Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En celle kultur Model af modstand arterier

Published: September 8, 2017 doi: 10.3791/55992
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 3, 1,2
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Summary

En celle kultur model af modstand arterier er beskrevet, giver mulighed for dissektion af signalering veje i endothelium, glatte muskelceller, eller mellem endothelium og glat muskulatur (myoendothelial krydset). Selektiv anvendelse af agonister eller protein isolation, elektronmikroskopi eller immunfluorescens kan udnyttes ved hjælp af denne celle kultur model.

Abstract

Myoendothelial krydset (MEJ), en unik signaling microdomain i lille diameter modstand arterier, udstiller lokalisering af specifikke proteiner og signalering processer, der kan styre vaskulære tone og blodtryk. Da det er en projektion fra enten i endothelial eller glat muskulatur cellen, og på grund af sin lille størrelse (i gennemsnit, et område med ~ 1 µm2), MEJ er svært at studere i isolation. Dog har vi udviklet en celle kultur model kaldet vaskulær Co cellekultur (VCCC), der giver mulighed for in vitro- MEJ dannelse, endotel celle polarisering og dissektion af signalering proteiner og processer i det vaskulære mur af modstand arterier. VCCC har en lang række applikationer og kan tilpasses til forskellige celletyper. Modellen består af to celletyper dyrkes på modsatte sider af et filter med 0,4 µm porer, hvor i vitro MEJs kan danne. Her vi beskrive, hvordan du opretter VCCC via plating af celler og isolation i endothelial, MEJ, og glatte muskulatur fraktioner, som derefter kan bruges til protein isolation eller aktivitet assays. Filter med intakt cellelag kan fastsættes, integrerede og sektioneret immunfluorescent analyse. Vigtigere, er mange af opdagelser fra denne model blevet bekræftet ved hjælp af intakt modstand arterier, understreger dens fysiologiske relevans.

Introduction

I lille diameter modstand arterier adskiller en tynd indre elastisk lamina (IEL) endotel (EF) og glatte muskelceller (SMC). Cellerne kan projektet gennem huller i denne elastiske matrix og gøre direkte cytoplasmatisk forbindelser via gap junction kanaler1,2. Denne unikke struktur kaldes myoendothelial krydset (MEJ). MEJ er en lille (ca 0,5 µm x 0,5 µm, afhængigt af den vaskulære seng), cellulære projektion består overvejende i endothelial celler men kan stamme fra glatte muskulatur samt3,4. En række af efterforskere har vist den enorme kompleksitet signalering netværk, der forekommer selektivt på MEJ, gengivelse sig en særlig vigtig placering for at lette bi-directional signalering mellem endothelium og glatte muskulatur5 ,6,7,8,9,10.

Men en mekanistisk dissektion af signaling veje på MEJ er vanskeligt i en intakt arterie. Fordi MEJ er en cellulær projektion, er det ikke i øjeblikket muligt at isolere en i vivo MEJ fra det vaskulære væg. Af denne grund, blev VCCC model1 udviklet. Vigtigere er, VCCC replikater fysiologiske endotel morfologi11 og polarisering af signaler mellem den apikale og MEJ dele af celle12. Det var denne unikke model, der fremmes den opdagelse, at alpha hæmoglobin er i endothelial cellen polariseret til MEJ. Dette er i modsætning til konventionelt dyrkede endotelceller, som ikke udtrykker alpha hæmoglobin13. For forskere interesseret i mikrovaskulære endothelium, kan det være mere hensigtsmæssigt at bruge endotelceller, der har været kulturperler i VCCC, især hvis hensigten er at dissekere signaling veje, der forekommer i lille diameter modstand arterier.

Ved hjælp af en robust plastindsats der indeholder et filter med lille diameter porer (0.4 µm i diameter) til fælles kultur to forskellige celletyper forhindrer cellerne i overflytning mellem lagene. Det resulterer i en 10 µm afstand mellem celler, som er betydeligt længere end in vivo, men stadig replikater mange MEJs, herunder protein lokalisering og anden messenger signalering1 i vivo karakteristika , 14. Desuden, at VCCC giver mulighed for målretning af celle type-specifikke signaler via tilføjelsen af en agonist og antagonist til den specifikke cellulære rum. For eksempel, lastning EF med BAPTA-AM til Chelat calcium, og stimulere SMC med phenylephrin14. I modsætning til andre beskrivelser af co kultur modeller15,16,17,18,19,20,21giver dette instruktioner på isolere de forskellige fraktioner til mRNA og protein, herunder den særskilte MEJ fraktion inden filter porer. Tilføjelsen af denne teknik til at VCCC giver mulighed for specifikke undersøgelse af ændringer i mRNA lokalisering eller transskription22, protein fosforylering12,23, og protein aktivitet12. Denne artikel vil beskrive plating af EF på toppen af filter og SMC på bunden, selv om det er muligt at kultur to celletyper i forskellige konformationer11,18,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plating celler for VCCC

  1. kultur store 225 cm 2 flasker af EF og SMC under sterile forhold ved 37 ° C, indtil 70-90% sammenflydende. Sikre, at flere EF end SMC bliver brugt; Hvis bruger primære menneskelige EF og SMC, typisk 3 store kolber i EF til 1 stor kolbe af SMC.
    1. Bruger primærelementer på lavere passager og brug ikke forbi passage 10. Vælg dyrkningsmedier baseret på celler til at være co kulturperler. Primære menneskelige koronar arterie EF, at bruge EBM-2 EF basal media med EGM2 MV vækstfaktorer. Primære menneskelige koronar SMC, at bruge SmBM SMC basal media med SmGM-2 vækstfaktorer. Før brug med kulturperler celler, tilføje vækstfaktorer til medierne.
  2. Opførelse af VCCC dag 1: Spray petriskåle med stor (150 mm) og låg med desinfektionsmiddel (f.eks. Cavicide) og tørre væk med et stykke køkkenrulle eller fnugfri klude. Derefter spray på petriskåle med 70% ethanol (EtOH) og placere dem i hood til luft tørre.
  3. Åbne plade filter skær (Se Tabel af materialer) under sterile forhold, og pels SMC side (nederste side af filter) af Indsæt med fibronektin løsning. At holde indsatsen i den medfølgende 6-godt plade, afpipetteres fibronektin løsning gennem side slidser i bunden af pladen, og sørg for, at bunden halvdelen af filteret er dækket (ikke mere end 1 mL).
  4. Efter 30 min. behandling med fibronektin løsning ved stuetemperatur i celle kultur hood, tage skær ud af pladen, vakuum eventuelle overskydende løsning og Inverter, placere i bunden halvdelen af ren petriskålen. Der er afsat. Sørg for ikke at forstyrre filter Indsæt membran, når sugning overskydende løsning; Dette kan undgås ved forsigtigt vippe pladen, og støvsugning løsning ud over kanten af insertet.
  5. Trypsinize en 225 cm 2 kolbe af SMC med 3 mL pre varmede 2 X Trypsin-EDTA-oploesning, og når cellerne har løftet pladen, tilføje 9 mL SMC medier til at neutralisere trypsin (3:1, medier: trypsin). Overførsel til en konisk slange, bland godt og afpipetteres 10 µL på en hemocytometer til at bestemme celle nummer.
    1. Tæller antallet af celler i 5 x 5 kasser (dvs. 18), ganger det med 10.000 at få antallet af celler i 1 mL (180.000). Derefter ganges med 12 mL (samlede volumen af cellesuspension, 2.16 millioner SMC). Sikre, at der er nok SMC til plade det ønskede antal brønde.
      Bemærk: For eksempel 1 godt bør have 75.000 SMC og dermed 18 brønde ville have 1,35 millioner samlede SMC. Opdele 1,35 millioner celler brug for 180.000 celler pr. 1 mL, og dette resulterer i 7,5 mL cellesuspension, der vil være behov for plating. Derefter beregner det endelige rumfang behov (18 brønde x 750 µL = 13,5 mL). Således tager 7,5 mL cellesuspension, bringe volumen med pre varmede SMC medier, og bland godt op til 13,5 mL.
  6. Plade 750 µL af cellesuspension indeholdende ca 75.000 SMC på den nederste side af hvert filter, være omhyggelig med at ikke spilde nogen af de medier og celle løsning. Låget lægges på toppen og omhyggeligt overføre petriskål med indsætter i varmeskab ved 37 ° C natten.
    Bemærk: Den optimale celle tæthed til andre celletyper skal bestemmes empirisk.
  7. På dag 2, fylde ren 6-godt retter med 2 mL frisk, pre varmede SMC medier. Fjerne pladerne fra rugemaskinen. Tage skær ud en ad gangen og fjerne medier ved at suge, og Placer den i 6-godt skålen med SMC media.
  8. Pels den modsatte side af filteret (EF side) med 1 mL af en 0,5% bovin gelatine løsning til mindst 30 minutter ved 37 ° C.
  9. Trypsinize 225 cm 2 flask(s) i EF med 3 mL af pre varmede 2 X Trypsin-EDTA (10 x fortyndet i sterile Dulbecco ' s PBS) løsning, med blid aflytning af kolben for at løfte cellerne fra pladen.
    Bemærk: Det kan være nødvendigt at placere kolben tilbage i varmeskab ved 37 ° C i 1-3 min.
    1. Når cellerne har løftet pladen, tilføje 9 mL EF medier til at neutralisere trypsin (3:1). Overførsel til en konisk slange, pool sammen, bland godt og afpipetteres 10 µL på en hemocytometer til at bestemme celle nummer.
      1. Tæller antallet af celler i 5 x 5 kasser (dvs., 60), ganger det med 10.000 at få antallet af celler i 1 mL (600.000). Derefter ganges med 12 mL (samlede volumen af cellesuspension, 7,2 millioner EF). Sikre, at der er nok EF til plade det ønskede antal brønde.
        Bemærk: Ca 360.000 EF kræves pr. brønd. For eksempel kræver 18 brønde 6.48 millioner EC. Opdele 6.48 millioner celler brug for 600.000 EF pr. 1 mL, og dette resulterer i 10,8 mL cellesuspension, der vil være behov for plating. Derefter beregner det endelige rumfang behov (18 brønde x 1 mL = 18 mL). Således tage 10,8 mL cellesuspension, bringe volumen op til 18 mL med pre varmede EF medier, og forsigtigt resuspend.
  10. Plade 1 mL af 360.000 EF på oversiden af hver Indsæt filter. Lad cellerne inkuberes uforstyrret ved 37 ° C i 24 h. Udskift mediet på dag 4. Høst på dag 5.

2. Høst fraktioner fra VCCC

  1. udføre isolation i et rum, 4 ° C og holde alle instrumenter på ice.
  2. Husk antallet af individuelle skær isoleret og tilføje lysisbuffer til en 50 mL tube mærket MEJ (for de isolerede filtre). Så mærke to 10 mm retter; én til EF og for SMC.
  3. Juster volumen af lysisbuffer afhængigt af hvordan koncentreret i lysate skal være; 15 indsætter, 500 µL af lysisbuffer for MEJ tube og 250 µL pr. petriskål anbefales.
  4. Arbejde med en 6-godt plade af skær ad gangen. Suge ud medium i celle kultur hood og derefter transport til et kølerum på ice.
    Bemærk: Nedenstående instruktioner er for 1 sæt isolation.
  5. Afpipetteres 10 µL 1 x PBS på SMC side af skæret.
  6. Bruge celle løfter at skrabe ned celler til den ene ende af indsatsen, og Overfør celler fra løfter til SMC petriskålen der har lysisbuffer i det.
  7. Når celle løfteren har rørt lysisbuffer i skålen, ikke tillader det at røre Indsæt filter, indtil det har været helt udslettet og tørret på papirhåndklæder. Gentag skrabning af filteret SMC mindst én til to gange helt fjerne de resterende SMC celle debris.
  8. Vende Indsæt over og afpipetteres 10 µL 1 x PBS i den øverste/EF side af filteret Indsæt. Gentag trin 2.6 og 2.7 med en celle skraber og EF petriskål.
  9. Indsamle de resterende celle og PBS gylle fra EF side af filteret med en pipette og overførsel til EF petriskål med lysisbuffer. Være meget grundig Scraping celler fra begge sider af filteret, efterlader minimale EF/SMC forurening i MEJ brøkdel.
  10. Brug omhyggeligt skalpel til at skære ud filter fra en plastindsats. Gøre dette ved at skære 70-80% af det væk fra plastic og bruge pincet til at trække filter helt slukket plastindsats struktur. Sæt filteret i 50 mL konisk røret mærket MEJ med lysisbuffer, og sikre, at det sidder i lysisbuffer og forbliver våde.
  11. Gentag trinene isolation i grupper af 6, indtil alle indsætter er blevet behandlet.
  12. Sikrer, at forskellige behandlingsgrupper i separate rør og retter.
  13. Vortex 50 mL MEJ koniske rør på fuld styrke for 15 s eller indtil blandet godt. Fjerne filtrene fra MEJ konisk med pincet, trække dem langs sidevæggene af røret at forlade den maksimale mængde af protein og væske i røret. Efter dette tidspunkt, kassere filtrene.
  14. Når alle filtre er blevet fjernet fra MEJ koniske rør, gøre en hurtig spin (10-15 s på max speed ~ 16.000 x g) i en centrifuge at trække al den væske og proteiner til bunden af røret. Overføre indholdet af MEJ tube og EF og SMC Petri retter til separat, mindre centrifugeglas.
  15. Valgfrit: sonikeres indholdet af MEJ/SMC/EF rør på indstilling 4 ved tre 10 s pulser på is eller omrystes forsigtigt hånden.
  16. Centrifugeres ved max hastighed (~ 16.000 x g) 15 min. ved 4 ° C. afpipetteres ud supernatanten og analyse af lysate for proteinindhold ved hjælp af metoden bicinchoninic assay.

3. Høst af VCCC for En ansigt immunofluorescens

  1. på dag 5 af VCCC inkubation, Fjern indsætter fra rugemaskinen. Arbejder i celle kultur hood, suge ud SMC medier fra hver af de lavere brønde Indsæt filter og skylles to gange med 1 x PBS. Gentag med EF side.
  2. Holder indsætter intakt og i pladen, tilføje 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) for 10-20 min i en walk-in 4 ° C rum på en blid shaker. Vaske begge sider af Indsæt filter med 1 x PBS til 5 min og gentage to gange.
    Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres forsigtigt.
  3. Udføre de blokering, primær og sekundær antistof inkubationer i pladen, at sikre, at begge sider af filteret holdes i antistoffet + blokerende løsning (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg bovin serumalbumin, 500 µL normale serum)
  4. Til at montere filteret på et dias, cut filter ud af plastindsats med en skalpel monteret på et håndtag og plads på et objektglas med montering medium.

4. Høst af VCCC for tværgående immunofluorescens

  1. på dag 5 af VCCC inkubation, Fjern indsætter fra rugemaskinen. Suge ud medier fra begge sider af filteret Indsæt i celle kultur hood og skylles hver side af filtret to gange med 1 x PBS.
  2. Holder indsætter intakt og i 6-godt plade, tilføje 4% PFA, og der inkuberes natten over i et walk-in 4 ° C rum på en blid shaker.
    Forsigtig: PFA er giftigt og skal håndteres forsigtigt.

5. Integrering af VCCC for tværgående immunofluorescens

  1. efter filteret skær har været fast ca for 24 h i 4% PFA, overførsel til 70% EtOH i mindst 24 timer, men op til flere uger.
  2. Behandle filtrene på lang (natten) løber på en automatiseret væv processor. Brug programmet som følger: 70% EtOH for 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xylen 30 min, xylen 30 min, xylen 45 min, 60 ° C paraffin 30 min, 60 ° C paraffin 30 min , 60 ° C paraffin 45 min.
  3. Efter forarbejdning, overføres de høstede filtre til indlejring stationen i flydende paraffin, holde filteret i kassetten.
  4. Fjern filter fra kassette, omhyggeligt ved hjælp af pincet til at holde det lige på kanten. Med en saks, klippe filteret i halvdelen, der danner to semi-cirkulære formede halvdele. Lå i 2 halvdele på den kolde plade del af indlejring stationen bare længe nok til at fylde integrering skimmel med flydende paraffin.
  5. Engang fyldt med flydende paraffin, meget kortvarigt Tryk på indlejring formen til kolde pladen, så indkapsle hver halvdel af filteret i indlejring mug (skære side ned), dette sikrer at ved skæring, vil man skære fra midten af filteret mod kanten .
  6. Under indlejring, bruge pincet til at holde filteret for at forhindre halvdele fra at falde ind i hinanden indtil paraffin er cool nok for dem at stå alene. Flytte indlejring formen til en kold plade indtil helt størknet.
    Bemærk: Køling blokke på isen bakker hjælper med at forhindre rynkede sektioner.

6. Skæring og farvning af VCCC for tværgående immunofluorescens

  1. For paraffinblokke skæring og skub montering: skær 5 µm sektioner, placere sektionerne i en 42 ° C vandbad og afhente sektioner ved hjælp af positivt ladede dias. Derefter holde dias natten over i et 42 ° C ovnen tørre.
  2. Før du begynder rehydrering trin, bage dias ved 60 ° C til at smelte paraffin og hjælpe med at overholde VCCC sektioner til diaset. Cool kort og derefter rehydrere dias gennem to ændringer af xylen, 100% EtOH, 95% EtOH, en ændring af 70% EtOH, og to ændringer af destilleret vand.
  3. Undgå antigen hentning metoder, der involverer mikrobølgeovn eller varme som sektioner kan falde væk fra diaset.
  4. Udføre standard blokering i 1 time ved stuetemperatur, derefter i natten inkubation med det primære antistof ved 4 ° C, efterfulgt af vask trin og sekundær antistof i 1 time ved stuetemperatur. Monter med montering medier og coverslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Filter indsætter anvendes til VCCC har små, 0,4 µm huller. Figur 1A, en da ansigt visning af VCCC filter inset, viser porerne, hvor MEJ kan danne i vitro. Skematiske skildrer de glatte muskelceller belagt på den nederste side af filteret én dag før i endothelial celler er belagt på den modsatte side (figur 1B). Når cellerne er forgyldt, kan EF, MEJ og SMC fraktioner være isolerede tre dage senere. Et eksempel herpå er vist i figur 2A, hvor plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) er stærkt udtrykt i MEJ-fraktionen i forhold til resten af EF, og som ses også på i vivo MEJs25. Disse data viser nytten af VCCC i recapitulating intakt arteriolære blodkar væggen.

Næste er VCCC i immunofluorescens og elektronmikroskopi påvist. VCCC er overladt intakt og fast med PFA for tværgående immunfluorescens. Figur 3A viser den glatte muskulatur specifikke alfa-1 adrenerge receptor og i endothelial specifikke bradykinin receptor. Phalloidin farvning af F-actin viser actin broer i MEJ (hvid pil) mellem de to celler, der replikerer udtryk set i en intakt arterie26. I figur 3B, er et tværsnit af VCCC som set af transmissions Elektron Mikroskopi demonstreret, der er afsagt i 3D i figur 3 c. Disse visninger af VCCC demonstrere evnen til at specifikt lokalisere proteiner, receptorer og ultrastruktur til in vitro- MEJs.

Figure 1
Figur 1: Plating af vaskulære Co cellekultur (VCCC). (A) En ansigt lyse Mikrograf af porer i Indsæt filter. Sorte pile betegne enkelte huller. (B) skematisk af plating VCCC. Dag 1 viser inversion af filter Indsæt og plating SMC på bunden. På dag 2, EF er belagt på den modsatte side af filteret og VCCC forbliver i denne kropsbygning i en 6-godt plade indtil høsten. Hvide pile angiver siden af et filter, hvor cellerne er forgyldt vil vokse. Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Protein berigelse i MEJ. (A) Immuno-transmissions elektron mikroskop billede af musen arterie med udtryk for alpha globin på MEJ (guld perler, der vises som sorte prikker). (B) vestlige skamplet viser plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) udtryk er beriget med MEJ brøkdel versus EF eller SMC fraktioner. Plast EF angiver EF dyrkes på en plastik skål, der ikke er en MEJ. Skalalinjen = 1 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: tværgående immunofluorescens og elektronmikroskopi i tværgående dele af VCCC. (A) farvning for glatte muskulatur og endotel specifikke proteiner. F-actin farvning er hele både celletyper og in vitro- MEJ (hvid pil). Et eksempel på elektronmikroskopi bruges til at studere ultrastruktur af in vitro- MEJs i 2D (B) og 3D (C). Skalalinjen = 10 µm (A); 2,5 µm (B); og cirka 2,5 µm lodret og 0,5 µm vandret (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VCCC har en række fordele i form af recapitulating MEJs i vitro, men der er punkter i diskussionen ved fastsættelsen af, hvis VCCC kan udnyttes til specifik anvendelse. For eksempel, hvis forskellige celletyper der skal bruges med denne model, skal det optimeres. Vi har brugt primære menneskelige celler, men det er muligt at isolere cellerne fra kvæg aortas24eller vildtype eller knockout mus, og bruge dem i VCCC1,5,14.

Hvis bruger VCCC til MEJ isolation, er de vigtigste teknik til master grundig skrabning af filteret for at sikre at renheden af MEJ brøkdel ikke ændres af overskydende endotel eller glat muskel celler. Vi har vist via Western blotting, at alpha hæmoglobin er den bedste markør for en "ren" MEJ isolation13, som det skal være stærkt udtrykt i MEJ brøkdel versus i endothelial celle brøkdel. En anden er PAI-1, som regulerer dannelsen af MEJ (figur 2)25. Vi føler, de er især gode markører for en robust MEJ isolation. For ekstra tillid til høst teknik, kan filtre være holdt efter skrabning for høst, og farvet for EF/SMC markører25.

Imaging protein udtryk i VCCC kan udføres i to primære måder: da ansigt (figur 1A) eller tværgående (figur 3). Begge præparater giver mulighed for visualisering af proteiner i hullerne i filteret fra to forskellige perspektiver. Da ansigt teknik indebærer arterier, der er skåret åben på langs og derefter besejrede ud flad, med de står op, til at visualisere både EF-éncellelag og huller i IEL, det eneste sted hvor MEJ kan danne. En fluorescerende signal inden for hullerne i IEL angiver lokalisering af protein i MEJ10,27. Samme princip kan oversættes til VCCC af imaging EF éncellelag ovenfra, uden at behøve at integrere det i paraffin eller gøre sektioner. Den tværgående metode er mere kompleks at mestre, men er kritisk for særskilte visualisering af proteiner i EF versus SMC encellelag (figur 3).

Manglen på strøm eller strækning i systemet er en potentiel begrænsning, men det er muligt at tilføje flow i en endotel-glat muskel celle Co kultur16,19. Det ser ud til at de statiske betingelser stadig mulighed for fysiologisk nøjagtig protein udtryk og aktivering, så det kan være at heterocellular kontakt er den vigtigste faktor i dissektion af MEJ signalering veje.

Der er flere programmer af denne teknik modstand arterie signalering som VCCC ikke er nødvendigvis begrænset til bestemte celletyper. Andre fælles kultur modeller har udnyttet udvækst endotelceller og osteoblaster17, eller modelleret blod-hjerne barrieren med endotel og pericyte/astrocyte Co kulturer21. Metastaser af tumorceller gennem endotelet kan også kvantificeres ved hjælp af denne model21. Det er også muligt at dyrke celler på filter og kultur en anden celle type i bunden af 6-godt parabol til at teste paracrine signalering, eller vokse endotelceller på den øverste del af membranen til at se på polarisering af celle (vores upublicerede observationer). Leukocytter eller andre cirkulerende celler kan føjes til EF medier og vedhæftning af celler kan være kvantificeret12. VCCC kan desuden bruges til at undersøge patologier såsom glatte muskulatur overførsel24 og spredning i svar på endotel skade15,18.

Afslutningsvis har vi præsenteret en metode til at isolere MEJ fra en in vitro- celle kultur system, som giver mulighed for undersøgelse af signalering processer mellem to koblede celletyper. Vigtigere, fælles kultur-systemet er ikke begrænset til undersøgelse af MEJ og kan være værdifuldt at besvare en række spørgsmål, især dem der involverer heterocellular kommunikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Heart, giver Lung, og Blood Institute R01088554, T32HL007284 og American Heart Association predoctoral fellowship 14PRE20420024. Vi takker især St. Jude cellulære Imaging delt forskning kernen, herunder Randall Wakefield og Linda Horner for elektronmikroskopi billeder, Adam Straub for bistand med repræsentative immunofluorescens billeder og Pooneh Bagher for hende værdifuld feedback på manuskript-protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert Corning 3450 This is one 6 well plate of inserts
225 cm flask Corning 431082
6 well plates (without filter inserts) Corning 3506
Primary human coronary artery endothelial cells Lonza CC-2585
Primary human coronary artery smooth muscle cells Lonza CC-2583
EBM-2 EC Basal media Lonza CC-3156
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) Lonza CC-4147 Add to basal media before use
SmBM SMC basal media Lonza CC-3181
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) Lonza CC-4149 Add to basal media before use
0.5% Trypsin-EDTA 10X Gibco 15400-054 Dilute to 2X with sterile dPBS
Hemocytometer VWR 15170-208
large petri dishes for SMC Plating (150mm) Corning 353025
Bovine gelatin Sigma G-9382
Human fibronectin Corning 356008 5µg/ml of fibronectin and store at -20
10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) Gibco 14065-056 Dilute to 1x with sterile water
10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) Gibco 14200-075 Dilute to 1x with sterile water
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle Amazon MDS15210
Forceps Fisher 17-467-201
Cell lifter Corning 3008
Cell scraper BD Falcon 353085
50 mL conical tube Corning 352070
10 mm petri dishes Falcon 35-1008
Rneasy mini kit Qiagen 74104
RNA lysis reagent Qiagen 79306
Paraformaldehyde Sigma 158127 Make 4% solution with dPBS
70% ethanol Fisher 04-355-305
Cavicide disinfectant Fisher 131000
RIPA protein lysis buffer Sigma R0278
Sonic dismembranator Fisher Model 50
1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry Gibco 10010023 does not need to be sterile
Name Company Catalog Number Comments
Embedding/Sectioning/Staining
Paraffin Fisher P31-500
Automated tissue processer Excelsior ES
Embedding station + cold plate Leica HistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade VWR 25608-961 or 25608-964
Microscope slides Thermo Fisher 22-230-900
Coverslips Thermo Fisher 12-548-5E
Prolong Gold mounting medium Thermo Fisher P36931
Name Company Catalog Number Comments
Other Solutions **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells
Sterile dPBS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
sterile HBSS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
Fibronectin stock solution Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed
Final concentration: 100µg/mL
Fibronectin to coat SMC side of VCCC thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL.
Final concentration: 5µg/mL
2x Trypsin EDTA solution Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) .
Final concentration: 2X
Blocking/antibody solution (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum)
Bovine gelatin to coat EC VCCC Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions.
Final concentration: 0.50%
1x PBS for harvesting cells does not need to be sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Tags

Medicin sag 127 endotel celle glatte muskelceller heterocellular kommunikation celle polaritet gap vejkryds cellulære fremskrivninger ekstracellulære matrix fælles kultur
En celle kultur Model af modstand arterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biwer, L. A., Lechauve, C.,… More

Biwer, L. A., Lechauve, C., Vanhoose, S., Weiss, M. J., Isakson, B. E. A Cell Culture Model of Resistance Arteries . J. Vis. Exp. (127), e55992, doi:10.3791/55992 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter