميع السوائل والبروتينات للجزء السفلي من الأنبوب. نقل محتويات الأنبوبة ميج وأطباق بيتري SMC والمفوضية الأوروبية إلى أنابيب الطرد المركزي منفصلة وأصغر حجماً.
- اختياري: Sonicate محتويات الأنابيب مج/SMC/EC على إعداد 4 لنبضات s 10 ثلاثة على الجليد أو مجانسة بلطف باليد.
- الطرد المركزي في أقصى سرعة (x ~ 16,000 ز) 15 دقيقة في 4 ° بيبيت جيم من المادة طافية والاعتداء للمحتوى البروتين باستخدام أسلوب الفحص بيسينتشونينيك.
3. الحصاد في فككك الوجه En الفلورة
- "في اليوم من 5 من فككك" الحضانة، إزالة إدراج من الحاضنة. يعمل في خلية ثقافة هود، شفط قبالة SMC وسائط الإعلام من كل من الآبار أقل من إدراج عامل التصفية والشطف مرتين مع برنامج تلفزيوني 1 x. كرر مع الجانب EC-
- الحفاظ إدراج سليمة وفي اللوحة، إضافة بارافورمالدهيد 4% (PFA) لمدة 10-20 دقيقة في حجرة حجرة 4 درجات مئوية على شاكر لطيف. يغسل كلا الجانبين من إدراج عامل التصفية مع 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق وكرر مرتين.
تنبيه: منهاج عمل بيجين سامة ويجب أن تعالج بعناية. - أداء إينكوبيشنز جسم حظر والابتدائي والثانوي في اللوحة، ضمان الاحتفاظ بكلا الجانبين لعامل التصفية في الجسم + عرقلة الحل (9 مل برنامج تلفزيوني، 25 ميليلتر تريتون X100، ألبومين المصل البقري 50 ملغ، 500 ميليلتر المصل العادي)
- إلى جبل عامل التصفية على شريحة، قص عامل التصفية من إدراج بلاستيكية مع مشرط شنت على مكان على شريحة مجهر مع تصاعد المتوسطة والتعامل مع.
4. الحصاد في فككك "عرضية الفلورة"
- "في اليوم من 5 من فككك" الحضانة، إزالة إدراج من الحاضنة. شفط إيقاف الوسائط من كلا الجانبين لإدراج عامل التصفية في هود ثقافة الخلية وشطف كل جانب من عامل التصفية مرتين مع برنامج تلفزيوني س 1-
- الحفاظ إدراج سليمة وفي لوحة 6، حسنا، إضافة 4% منهاج عمل بيجين واحتضان بين عشية وضحاها في غرفة حجرة 4 درجات مئوية على شاكر لطيف.
تنبيه: منهاج عمل بيجين سامة ويجب أن تعالج بعناية.
5. التضمين في فككك "عرضية الفلورة"
- قد تم إصلاحها بعد تصفية إدراجات لقرابة 24 ساعة في 4% منهاج عمل بيجين ونقل إلى 70% EtOH لمالا يقل عن 24 ساعة، ولكن ما يصل إلى عدة أسابيع. عملية
- عوامل التصفية على فترة طويلة (بين عشية وضحاها) تشغيل على معالج نسيج الآلي. استخدام البرنامج على النحو التالي: 70% البارافين EtOH عن 30 دقيقة، 85% EtOH 30 دقيقة، 95% EtOH 30 دقيقة، 100% EtOH 30 دقيقة، EtOH 45 دقيقة بنسبة 100%، 100% EtOH 45 دقيقة، زيلين نفط 30 دقيقة، زيلين نفط 30 دقيقة، زيلين نفط 45 دقيقة، 60 درجة مئوية و 30 دقيقة، البارافين 60 درجة مئوية و 30 دقيقة ، 60 درجة مئوية البارافين 45 دقيقة
- بعد المعالجة، نقل عوامل التصفية المقطوع إلى مركز الدمج في البارافين السائل، حفظ عامل التصفية في الكاسيت.
- إزالة عامل التصفية من الكاسيت، بعناية باستخدام الملقط لأنه عقد فقط عند الحافة. مع مقص، قص عامل التصفية في نصف، تشكيل دائرية شبه اثنين على شكل نصفين. وضع كل من نصفي 2 في جزء لوحة الباردة في محطة التضمين فقط منذ فترة طويلة كافية لملء تضمين العفن مع البارافين السائل-
- مرة واحدة بإيجاز شديد مليئة بسائل البارافين، لمس العفن تضمين لوحة الباردة، ثم تضمين كل نصف من عامل التصفية إلى تضمين العفن (قطع الجانب)؛ وهذا ما يضمن أن خلال تمزيقها، واحد سيتم قطع من وسط عامل التصفية نحو حافة .
- خلال التضمين، استخدام الملقط لإجراء التصفية لمنع النصفين من الوقوع في بعضها البعض حتى البارافين بارد ما يكفي لكي تقف بمفردها. نقل القالب تضمين لوح باردة حتى توطد تماما.
ملاحظة: تبريد القطع على صواني الجليد يساعد على منع التجاعيد المقاطع.
6. تمزيقها وتلطيخ فككك "عرضية الفلورة"
- لكتل البارافين تمزيقها وشريحه متزايدة: قص 5 ميكرومتر الأقسام ووضع المقاطع في حمام مائي 42 درجة مئوية وتلتقط مقاطع استخدام مشحونة بشكل إيجابي الشرائح. ثم نضع الشرائح بين عشية وضحاها في فرن 42 درجة مئوية لتجف.
- قبل بداية الخطوات الإماهة، خبز الشرائح عند 60 درجة مئوية تذوب في البارافين ويساعد التقيد المقاطع فككك إلى الشريحة. بارد بإيجاز، ثم ترطيب الشرائح من خلال التغييرات اثنين من زيلين نفط، 100% EtOH، 95% EtOH، تغيير واحد من 70% EtOH، واثنين من التغييرات من ماء مقطر.
- تجنب أساليب استرجاع مستضد تنطوي مايكرويف أو تدفئة كما المقاطع قد تقع خارج الشريحة. حظر القياسية لح 1 في درجة حرارة الغرفة، ثم في الحضانة بين عشية وضحاها مع جسم الأولية في 4 درجات مئوية، تليها
- إجراء الغسيل الخطوات وجسم الثانوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة. جبل مع وسائل الإعلام المتزايدة وساترة-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يكون إدراج عامل التصفية المستخدم فككك الصغيرة، 0.4 ميكرومتر الثقوب. ويبين الشكل 1A، نظرة الوجه أون لاقحم تصفية فككك، المسام التي يمكن أن تشكل ميج في المختبر. ويصور التخطيطي خلايا العضلات الملساء المطلية على الجانب السفلي من عامل التصفية بيوم واحد قبل أن يتم مطلي خلايا بطانية على الجانب المعاكس (الشكل 1B). حالما يتم مطلي بالخلايا، يمكن أن تكون الكسور EC ومج SMC معزولة بعد ثلاثة أيام. ويرد مثال ذلك في الشكل 2 ألف، حيث أعربت مثبط منشط البلاسمينوجين 1 (أي-1) عن درجة عالية في الكسر ميج بالنسبة إلى بقية الجماعة الأوروبية، الذي يعتبر أيضا في فيفو ميس25. وتبين هذه البيانات الأداة المساعدة من فككك في حظيا جدار الأوعية الدموية أرتيريولار سليمة.
ويتجلى التالية فككك الفلورة والمجهر الإلكتروني. ويترك في فككك سليمة وثابتة مع منهاج عمل بيجين الفلورة عرضية. ويبين الشكل 3 ألف مستقبلات ادريناليه ألفا-1 محددة العضلات الملساء ومستقبلات غشائي براديكينين محددة. تلوين فالويدين من أكتين و يظهر الجسور أكتين في ميج (السهم الأبيض) بين الخليتين، الذي يتطابق تعبير ينظر في الشرايين سليمة26. في الشكل 3B، قطاعا عريضاً من فككك كما يراها مجهر إلكتروني ويتجلى، الذي هو المقدمة في 3D في الشكل 3. هذه الآراء من فككك إثبات قدرته على ترجمة على وجه التحديد البروتينات والمستقبلات، وأولتراستروكتوري إلى في المختبر ميجس.
رقم 1: تصفيح ثقافة المشارك خلايا الأوعية الدموية (فككك)- (أ) الوجه En الضوء صورة مجهرية المسام في إدراج عامل تصفية. السهام السوداء تدل على ثقوب الفردية. (ب) التخطيطي للطلاء فككك. 1 اليوم يظهر انعكاس لإدراج عامل تصفية وتصفيح SMC في الجزء السفلي. في اليوم 2، يتم مطلي الجماعة الأوروبية على الجانب المعاكس من عامل التصفية وفككك يظل في هذه المطابقة في لوحة 6-جيدا حتى موسم الحصاد. تشير الأسهم البيضاء إلى الجانب للتصفية حيث يتم مطلي الخلايا وسوف تنمو. مقياس بار = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الإثراء البروتين في ميج- (أ) صورة المجهر الإلكتروني المناعية-انتقال الشريان الماوس مع التعبير عن ألفا جلوبين في ميج (حبات الذهب التي تبدو كنقاط سوداء). (ب) لطخة غربية عرض مثبط منشط البلاسمينوجين 1 (أي-1) إثراء التعبير في الكسر مج مقابل الكسور EC أو SMC. المفوضية الأوروبية البلاستيك يشير إلى المفوضية الأوروبية نمت على طبق بلاستيك، التي لا تشكل مج. مقياس بار = 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الفلورة عرضية والمجهر الإلكتروني في مقاطع عرضية فككك. (أ) ستاينينج للعضلات الملساء وبروتينات محددة بطانية. واو-أكتين تلطيخ في جميع أنواع الخلايا و في المختبر مج (السهم الأبيض). مثال على الميكروسكوب الإلكتروني المستخدمة لدراسة أولتراستروكتوري في المختبر ميجس في 2D (ب) و (ج). 3D شريط المقياس = 10 ميكرون (A)؛ 2.5 ميكرون (ب)؛ وحوالي 2.5 ميكرون الرأسي والأفقي 0.5 ميكرومتر (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فككك يحتوي على عدد من المزايا من حيث حظيا ميس في المختبر، ولكن هناك نقاط المناقشة عند تحديد إذا فككك يمكن أن تستخدم لتطبيق معين. على سبيل المثال، إذا كانت أنواع مختلفة من الخلايا لاستخدامها مع هذا النموذج، سوف تحتاج إلى الأمثل. وقد استخدمنا خلايا الإنسان الأولية، لكن من الممكن عزل الخلايا من أورتاس البقري24، أو الفئران wildtype أو خروج المغلوب، واستخدامها في5،1،فككك14.
إذا كان استخدام فككك لعزل ميج، هو الأسلوب الأكثر أهمية لإتقان إلغاء شامل لعامل التصفية لضمان أن لا يتم تبديل نقاء الكسر ميج بفائض من خلايا بطانية أو العضلات الملساء. أننا أظهرنا عبر النشاف الغربية أن ألفا من خضاب الدم هو علامة أفضل من "نقية" العزلة مج13، كما ينبغي أن يكون بقوة أعربت عنه في الكسر مج مقابل الكسر الخلية البطانية. آخر هو بأي-1، التي تنظم تشكيل ميج (الشكل 2)25. أننا نشعر أن هذه قد تكون علامات جيدة وخاصة لعزله مج قوية. لثقة إضافية في تقنيات الحصاد، عوامل التصفية قد أبقى بعد إلغاء للحصاد، والملون للجماعة الأوروبية/SMC علامات25.
التصوير التعبير البروتين في فككك يمكن أن يؤديها بطريقتين رئيسيتين هما: الوجه أون (الشكل 1A) أو عرضي (الشكل 3). تسمح كل الاستعدادات لتصور البروتينات داخل الثقوب لعامل التصفية من منظورين مختلفين. الأسلوب الوجه أون الذي ينطوي على الشرايين التي هي قطع مفتوحة طوليا ويعلق ثم خارج الشقة، مع المفوضية الأوروبية التي تواجه، على تصور أحادي الطبقة EC والثقوب في IEL، المكان الوحيد الذي يمكن أن يشكل فيها ميج. يشير إشارة مضيئة داخل الثقوب IEL تعريب البروتين داخل10،ميج27. يمكن ترجمة هذا المبدأ نفسه إلى فككك بالتصوير المونولاير المفوضية الأوروبية من أعلى، دون الحاجة إلى تضمين ذلك في البارافين أو جعل الأقسام. طريقة عرضية أكثر تعقيداً للماجستير ولكن حاسم بالنسبة للتصور متميزة من البروتينات في المفوضية الأوروبية مقابل مونولاييرس SMC (الشكل 3).
عدم التدفق أو تمدد في النظام حد من محتمل، ولكن من الممكن إضافة تدفق في العضلات الملساء غشائي خلية ثقافة المشارك16،19. ويبدو تسمح الشروط ثابتة لا يزال للتعبير البروتين دقيقة من الناحية الفسيولوجية والتنشيط، حيث قد يكون من أن جهة الاتصال هيتيروسيلولار هو أهم عامل في تشريح مج مما يشير إلى مسارات.
وهناك العديد من التطبيقات لهذا الأسلوب وراء المقاومة الشريان مما يشير إلى فككك لا تقتصر بالضرورة على أنواع محددة من الخلايا. نماذج الثقافة المشارك أخرى قد استخدمت خلايا بطانية ثمرة وخلايا الاوستيوبلاستس17، أو على غرار حاجز الدم في الدماغ مع بطانية واشتركت الثقافات بيريسيتي/أستروسيتي21. يمكن أيضا قياس ورم خبيث خلايا السرطانية عن طريق البطانة باستخدام هذا النموذج21. من الممكن أيضا أن تنمو خلايا على عامل تصفية وثقافة خلية أخرى اكتب في الجزء السفلي من الطبق 6-جيدا لاختبار الإشارات paracrine، أو تنمو خلايا بطانية في الجزء العلوي من الغشاء إلقاء نظرة على استقطاب الخلية (ملاحظاتنا غير منشورة). ويمكن إضافة الكريات البيضاء أو الخلايا الأخرى المتداولة لوسائل الإعلام الأوروبية والتصاق الخلايا يمكن أن يكون كمياً12. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها في فككك للتحقيق في الأمراض مثل العضلات الملساء الهجرة24 والانتشار في الاستجابة إلى إصابة غشائي15،18.
وفي الختام، قدمنا طريقة لعزل ميج من المختبر خلية ثقافة نظام، الذي يسمح للتحقيق في إشارات العمليات بين نوعين خلية يزوج. الأهم من ذلك، منظومة الثقافة المشتركة لا يقتصر على دراسة ميج ويمكن أن تكون ذات قيمة للإجابة على عدد من الأسئلة، لا سيما تلك التي تنطوي على الاتصال هيتيروسيلولار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيده هذا العمل "الوطني للقلب"، الرئة والدم المعهد منح 14PRE20420024 زمالة بريدوكتورال R01088554، T32HL007284، وجمعية القلب الأمريكية. ونشكر خصوصا "سانت جود الخلوية التصوير المشتركة البحوث الأساسية"، بما في ذلك ويكفيلد راندال وهورنر ليندا لصور المجهر الإلكتروني، وآدم ستراوب للمساعدة مع الصور الفلورة الممثل واغر Pooneh لها تعليقات قيمة على البروتوكول المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
