Summary
Se describe un modelo de cultivo celular de las arterias de resistencia, lo que permite la disección de la señalización de vías en el endotelio, músculo liso, o entre el endotelio y músculo liso (el cruce de myoendothelial). Puede utilizar la aplicación selectiva de agonistas o aislamiento de la proteína, microscopia electrónica o inmunofluorescencia usando este modelo de cultura de célula.
Abstract
La ensambladura de myoendothelial (MEJ), un único microdomain señalización en arterias de resistencia de pequeño diámetro, exhibe la localización de proteínas específicas y procesos de señalización que controlan el tono vascular y la presión arterial. Ya que es una proyección desde la célula endotelial o músculo liso y gracias a su pequeño tamaño (en promedio, un área de ~ 1 μm2), lo MEJ es difícil estudiar en aislamiento. Sin embargo, hemos desarrollado un modelo de cultura de célula llamado vascular co cultivo celular (VCCC) que permite en vitro formación MEJ, polarización de la célula endotelial y la disección de la señalización de las proteínas y los procesos de resistencia de la pared vascular arterias. El VCCC tiene multitud de aplicaciones y se pueden adaptar a diferentes tipos de células. El modelo consiste en dos tipos de células cultivados en lados opuestos de un filtro con poros de μm 0,4 en el que los de vitro MEJs puede formar. Aquí describimos cómo crear VCCC mediante placas de células y el aislamiento de endotelial, MEJ y fracciones de músculo liso, que pueden utilizarse para aislamiento de proteína o actividad ensayos. El filtro con capas de la célula intactas puede ser fijas, encajado y seccionado para análisis inmunofluorescente. Lo importante es que, muchos de los descubrimientos de este modelo han confirmado mediante las arterias de resistencia intacta, subrayando su importancia fisiológica.
Introduction
En arterias de resistencia de diámetro pequeño, una delgada Lámina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) y células de músculo liso (SMC). Las células pueden proyectar a través de agujeros en esta matriz elástica y hacer conexiones citoplásmicas directas via gap junction canales1,2. Esta estructura única se denomina al cruce myoendothelial (MEJ). El MEJ es un pequeño (aproximadamente 0,5 μm x 0,5 μm, dependiendo de la cama vascular), proyección celular integrado predominante por las células endoteliales pero puede originar de músculo liso así como3,4. Un número de investigadores ha demostrado la inmensa complejidad de señalización a redes que ocurre selectivamente en el MEJ, haciéndola un lugar especialmente importante para facilitar la señalización bidireccional entre endotelio y músculo liso5 ,6,7,8,9,10.
Sin embargo, es difícil en una arteria intacta una disección mecanicista de vías de señalización en el MEJ. Porque lo MEJ es una proyección celular, no es actualmente posible aislar un en vivo MEJ de la pared vascular. Por esta razón, se desarrolló el VCCC modelo1 . Lo importante, el VCCC Replica fisiológica morfología endoteliales11 y polarización de la señalización entre el apical y MEJ porciones de la célula12. Fue este modelo único que facilitó el descubrimiento de que la hemoglobina alfa es en la célula endotelial, polarizó a la MEJ. Esto está en contraste con las células endoteliales cultivadas convencionalmente que no expresan alfa hemoglobina13. Para los investigadores interesados en el endotelio microvascular, puede ser más apropiado utilizar las células endoteliales que han sido cultivadas en el VCCC, particularmente si la intención de diseccionar las vías de señalización que ocurren en las arterias de resistencia de diámetro pequeño.
Mediante un inserto de plástico resistente que contiene un filtro con poros de diámetro pequeño (0,4 μm de diámetro) a tipos de células distintas de cultura Co dos impide que las células migran entre capas. Resulta en una distancia de 10 μm entre las células, que es significativamente mayor que en vivo, pero todavía muchas de las características en vivo de MEJs, incluyendo localización de la proteína y segundo mensajero señalización1 Replica , 14. Además, el VCCC permite la selección de células específicas del tipo de señalización mediante la adición de un agonista o antagonista del compartimiento celular específica. Por ejemplo, cargando la CE con BAPTA-AM quelar calcio y estimulando el SMC con fenilefrina14. En contraste con otras descripciones de co-cultivo modelos15,16,17,18,19,20,21, esto proporciona instrucciones de aislar las distintas fracciones de mRNA y proteína, incluyendo la fracción MEJ distinta dentro de los poros del filtro. La incorporación de esta técnica la VCCC permite la investigación específica de los cambios en la localización de mRNA transcripción22proteína phosphorylation12,23y proteínas actividad12. Este artículo describe una galjanoplastia de la CE en la parte superior del filtro y SMC en la parte inferior, aunque es posible cultivar los dos tipos celulares en diferentes conformaciones11,18,24.
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Protocol
1. células de la galjanoplastia para el VCCC
- grande 225 cm 2 frascos de cultivo de EC y SMC en condiciones estériles a 37 ° C, hasta 70-90% confluente. Garantizar que se utilizan más CE que SMC; Si se utiliza CE humano primario y SMC, típicamente 3 frascos grandes de CE a 1 frasco grande de SMC.
- Usar pilas en pasos inferiores y no use más allá del paso 10. Elegir los medios de cultivo basados en células para ser cultivadas conjuntamente. Para primaria humana coronaria CE, utilice EBM-2 EC media basal con factores de crecimiento EGM2 MV. Para SMC coronaria humana primaria, utilice medios basales SmBM SMC con factores de crecimiento 2 SmGM. Antes de su uso con células cultivadas, añadir factores de crecimiento a los medios de comunicación.
- Construcción del VCCC día 1: Spray de Petri grandes (150 mm) y tapas con desinfectante (por ejemplo, Cavicide) y limpie con una toalla de papel o trapos libres de pelusa. Luego rociar las cajas Petri con 70% de etanol (EtOH) y dejar en la capilla al aire libre.
- Abra la placa de insertos de filtro (véase la Tabla de materiales) bajo condiciones estériles y cubrir el lado SMC (parte inferior del filtro) del inserto con la solución de fibronectina. Teniendo el inserto en la placa de 6 pozos proporcionada, pipeta de la solución de la fibronectina a través de la raja en la parte inferior de la placa, asegúrese de que la parte inferior la mitad del filtro es cubierto (no más de 1 mL).
- Después de 30 min de tratamiento con solución de fibronectina en la temperatura en la campana de cultura celular, tener insertos de la placa, vacío cualquier exceso de solución y de invertir, colocar en la parte inferior de la mitad de la caja de Petri limpia. Ponga a un lado. Asegúrese de no molestar a la membrana del filtro del parte movible al aspirar el exceso de solución; Esto puede evitarse por inclinación de la placa y aspirar la solución fuera del borde de la inserción.
- Trypsinize 225 cm 2 frasco de SMC con 3 mL de solución de tripsina-EDTA X 2 precalentado, y una vez las células han levantado fuera del plato, agregar medios SMC de 9 mL para neutralizar la tripsina (3:1, medios de comunicación: tripsina). Transferir a un tubo cónico, mezclar bien y pipetee 10 μL en un hemocitómetro para determinar el numero de celular.
- Cuenta el número de celdas de 5 x 5 cajas (es decir, 18), multiplica esto por 10.000 para obtener el número de células en 1 mL (180.000). Luego multiplique por 12 mL (volumen total de la suspensión celular, SMC 2,16 millones). Asegurar que hay suficiente SMC para el número deseado de pocillos de la placa.
Nota: por ejemplo, 1 también deben tener 75.000 SMC y así 18 pozos tendría SMC total 1,35 millones. Dividir las células 1,35 millones necesitadas por 180.000 células por mL 1 y esto se traduce en 7,5 mL de la suspensión de células que se necesitan para la galjanoplastia. Luego calcular el volumen final necesario (18 pozos x 750 μl = 13,5 mL). Por lo tanto, tomar 7,5 mL de la suspensión celular, traer el volumen con precalentado media SMC y mezcla bien hasta 13,5 mL.
- Cuenta el número de celdas de 5 x 5 cajas (es decir, 18), multiplica esto por 10.000 para obtener el número de células en 1 mL (180.000). Luego multiplique por 12 mL (volumen total de la suspensión celular, SMC 2,16 millones). Asegurar que hay suficiente SMC para el número deseado de pocillos de la placa.
- Placa 750 μl de la suspensión de células que contienen aproximadamente 75.000 SMC en la parte inferior de cada filtro, teniendo cuidado de no derramar alguna de la solución de los medios de comunicación y de la célula. Coloque la tapa en la parte superior y transferir cuidadosamente la placa de Petri con los insertos en la incubadora a 37 ° C durante la noche.
Nota: La densidad celular óptima para otros tipos celulares debe determinarse empíricamente. - En el día 2, llenar bien limpio 6 platos con 2 mL de medio SMC fresco, previamente calentado. Retire las placas de la incubadora. Tomar los insertos a uno a la vez y eliminar los medios de comunicación por succión, luego coloque en el plato de 6 bien con medios de comunicación SMC.
- Capa del lado opuesto del filtro (lado CE) con 1 mL de una solución de gelatina bovina 0.5% durante al menos 30 min a 37 ° C.
- Trypsinize el 225 cm 2 Deutsch de la CE con 3 mL de precalentado 2 X tripsina-EDTA (10 x diluido en estéril Dulbecco ' s PBS) solución, con suaves golpecitos del matraz para levantar las células de la placa de.
Nota: Puede ser necesario colocar el matraz en la incubadora a 37 ° C durante 1-3 minutos.- Una vez las células han levantado fuera del plato, añadir la EC media de 9 mL para neutralizar la tripsina (3:1). Transferir a un tubo cónico, piscina juntos, mezclar bien y pipetee 10 μL en un hemocitómetro para determinar el número de células.
- Cuenta el número de celdas de 5 x 5 cajas (es decir, 60), multiplica esto por 10.000 para obtener el número de células en 1 mL (600.000). Luego multiplique por 12 mL (volumen total de la suspensión celular, CE 7,2 millones). Asegurar que hay suficiente CE para el número deseado de pocillos de la placa.
Nota: CE aproximadamente 360.000 son necesarios por pozo. Por ejemplo, 18 pozos requieren EC 6,48 millones Dividir las células 6,48 millones necesitadas por 600.000 CE por 1 mL y esto se traduce en 10,8 mL de la suspensión de células que se necesitan para la galjanoplastia. Luego calcular el volumen final necesario (18 pozos x 1 mL = 18 mL). Por lo tanto, tomar 10,8 mL de la suspensión celular, llevar el volumen hasta 18 mL con pre calentado EC media y resuspender suavemente.
- Cuenta el número de celdas de 5 x 5 cajas (es decir, 60), multiplica esto por 10.000 para obtener el número de células en 1 mL (600.000). Luego multiplique por 12 mL (volumen total de la suspensión celular, CE 7,2 millones). Asegurar que hay suficiente CE para el número deseado de pocillos de la placa.
- Una vez las células han levantado fuera del plato, añadir la EC media de 9 mL para neutralizar la tripsina (3:1). Transferir a un tubo cónico, piscina juntos, mezclar bien y pipetee 10 μL en un hemocitómetro para determinar el número de células.
- 1 mL de 360.000 CE en la parte superior de cada filtro de inserción de la placa. Que las células Incube imperturbado a 37 ° C por medio de reemplazar 24 h. en el día 4. Cosecha el día 5.
2. Recolección de fracciones de la VCCC
- realizar el aislamiento en una habitación de 4 ° C y mantener todos los instrumentos en el ICE.
- Tener en cuenta el número de inserciones individuales ser aislado y añadir tampón de lisis a un tubo de 50 mL etiquetado MEJ (para los filtros aislados). Entonces la etiqueta dos platos de 10 mm; uno para EC y otro para SMC.
- Ajustar el volumen de tampón de lisis dependiendo de cómo concentran el lisado necesita ser; 15 insertos, 500 μl de tampón de lisis para el tubo MEJ y 250 μl de Petri recomienda.
- Trabajo con una placa de 6 pozos de insertos en un momento. Succión fuera el medio en la campana de cultivo celular y luego transporte a una cámara fría a hielo.
Nota: Las siguientes instrucciones son para 1 Inserte aislamiento. - Pipetear 10 μl de PBS 1 x a la parte SMC de la inserción.
- Utilice el elevador de la célula para limpiar las células a un extremo de la inserción y la transferencia de las células el elevador a la SMC caja Petri con buffer de lisis en it.
- Una vez que el elevador de la célula ha tocado el tampón de lisis en el plato, no permita que toque el filtro insertar hasta que ha sido completamente limpiado y secado sobre toallas de papel. Repetir el raspado del filtro SMC por lo menos una o dos veces para remover completamente los restos de células restantes de SMC.
- Gire el inserto sobre y pipetee 10 μl de PBS 1 x en la parte superior/CE de la filtro de insertar. Repita los pasos del 2.6 y 2.7 con un raspador celular y el plato de Petri CE.
- Recoger la célula restante y la mezcla de PBS desde el lado del CE del filtro con una pipeta y transferencia a la CE caja Petri con buffer de lisis. Ser muy cuidadoso en raspar las células de ambos lados del filtro en cuanto a dejar la mínima contaminación CE/SMC en la fracción MEJ.
- Cuidadosamente con el bisturí para cortar el filtro de la tuerca de plástico. Para ello, corte 70-80% de plástico y utilizar pinzas para sacar el filtro completamente fuera de la estructura de plástico. Coloque el filtro en el tubo cónico de 50 mL etiquetado MEJ con tampón de lisis y garantizar que se encuentra en el buffer de lisis y permanece mojado.
- Repetir los pasos de aislamiento, en grupos de 6, hasta que todos los rellenos se han procesado.
- Asegurar que diversos grupos se mantienen en tubos separados y platos.
- Vortex el tubo cónico de 50 mL MEJ en toda su fuerza durante 15 s o hasta que se mezcle bien. Quite los filtros de la MEJ cónico con pinzas, arrastrando a lo largo de las paredes laterales del tubo que dejar la mayor cantidad de proteínas y líquido en el tubo. Después de este punto, deseche los filtros de.
- Una vez que se han quitado todos los filtros del tubo cónico del MEJ, hacer un vuelta rápida (10-15 s a velocidad máxima ~ 16.000 x g) en una centrífuga para sacar todo el líquido y proteínas en la parte inferior del tubo. Transferir el contenido del tubo MEJ y los platos de CE y SMC Petri a tubos de centrífuga separado, más pequeño.
- Opcional: el contenido de los tubos MEJ/SMC/CE someter a ultrasonidos en configuración 4 impulsos de tres 10 s en hielo u Homogeneizar suavemente con la mano.
- Centrifugar a máxima velocidad (~ 16.000 x g) 15 min a 4 ° C. pipeta hacia fuera el sobrenadante y ensayo lisado para contenido de proteína utilizando el método de ensayo de bicinchoninic.
3. Cosecha el VCCC para inmunofluorescencia En cara
- incubación el día 5 de VCCC, quite los insertos de la incubadora. Trabajar en la campana de la cultura de célula, succione los medios de comunicación SMC de cada uno de los pozos más bajos de la insertar filtro y enjuague dos veces con PBS 1 x. Repita con el lado CE.
- Mantener las inserciones intactos y en la placa, añadir 4% paraformaldehido (PFA) durante 10-20 min en baño vestidor 4 ° C en un agitador suave. Lavar ambos lados del filtro insertar con PBS 1 x durante 5 minutos y repita dos veces.
PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado. - Realizar las incubaciones de anticuerpos bloqueadores, primaria y secundaria en la placa, asegurando que se mantienen ambos lados del filtro en el anticuerpo + solución de bloqueo (9 mL PBS, 25 μl Tritón X100, 50 mg albúmina de suero bovino, suero normal de 500 μl)
- Para montar el filtro en un portaobjetos, el filtro de la inserción de plástico con un bisturí de corte montado sobre un mango y colóquelo en un portaobjetos de microscopio con medio de montaje.
4. Cosecha el VCCC para inmunofluorescencia transversal
- incubación el día 5 de VCCC, quite los insertos de la incubadora. La succión de los medios de comunicación de ambos lados del filtro inserto en la campana de la cultura de célula y enjuague ambos lados del filtro dos veces con PBS 1 x.
- Mantener las inserciones intactos y en la placa de la pozo 6, añadir 4% PFA e incubar durante una noche en una habitación vestidor 4 ° C en un agitador suave.
PRECAUCIÓN: PFA es tóxica y debe manipularse con cuidado.
5. Incrustar la VCCC para inmunofluorescencia transversal
- después de filtro insertos se han resuelto aproximadamente durante 24 h en 4% PFA, traslado hasta el 70% EtOH durante al menos 24 h, sino hasta varias semanas.
- Proceso de los filtros en un largo plazo (durante la noche) en un procesador automatizado de tejido. Utilizar el programa como sigue: 70% EtOH por 30 min 85% EtOH 30 min 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min., 100% EtOH 45 min, xileno 30 min, xileno 30 min, xileno 45 min, 60 ° C parafina 30 min, 30 min de parafina 60 ° C , 45 min de parafina 60 ° C
- Después del procesamiento, traslado los filtros cosechados a la estación de inclusión en parafina líquida, manteniendo el filtro en el cassette.
- Retire el filtro de la cinta, cuidadosamente con unas pinzas para sostener justo en el borde. Con unas tijeras, cortadas el filtro por la mitad, formando dos semicircular en forma de mitades. Poner de las 2 mitades en la parte de la placa fría de la estación de empotrar apenas tiempo suficiente para llenar la incrustación molde con parafina líquida.
- Una vez lleno de parafina líquida, muy brevemente toque el molde de inclusión para la placa fría, luego incrustar cada mitad del filtro en incrustar el molde (parte cortada hacia abajo), esto asegura que durante el seccionamiento, uno estará cortando desde el centro del filtro hacia el borde .
- Durante la incrustación, usar pinzas para sujetar el filtro para evitar que las mitades caigan unos a otros hasta que la parafina esté lo suficientemente fría como para que independiente. Mover el molde de incrustación a una placa fría hasta que se solidificó completamente.
Nota: Refrigeración bloques en cubetas de hielo ayuda a prevenir arrugas secciones.
6. Seccionamiento y la coloración del VCCC para inmunofluorescencia transversal
- para los bloques de parafina de seccionamiento y deslice el montaje: cortar 5 μm secciones, colocar los elementos en un baño de agua de 42 ° C y recoger las secciones con carga positiva diapositivas. Luego guardar diapositivas durante la noche en un horno de 42 ° C para secar.
- Antes de comenzar las medidas de rehidratación, hornear las diapositivas a 60 ° C para derretir la parafina y ayudar a cumplir las secciones VCCC a la diapositiva. Enfriar brevemente y rehidratar las diapositivas a través de dos cambios de xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, un cambio del 70% EtOH y dos cambios de agua destilación.
- Evitar métodos de recuperación de antígeno que involucran microondas o como secciones pueden caerse el carro.
- Realizar el bloqueo estándar por 1 h a temperatura ambiente, luego de la incubación durante la noche con el anticuerpo primario a 4 ° C, seguido de lavado pasos y anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Montaje con los medios de montaje y cubreobjetos de.
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Representative Results
Los insertos de filtro utilizados para la VCCC tienen pequeñas, 0,4 μm agujeros. Figura 1A, una cara en vista de la inserción del filtro VCCC, muestra los poros en los que puede formar el MEJ en vitro. El esquema representa las células de músculo liso plateadas en la parte inferior del filtro un día antes de las células endoteliales se platean en el lado opuesto (figura 1B). Una vez que las células son plateadas, las fracciones CE, MEJ y SMC pueden ser aislados tres días más tarde. Un ejemplo de esto se muestra en la figura 2A, donde el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) es altamente expresada en la fracción MEJ en relación con el resto de la CE, que también se ve en vivo MEJs25. Estos datos demuestran la utilidad de la VCCC en recapitular la pared vascular arteriolar intacto.
A continuación se demuestra VCCC en inmunofluorescencia y microscopia electrónica. El VCCC queda intacto y fijas con PFA para inmunofluorescencia transversal. Figura 3A muestra el músculo liso específico receptor adrenérgico alfa-1 y el receptor de bradicinina específico endotelial. Phalloidin tinción de la F-actina muestra los puentes de actina en el MEJ (flecha blanca) entre las dos células, que reproduce la expresión en una arteria intacta26. En la figura 3B, se demuestra una sección representativa de VCCC visto por microscopía electrónica de transmisión, que se representa en 3D en la figura 3. Estos puntos de vista de la VCCC demuestran la capacidad de localizar específicamente las proteínas, los receptores y ultraestructura en vitro MEJs.
Figura 1: galjanoplastia de la cultura de la célula Vascular (VCCC). (A) cara En luz micrografía de los poros en el inserto de filtro. Flechas negras indican agujeros individuales. (B) esquema de la VCCC de la galjanoplastia. Día 1 muestra inversión del inserto del filtro y SMC de la galjanoplastia en la parte inferior. En el día 2, la CE se platean en el lado opuesto del filtro y el VCCC permanece en esta conformación en una placa de 6 pozos hasta la cosecha. Flechas blancas indican el lado del filtro donde las células se platean y crecerán. Barra de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: enriquecimiento de proteína en el MEJ. (A) imagen de microscopio de inmuno-transmisión de arteria de ratón con expresión de la alfa globina en el MEJ (granos de oro que aparecen como puntos negros). (B) Western blot mostrando inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1) expresión se enriquece en la fracción MEJ versus las fracciones CE o SMC. CE plástico indica CE en un plato de plástico, que no forman MEJ. Barra de escala = 1 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: transversal de la inmunofluorescencia y la microscopia electrónica en secciones transversales de la VCCC. (A) tinción de músculo liso y endoteliales proteínas específicas. Tinción de F-actina es a través de tipos de la célula y la de vitro MEJ (flecha blanca). Un ejemplo de la microscopia electrónica utilizada para el estudio de la ultraestructura de la en vitro MEJs en 2D (B) y 3D (C). Barra de escala = 10 μm (A); 2.5 μm (B); y aproximadamente 2.5 μm vertical y horizontal de 0,5 μm (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El VCCC tiene una serie de ventajas en términos de Recapitulando MEJs en vitro, pero hay puntos de discusión para determinar si el VCCC puede ser utilizado para aplicaciones específicas. Por ejemplo, si diferentes tipos de células se utilizan con este modelo, tendrá que ser optimizado. Hemos utilizado células humanas primarias pero es posible aislar células de aortas bovinas24o ratones de tipo salvaje o el agujero ciego, y utilizarlos en el VCCC1,5,14.
Si utiliza el VCCC para aislamiento de MEJ, la técnica más importante para el maestro es raspado cuidadoso del filtro para asegurar que la pureza de la fracción MEJ no es alterada por exceso de células endoteliales o músculo liso. Hemos demostrado mediante Western blotting que hemoglobina alfa es el mejor marcador de un «puro» MEJ aislamiento13, debe ser fuertemente expresado en la fracción MEJ versus la fracción de células endoteliales. Otro es el PAI-1, que regula la formación de MEJ (figura 2)25. Creemos que estos pueden ser marcadores especialmente buenos para un fuerte aislamiento de MEJ. Confianza adicional en la técnica de cosecha, los filtros se pueden mantenidos después de rascar para cosecha y manchados por CE/SMC marcadores25.
Expresión de proteínas en el VCCC de imágenes pueden realizarse de dos maneras principales: cara en (figura 1A) o transversal (figura 3). Ambos preparados permiten la visualización de proteínas dentro de los agujeros del filtro desde dos perspectivas diferentes. La técnica de cara en involucra las arterias que son abrir longitudinalmente y luego cubrió a plana, con la CE hacia arriba, para visualizar la monocapa de la CE y los agujeros en el IEL, el único lugar donde puede formar MEJ. Una señal fluorescente dentro de los agujeros de la IEL indica la localización de la proteína en el MEJ10,27. Este mismo principio se puede traducir a la VCCC por proyección de imagen la monocapa de CE desde arriba, sin necesidad de incluir en parafina o secciones. El método transversal es más complejo de dominar pero es crítico para la clara visualización de proteínas en las CE versus las monocapas SMC (figura 3).
La falta de flujo o estiramiento en el sistema es una limitación potencial, pero es posible añadir flujo en un músculo liso endotelial de la célula cultura Co16,19. Parece que las condiciones estáticas todavía permitan expresión de proteínas fisiológicamente correcta y activación, así que puede ser que el contacto heterocelulares es el factor más importante en la disección de MEJ vías de señalización.
Existen múltiples aplicaciones de esta técnica más allá de la resistencia de la arteria de señalización como el VCCC no está necesariamente limitado a tipos celulares específicos. Otros modelos de cocultivo utilizado consecuencia células endoteliales y osteoblastos17o modelado la barrera hematoencefálica con endotelial y astrositos/pericyte culturas Co21. Metástasis de las células tumorales a través del endotelio se pueden cuantificar utilizando este modelo21. También es posible cultivar células en el filtro y cultura otra celda escriba en la parte inferior del plato 6-pozo para poner a prueba la señalización paracrina, o crecer las células endoteliales en la parte superior de la membrana para mirar la polarización de la célula (nuestras observaciones no publicadas). Leucocitos u otras células circulantes pueden añadirse a los medios de comunicación de la CE y la adhesión de las células puede ser cuantificada12. Además, el VCCC puede utilizarse para investigar patologías tales como músculo liso migración24 y proliferación en respuesta a lesión endotelial15,18.
En conclusión, hemos presentado un método para aislar MEJ de un en vitro sistema del cultivo celular, que permite la investigación de los procesos entre dos tipos de células acopladas de señalización. Importante, el sistema de la cultura no se limita al estudio de la MEJ y puede ser valioso para responder a una serie de preguntas, especialmente las que implican comunicación heterocelulares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el National Heart, Lung and Blood Institute otorga R01088554, T32HL007284 y American Heart Association 14PRE20420024 de beca predoctoral. Agradecemos especialmente el St. Jude celular imagen compartida investigación núcleo, incluyendo Randall Wakefield y Linda Horner para las imágenes de microscopía electrónica, Adam Straub ayuda con imágenes representativas de la inmunofluorescencia y Pooneh Bagher para ella valiosos comentarios sobre el protocolo de manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
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| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
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| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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