Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

Published: September 8, 2017 doi: 10.3791/55992
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 3, 1,2
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

Summary

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים מתואר, המאפשר ניתוח איתות המסלולים אנדותל, שריר חלק, או בין אנדותל שריר חלק (צומת myoendothelial). יישום סלקטיבי של אגוניסטים או בידוד חלבון, מיקרוסקופ אלקטרונים או immunofluorescence יכול להיות מנוצל בעזרת המודל התרבות תאים.

Abstract

צומת myoendothelial (MEJ), microdomain איתות ייחודי בקוטר קטן התנגדות העורקים, תערוכות לוקליזציה של חלבונים ספציפיים ותהליכים איתות בהן שולטת הטון כלי הדם ולחץ דם. כפי שזה הקרנה מכל אחת תא אנדותל או שריר חלק, עקב שלה קטן גודל (בממוצע, שטח של ~ 1 מיקרומטר2רשימות), על MEJ קשה ללמוד בבידוד. עם זאת, פיתחנו מודל התרבות התא הנקרא תא וסקולרית שיתוף התרבות (VCCC) המאפשר במבחנה היווצרות MEJ, תאי אנדותל קיטוב של דיסקציה של איתות חלבונים ותהליכים בדופן כלי הדם של התנגדות העורקים. VCCC ניתן להתאים בהתאם לסוגי תאים שונים, ויש שפע של יישומים. המודל מורכב משני סוגים של התא גדל על צידי מסנן עם נקבוביות מיקרומטר 0.4 שבו ה במבחנה MEJs יכול ליצור. כאן נתאר כיצד ליצור את VCCC באמצעות ציפוי של תאים ובידוד של אנדותל, MEJ, שברים השריר החלק, שבו ניתן להשתמש עבור בידוד חלבון או פעילות מבחני. יכול להיות קבוע את המסנן עם שכבות תאים שלמים, מוטבע, המחולקת למקטעים לניתוח immunofluorescent. חשוב, לרבים מהגילויים של מודל זה אושרו באמצעות התנגדות ללא פגע העורקים, דבר המלמד להתאמתו פיזיולוגיים.

Introduction

קוטר קטן התנגדות העורקים, דק פרופריה אלסטית פנימית (אישור IEL) מפריד בין אנדותל (EC) ותאי שריר חלק (SMC). התאים יכולים פרויקט דרך חורים אלסטי מטריצה זו ולעשות חיבורים ישירים cytoplasmic via gap junction ערוצים1,2. מבנה ייחודי זה נקרא צומת myoendothelial (MEJ). MEJ הוא מלון קטן (כ 0.5 מיקרומטר x 0.5 מיקרומטר, בהתאם המיטה כלי הדם), הקרנה הסלולר מורכב ברובו של תאי אנדותל, אבל עשוי לנבוע שריר חלק גם3,4. מספר חוקרים הוכיחו את המורכבות העצומה של רשתות שמתרחשים באופן סלקטיבי MEJ, טיוח זה הוא מקום חשוב במיוחד להקלה על מערכת אזעקה דו-כיוונית בין אנדותל שריר חלק5 איתות ,6,7,8,9,10.

עם זאת, הקרע מכניסטית של איתות המסלולים-MEJ קשה בעורק ללא פגע. מכיוון MEJ תחזית הסלולר, אין אפשרות כרגע לבודד של ויוו MEJ מהקיר כלי הדם. מסיבה זו, פותח מודל VCCC1 . חשוב לציין, VCCC משכפל מורפולוגיה אנדותל פיזיולוגיים11 וקיטוב של איתות בין הפסגה MEJ חלקים לתא12. זה היה מודל ייחודי זה, פוריה התגלית המוגלובין אלפא הוא בתא אנדותל, מקוטב עד MEJ... זאת בניגוד כמקובל בתרבית תאי אנדותל המבטאים לא אלפא המוגלובין13. עבור חוקרים המעוניינים אנדותל microvascular, ייתכן מתאים יותר להשתמש תאי אנדותל יש כבר תרבותי ב VCCC, במיוחד אם הכוונה היא לנתח איתות המסלולים המתרחשת קוטר קטן התנגדות העורקים.

באמצעות הוספה פלסטיק חסון המכיל מסנן עם נקבוביות בקוטר קטן (0.4 מיקרומטר בקוטר) תרבות משותפת לשני סוגי תאים נפרדים מונעת את התאים נודדים בין שכבות. התוצאה היא במרחק 10 מיקרומטר בין התאים, אשר באופן משמעותי יותר מאשר בתוך vivo, אבל עדיין משכפל רבים ויוו המאפיינים של MEJs, כולל חלבון לוקליזציה ושליח השני איתות1 , 14. בנוסף, VCCC מאפשרת מיקוד של התא איתות באמצעות התוספת של אגוניסט אנטגוניסט ל תא הסלולר ספציפי או ייחודיים לסוג. לדוגמה, טעינה ל- EC עם BAPTA-בבוקר עד chelate סידן, מגרה את SMC עם phenylephrine14. בניגוד תיאורים אחרים של תרבות שיתוף מודלים15,16,17,18,19,20,21, זה מספק הוראות על בידוד שברים נפרדים עבור ה-mRNA, חלבון, כולל השבר MEJ נפרדות בתוך הנקבוביות מסנן. התוספת של טכניקה זו VCCC מאפשר חקירה ספציפיות של שינויים ב- mRNA לוקליזציה או שעתוק22, חלבון זרחון12,23, חלבון פעילות12. מאמר זה יתאר ציפוי של הנציבות האירופית על גבי המסנן ואת SMC בתחתית, למרות שפעולה זו אפשרית על תרבות של סוגי תאים שני הייצורים החיים שונים11,18,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציפוי תאים עבור VCCC

  1. תרבות גדול 225 ס מ 2 בקבוקונים של EC ו- SMC בתנאים סטריליים ב 37 מעלות צלזיוס, עד 70-90% confluent. תבטיח EC יותר מאשר SMC שימוש; אם משתמש ראשי EC אנושי ו- SMC, בדרך כלל 3 מבחנות גדולות של EC ל 1 בקבוק גדול של SMC.
    1. להשתמש בתאים ראשי-מעברים נמוך והם אינם משתמשים מעבר פסקה 10. בחירת המדיה תרבות המבוססת על התאים להיות שותף בתרבית. עבור ראשי האדם עורקים EC, להשתמש במדיה הבזליים EC EBM-2 עם גורמי גדילה EGM2 MV. עבור ראשי SMC כלילית אנושי, להשתמש במדיה הבזליים SmBM SMC עם גורמי גדילה SmGM-2. לפני השימוש עם תאים בתרבית, להוסיף גורמי גדילה למדיה.
  2. הבנייה של 1 יום VCCC: לרסס צלחות פטרי גדולה (150 מ"מ) ומכסים עם חומר חיטוי (למשל, Cavicide), לנגב עם מגבת נייר או מגבונים ללא מוך. ואז לרסס את צלחות פטרי עם 70% אתנול (EtOH), למקם אותם בשכונה מהאוויר היבש.
  3. פתח את הצלחת של הוספת מסנן (ראה את הטבלה של חומרים) תחת תנאים סטריליים ולאחר מעיל SMC בצד (בצד התחתון של מסנן) תותב עם fibronectin פתרון. שמירה על הוספה בצלחת 6-ובכן שסופקו, pipet הפתרון fibronectin דרך הצד חריצים בתחתית הלוח, לוודא כי בתחתית חצי של המסנן זה מכוסה (לא יותר מ- 1 מ"ל).
  4. לאחר 30 דקות של טיפול עם פתרון fibronectin בטמפרטורת החדר בשכונה התרבות תאים, קח מוסיף מהצלחת, ואקום כל פתרון עודף, ועל ' היפוך ', הצבת לתוך החלק התחתון מחצית הפטרי נקי. להפריש. להיות בטוח שלא להפריע את הקרום הוספה של מסנן כאשר suctioning פתרון עודף; זה יכול להימנע על ידי הטיית הלוח ובעדינות שואב אבק הפתרון מקצה תותב.
  5. הבקבוק Trypsinize 225 ס מ 2 של SMC עם 3 מ"ל של פתרון X טריפסין-EDTA 2 ומחוממת מראש, וברגע התאים יש כבד ירד לצלחת, מוסיפים 9 מ ל מדיה SMC לנטרל את טריפסין (3:1, מדיה: טריפסין). להעביר צינור חרוטי, לערבב היטב, pipet 10 µL אל hemocytometer כדי לקבוע את המספר.
    1. ספירת מספר התאים ב- 5 x 5 תיבות (קרי, 18), תכפיל את זה ב 10,000 כדי להכניס את מספר התאים 1 מ"ל (180,000). אז תכפיל ב 12 מ ל (סה כ נפח תא השעיה, SMC 2.16 מיליון). להבטיח שאין מספיק SMC כדי לוחית רישוי מספר וולס הרצוי.
      הערה: לדוגמה, 1, ובכן צריך 75,000 SMC ויהיה ובכך בארות 18 SMC סה כ 1.35 מיליון. לחלק 1.35 מיליון תאים הדרושים על ידי תאים 180,000 לכל 1 מ"ל, התוצאה היא 7.5 mL של התליה תא זה יהיה צורך עבור ציפוי. ואז לחשב את עוצמת הקול הסופי הדרוש (18 בארות x 750 µL = 13.5 מ ל). לכן, לקחת 7.5 mL תא השעיה, להביא את אמצעי האחסון עד 13.5 מ עם מראש ומחוממת SMC מדיה, לערבב היטב.
  6. µL 750 צלחת של התליה תא המכיל כ 75,000 SMC אל הצד התחתון של כל מסנן, נזהר לא לשפוך כל אחד את הפתרון מדיה, תא. למקם את המכסה למעלה ולהעביר בזהירות על צלחת פטרי עם התוספות לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: צפיפות תא האופטימלי עבור סוגי תאים אחרים יהיה צורך להיקבע מדעית.
  7. ביום 2, למלא נקי. ובכן 6 מנות עם 2 מ"ל של מדיה SMC טריים, ומחוממת מראש. הסר את הצלחות של החממה. . קח את המכסים את אחד בכל פעם, להסיר את התקשורת על ידי שאיבה ולאחר מכן למקם את המנה 6-ובכן עם SMC מדיה.
  8. מעיל הצד הנגדי של המסנן (EC צד) עם 1 מ"ל של פתרון ג'לטין שור 0.5% במשך לפחות 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  9. Trypsinize את flask(s) 2 225 ס מ של הנציבות האירופית עם 3 מ"ל של 2 מראש ומחוממת X טריפסין-EDTA (10 x מעורבבת עם Dulbecco עקר ' s PBS) פתרון, עם הקשה עדין + בקבוקי שתייה צידניות כדי להרים את התאים מהצלחת.
    הערה: יתכן צורך למקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 דקות.
    1. פעם התאים יש כבד ירד לצלחת, מוסיפים 9 מ ל מדיה EC לנטרל את טריפסין (3:1). להעביר צינור חרוטי, בריכה יחד, לערבב היטב, pipet 10 µL אל hemocytometer כדי לקבוע את מספר הטלפון הנייד.
      1. ספירת מספר התאים ב- 5 x 5 תיבות (קרי, 60), תכפיל את זה ב 10,000 כדי להכניס את מספר התאים 1 מ"ל (600,000). אז תכפיל ב 12 מ ל (סה כ נפח תא השעיה, EC 7.2 מיליון). להבטיח שאין מספיק EC על לוחית רישוי מספר וולס הרצוי.
        הערה: EC כ 360,000 נדרשים לכל טוב. לדוגמה, בארות 18 לדרוש לכלכלת 6.48 מיליון לחלק 6.48 מיליון תאים שתתבקש על-ידי EC 600,000 לכל 1 מ"ל, התוצאה היא 10.8 מ של התליה תא זה יהיה צורך עבור ציפוי. ואז לחשב את עוצמת הקול הסופי הדרוש (בארות 18 x 1 מ"ל = 18 מ"ל). לכן, קח 10.8 מ של התא השעיה, להביא את אמצעי האחסון עד 18 מ עם מראש חימם EC מדיה, בעדינות resuspend.
  10. צלחת 1 מ"ל של 360,000 EC על הצד העליון של כל מסנן הוספה. תן את התאים דגירה ללא הפרעה ב 37 ° C ה 24 בינוני החלף ביום הרביעי. קציר ביום 5.

2. קציר שברים של VCCC

  1. לבצע את הבידוד בחדר 4 ° C ולשמור את כל הכלים על קרח
  2. לזכור את המספר של הפרט מוסיף להיות מבודדת ולהוסיף פירוק מאגר שפופרת 50 מ ל הנקרא MEJ (של המסננים מבודד). ואז תווית שתי מנות 10 מ מ; אחד EC ואחד עבור SMC.
  3. התאם את עוצמת הקול של פירוק מאגר תלוי כמה מרוכז lysate צריך להיות; 15 מוסיף, µL 500 פירוק מאגר בים MEJ, µL 250 לכל צלחת פטרי מומלץ.
  4. עבודה עם לוח 6-ובכן אחד של מוסיף בכל פעם. היניקה את המדיום הוד התרבות תאים ולאחר מכן תחבורה אל חדר קר על קרח
    הערה: ההוראות הבאות הן עבור 1 להוסיף הבידוד.
  5. Pipet 10 µL של PBS 1 x לצד SMC של הקדמי.
  6. להשתמש את מרים תא לגרד את התאים בקצה אחד של הקדמי, ולהעביר את התאים מרים לצלחת פטרי SMC בעל מאגר פירוק בתוכו
  7. , ברגע מרים תא נגע המאגר פירוק בצלחת, אינם מאפשרים לו לגעת במסנן הוספה עד יש כבר לגמרי מחה והוא התייבש על מגבות נייר. חזור על גירוד של המסנן SMC לפחות אחד עד שני פעמים כדי להסיר לחלוטין את שאריות תאים SMC הנותרים.
  8. הופכים את הוספה מעל ואת pipet 10 µL של PBS 1 x הצד העליון/EC של המסנן ' הוספה '. חזור על שלבים 2.6 ו 2.7 עם המגרד של התא, EC הפטרי.
  9. לאסוף את התאים הנותרים ואת PBS slurry מהצד EC של המסנן עם פיפטה, העברה כדי EC הפטרי עם פירוק מאגר. להיות יסודית תוך גירוד התאים את שני הצדדים של המסנן והשארת זיהום EC/SMC מינימלי של השבר MEJ.
  10. השתמש בזהירות את האזמל כדי לגזור את המסנן מהמכסה הפלסטיק. עושים זאת על ידי חיתוך 70-80% מן הפלסטיק ולהשתמש מלקחיים למשוך את המסנן לגמרי מחוץ למבנה כיסוי הפלסטיק. לשים את המסנן בצינור חרוט 50 מ עם פירוק מאגר תוויות MEJ, ולוודא שזה יושב במאגר של פירוק ונותרה רטובה.
  11. חזור על השלבים בידוד, בקבוצות של 6, עד כל התוספות עובדו.
  12. להבטיח כי קבוצות טיפול שונה שמורים בתוך צינורות נפרדת ומנות.
  13. מערבולת הצינור חרוט MEJ 50 מ בבעוצמה מלאה עבור 15 s או עד מעורבב היטב. הסר את המסננים MEJ חרוט עם מלקחיים, גורר אותם לאורך הקירות הצדדיים של הצינור והשארת את הכמות המרבית של חלבונים ושל נוזל בצינור. לאחר נקודה זו, מחק את מסנני.
  14. לאחר כל המסננים הוסרה מן הצינור חרוט MEJ, לעשות סיבוב מהיר (10-15 s ב g ~ 16,000 x מהירות מקסימלית) ומפרידה למשוך כל נוזל, חלבונים לתחתית הצינור- להעביר את התוכן של הצינור MEJ והכלים EC ו- SMC פטרי לתוך צנטריפוגה נפרדים, קטן יותר, צינורות.
  15. אופציונלי: Sonicate את התוכן של הצינורות MEJ/SMC/EC הגדרת 4 עבור s 10 שלושה פולסים על קרח או homogenize בעדינות ביד.
  16. צנטריפוגה-מהירות מקסימלית (~ 16,000 x g) 15 דקות ב-4 ° C. Pipet החוצה את תגובת שיקוע, assay lysate לתוכן חלבון בשיטת assay bicinchoninic.

3. קציר את VCCC עבור פנים En Immunofluorescence

  1. דגירה על יום 5 של VCCC, להסיר את התוספות של החממה. עובד בשכונה התרבות תאים, יניקה את התקשורת SMC מכל הבארות התחתון של הוספת מסנן, יש לשטוף פעמיים עם 1 x PBS . אני חוזר עם הצד EC.
  2. שומר את הכיסויים שלם ועל בצלחת, להוסיף 4% paraformaldehyde (PFA) למשך 10-20 דקות בחדר ותא-4 מעלות צלזיוס על מטרף עדין. לשטוף את שני הצדדים של המסנן הוספה עם PBS 1 x עבור 5 דקות וחזור פעמיים.
    התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.
  3. לבצע את incubations נוגדנים חסימות, ראשיות ומשניות בצלחת, המבטיח כי שני הצדדים של המסנן שמרו על הנוגדן + חסימת פתרון (9 מ ל PBS, 25 µL טריטון X100, אלבומין שור 50 מ"ג, 500 סרום רגיל µL)
  4. כדי לטעון את המסנן בשקופית, לחתוך את המסנן החוצה תותב פלסטיק עם איזמל רכוב על ידית בעלת המקום בשקופית מיקרוסקופ הרכבה בינונית.

4. קציר את VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

  1. דגירה על יום 5 של VCCC, להסיר את התוספות של החממה. לשאוב את התקשורת משני הצדדים של המסנן הוספה בשכונה תרבות תא ולשטוף בכל צד של המסנן פעמיים עם PBS 1 x.
  2. שומר את הכיסויים שלם ועל בצלוחית 6-ובכן, להוסיף 4% PFA דגירה בין לילה בחדר ותא-4 מעלות צלזיוס על מטרף עדין.
    התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.

5. הטבעה של VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

  1. לאחר סינון מוסיף תוקנו כ במשך 24 שעות ביממה ב- 4% מחברים, העברה עד 70% EtOH לפחות 24 שעות, אבל עד מספר שבועות.
  2. לעבד את המסננים ארוך (לילה) לרוץ על מעבד רקמות אוטומטית. השתמש בתוכנית כדלקמן: 70% EtOH במשך 30 דקות, 85% EtOH 30 דקות, 95% EtOH 30 דקות, 100% EtOH 30 דקות, 100% EtOH 45 דקות, 100% EtOH 45 דקות, קסילן 30 דקות, קסילן 30 דקות, קסילן 45 דקות, 60 ° C שעוות פרפין 30 דקות, 60 ° C שעוות פרפין 30 דקות , 60 ° C שעוות פרפין 45 דקות
  3. לאחר העיבוד, העבר המסננים שנקטפו לתחנה ההטבעה לתוך שמן פראפין, שמירה על המסנן הקלטת.
  4. להסיר את המסנן הקלטת, בזהירות באמצעות מלקחיים להחזיק את זה רק בקצה. עם מספריים, לחצי את המסנן, ויוצרים שתי חצי עגול בצורת חצאים. זיון של 2 חצאים בחלק צלחת קר של תחנת ההטבעה בדיוק זמן מספיק כדי למלא את ההטמעה עובש עם שמן פראפין.
  5. פעם מלא שמן פראפין, מאוד בקצרה לגעת את להטבעה קר לצלחת, ואז להטביע חצי אחד של המסנן לתוך הטבעת עובש (לחתוך בצד); פעולה זו מבטיחה כי בעת חלוקתה, אחד תנטרלו מהמרכז של המסנן כלפי הקצה .
  6. במהלך הטבעה, להשתמש מלקחיים להחזיק את המסנן במקום כדי למנוע את החצאים מנפילה לתוך השני עד הפרפין מגניב מספיק להם לעמוד לבד. לעבור את להטבעה צלחת קר עד פני השטח למוצק לגמרי.
    הערה: קירור בלוקים על מגשי הקרח מסייעת למנוע מקטעים מקומט.

6. חלוקתה, מכתימה את VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

  1. עבור אבני פרפין חלוקתה והחלק הרכבה: לחתוך 5 מיקרומטר מקטעים, למקם את המקטעים לתוך אמבט מים 42 ° C, ולאסוף את הסעיפים באמצעות הטעון חיובית שקופיות. ואז להשאיר ללילה שקופיות בתנור 42 ° C כדי לייבש.
  2. לפני תחילת המדרגות התייבשות, לאפות את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס להמיס הפרפין ולעזור לדבוק הסעיפים VCCC לשקופית. מגניב בקצרה, ואז להחזיר נוזלים בין השקופיות באמצעות שני שינויים של קסילן, 100% EtOH, 95% EtOH, שינוי אחד של 70% EtOH, ושני שינויים של מים מזוקקים.
  3. להימנע שיטות אחזור אנטיגן המערבות במיקרוגל או חימום כמו סעיפים יפלו מחוץ לשקופית.
  4. בצע חסימת הרגיל לשעה בטמפרטורת החדר, ואז הדגירה לילה עם נוגדן ראשוני ב 4 ° C, ואחריו שטיפה צעדים, נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר. הר עם הרכבה מדיה, coverslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יש הכיסויים המסנן המשמש את VCCC קטנה, 0.4 חורים מיקרומטר. איור 1A, מבט פנים en שיבוץ מסנן VCCC, מציג את הנקבוביות שבו MEJ יכול ליצור במבחנה. התרשים מתאר את תאי השריר החלק מצופה בצד התחתון של המסנן יום אחד לפני תאי אנדותל הם מצופה בצד הנגדי (איור 1B). ברגע התאים הם מצופים, שברים EC, MEJ ו- SMC ניתן לבודד שלושה ימים לאחר מכן. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2A, איפה plasminogen activator מעכב 1 (פאי-1) מאוד מתבטאת השבר MEJ ביחס לשאר EC, אשר נתפסת גם- ויוו MEJs25. נתונים אלה מדגימים את. התועלת VCCC בשנת recapitulating לקיר כלי דם arteriolar ללא פגע.

הבא VCCC ב immunofluorescence ואלקטרון הוא הפגין. VCCC נותר שלם וקבוע עם מחברים עבור immunofluorescence רוחבי. איור 3A מראה את שריר חלק מסוים אלפא-1 קולטנים אדרנרגיים הקולטן אנדותל bradykinin ספציפיים. Phalloidin מכתים של F-אקטין מציגה הגשרים אקטין MEJ (חץ לבן) בין שני התאים, אשר משכפל את הביטוי ראה של עורק תקין26. ב- 3B איור, חתך של VCCC כפי להצגה על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הוא הפגין, אשר הוא שניתנו ב 3D באיור 3C. תצוגות אלה של VCCC להפגין את היכולת במיוחד בתרגום חלבונים, רצפטורים, ultrastructure במבחנה MEJs.

Figure 1
איור 1: ציפוי של התרבות שיתוף תא כלי הדם (VCCC). (א) פנים En אור micrograph של הנקבוביות במסנן הוספה. חצים שחורים מציינות חורים נפרדים. תיאור סכמטי של ציפוי של VCCC (B). יום 1 מציגה היפוך של הוספה של מסנן, ציפוי SMC בתחתית. ביום 2, EC הם מצופה בצד השני של המסנן, VCCC נשאר קונפורמציה זה לתוך צלחת 6-ובכן עד הקציר. החצים הלבנים מציינים את הצד של מסנן שבו התאים הם מצופים, יגדל. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: העשרה חלבונית ב MEJ. (א) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים חיסונית-שידור של העכבר עורק עם ביטוי של אלפא גלובין-MEJ (חרוזי זהב אשר מופיעים כנקודות שחורות). (B) תספיג מציג plasminogen activator מעכב 1 (פאי-1) ביטוי מועשר בתמציות השבר MEJ לעומת שברים EC או SMC. EC פלסטיק מציין EC גדל על צלחת פלסטיק, אשר לא עושים בצורת MEJ. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: immunofluorescence רוחבי ואלקטרון בסעיפים רוחבי של VCCC. Staining (A) עבור שריר חלק, אנדותל חלבונים ספציפיים. צביעת F-אקטין היא בכל סוגי תאים והן את במבחנה MEJ (חץ לבן). דוגמה של מיקרוסקופ אלקטרונים המשמשות ללימוד ultrastructure של ה במבחנה MEJs ב 2D (B) ותלת מימד (C). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (א); 2.5 מיקרומטר (B); אנכי כ 2.5 מיקרומטר ו- 0.5 מיקרומטר אופקי (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

VCCC יש מספר יתרונות במונחים של recapitulating MEJs במבחנה, אבל יש נקודות לדיון בעת החלטה אם VCCC יכול להיות מנוצל עבור יישומים ספציפיים. לדוגמה, אם לסוגי תאים שונים לשימוש עם מודל זה, היא תצטרך להיות ממוטבים. השתמשנו תאים אנושיים הראשי, אבל ניתן לבודד תאים aortas שור24או עכברים wildtype או נוקאאוט, ולהשתמש בהם ב5,1,VCCC14.

אם משתמש VCCC את MEJ בידוד, הטכניקה הכי חשוב לשלוט הוא גירוד יסודי של המסנן כדי להבטיח כי הטוהר של השבר MEJ אינה משתנה על ידי עודף תאי אנדותל או שריר חלק. אנחנו הראו באמצעות סופג המערבי כי המוגלובין אלפא הוא הסמן הטוב ביותר "טהורה" MEJ בידוד13, המתבטאת זה צריך להיות בתוקף השבר MEJ מול השבר תא אנדותל. נוסף הוא פאי-1, המסדירה את היווצרות MEJ (איור 2)25. אנחנו מרגישים שאלה עשויים להיות טוב במיוחד סמנים בידוד MEJ חזקים. על האמון נוספות בטכניקה הבציר, המסננים עשוי להיות כל הזמן לאחר גירוד לקציר, מוכתם EC/SMC סמני25.

הדמיה ביטוי חלבון VCCC יכולה להתבצע בשני אופנים עיקריים: פנים en (איור 1 א') או רוחבי (איור 3). שני תכשירים מאפשרים הפריט החזותי של חלבונים בתוך החורים של המסנן בשני היבטים שונים. הטכניקה פנים en כרוך העורקים לפתוח longitudinally, ואז מוצמדים החוצה שטוח, עם EC פונה כלפי מעלה, כדי להמחיש את טפט EC והן את החורים אישור IEL, המקום היחיד שבו MEJ יכול ליצור. אות ניאון בתוך החורים של אישור IEL מציין לוקליזציה של החלבון בתוך10,MEJ27. זה אותו עיקרון ניתן לתרגם את VCCC על ידי הדמיה של טפט EC מלמעלה, ללא צורך להטביע אותו פרפין או הפוך את הסעיפים. השיטה רוחבי היא מורכבת יותר לשלוט אבל הוא קריטי עבור ויזואליזציה ברורים של חלבונים ב- EC לעומת SMC monolayers (איור 3).

העדר זרימה או מתיחה במערכת היא מגבלה פוטנציאליים, אך ניתן להוסיף זרימה שריר אנדותל-חלק מתא תרבות משותפת16,19. נראה כי התנאים סטטי עדיין לאפשר ביטוי חלבון מדויק מבחינה פיזיולוגית, הפעלה, לכן ייתכן שאיש הקשר heterocellular הוא הגורם החשוב ביותר בניתוח MEJ מסלולי איתות.

ישנם יישומים מרובים של טכניקה זו מעבר עמידות העורק איתות VCCC אינה בהכרח מוגבל לסוגי תאים מסוים. דגמים אחרים תרבות משותפת מנוצל תאי אנדותל תוצר ואת תאי העצם17, או המודל את מחסום הדם מוח עם אנדותל ובתרבויות pericyte/אסטרוציט משותפת21. ניתן לכמת גרורה של תאים סרטניים באמצעות אנדותל גם באמצעות מודל זה21. זה גם אפשרי לגדל תאים על מסנן, תרבות תא אחר הקלד בתחתית של המנה 6-טוב כדי לבדוק paracrine איתות, או לגדל תאי אנדותל על החלק העליון של קרום להסתכל על קיטוב של התא (התצפיות שלא פורסמו). ניתן להוסיף לויקוציטים או תאים אחרים במחזור התקשורת EC וניתן הידבקות תאים כימות12. בנוסף, VCCC יכול לשמש כדי לחקור פתולוגיות כגון שריר חלק ההעברה24 והתפשטות בתגובה לפציעה אנדותל15,18.

לסיכום, הוצגו שיטה לבודד MEJ ממערכת במבחנה תא תרבות, מה שמאפשר עבור החקירה של איתות תהליכים בין שני סוגי תאים בשילוב. חשוב, מערכת התרבות שיתוף אינה מוגבלת המחקר של MEJ והוא יכול להיות יקר כדי לענות על מספר שאלות, במיוחד אלו שמערבים heterocellular תקשורת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות, מכון דם מעניקה 14PRE20420024 אחוות predoctoral R01088554, T32HL007284 ו- American Heart Association. אנו מודים במיוחד סנט ג'וד הסלולר הדמיה משותפים מחקר הליבה, כולל וויקפילד רנדל, לינדה הורנר לתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים, אדם סטרוב לקבלת סיוע עם נציג immunofluorescence תמונות Pooneh Bagher בשבילה משוב בעל ערך בפרוטוקול כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert Corning 3450 This is one 6 well plate of inserts
225 cm flask Corning 431082
6 well plates (without filter inserts) Corning 3506
Primary human coronary artery endothelial cells Lonza CC-2585
Primary human coronary artery smooth muscle cells Lonza CC-2583
EBM-2 EC Basal media Lonza CC-3156
EC growth factors (EGM2 MV Single quots) Lonza CC-4147 Add to basal media before use
SmBM SMC basal media Lonza CC-3181
SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) Lonza CC-4149 Add to basal media before use
0.5% Trypsin-EDTA 10X Gibco 15400-054 Dilute to 2X with sterile dPBS
Hemocytometer VWR 15170-208
large petri dishes for SMC Plating (150mm) Corning 353025
Bovine gelatin Sigma G-9382
Human fibronectin Corning 356008 5µg/ml of fibronectin and store at -20
10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) Gibco 14065-056 Dilute to 1x with sterile water
10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) Gibco 14200-075 Dilute to 1x with sterile water
Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle Amazon MDS15210
Forceps Fisher 17-467-201
Cell lifter Corning 3008
Cell scraper BD Falcon 353085
50 mL conical tube Corning 352070
10 mm petri dishes Falcon 35-1008
Rneasy mini kit Qiagen 74104
RNA lysis reagent Qiagen 79306
Paraformaldehyde Sigma 158127 Make 4% solution with dPBS
70% ethanol Fisher 04-355-305
Cavicide disinfectant Fisher 131000
RIPA protein lysis buffer Sigma R0278
Sonic dismembranator Fisher Model 50
1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry Gibco 10010023 does not need to be sterile
Name Company Catalog Number Comments
Embedding/Sectioning/Staining
Paraffin Fisher P31-500
Automated tissue processer Excelsior ES
Embedding station + cold plate Leica HistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade VWR 25608-961 or 25608-964
Microscope slides Thermo Fisher 22-230-900
Coverslips Thermo Fisher 12-548-5E
Prolong Gold mounting medium Thermo Fisher P36931
Name Company Catalog Number Comments
Other Solutions **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells
Sterile dPBS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
sterile HBSS Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter).
Final concentration: 1X
Fibronectin stock solution Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed
Final concentration: 100µg/mL
Fibronectin to coat SMC side of VCCC thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL.
Final concentration: 5µg/mL
2x Trypsin EDTA solution Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) .
Final concentration: 2X
Blocking/antibody solution (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum)
Bovine gelatin to coat EC VCCC Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions.
Final concentration: 0.50%
1x PBS for harvesting cells does not need to be sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

Tags

רפואה גיליון 127 תאי אנדותל תאי שריר חלק תקשורת heterocellular תא קוטביות הפער צמתי תחזיות הסלולר מטריצה חוץ-תאית תרבות משותפת
מודל התרבות התא של התנגדות העורקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biwer, L. A., Lechauve, C.,… More

Biwer, L. A., Lechauve, C., Vanhoose, S., Weiss, M. J., Isakson, B. E. A Cell Culture Model of Resistance Arteries . J. Vis. Exp. (127), e55992, doi:10.3791/55992 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter