Summary
一个细胞培养模型的阻力动脉描述, 允许解剖的信号通路的内皮, 平滑肌, 或之间的内皮和平滑肌 (myoendothelial 交界处)。选择性应用激动剂或蛋白质隔离, 电子显微镜, 或免疫荧光可以利用这种细胞培养模型。
Abstract
myoendothelial 结 (梅杰), 一个独特的信号 microdomain 在小口径阻力动脉, 展品定位的特定的蛋白质和信号的过程, 可以控制血管的音调和血压。由于它是一个投射从内皮或平滑肌细胞, 并且由于它的小尺寸 (平均, 面积为 ~ 1 µm2), 梅杰很难孤立地研究。然而, 我们已经开发了一种细胞培养模型, 称为血管细胞共育 (VCCC), 允许体外梅杰形成, 内皮细胞极化, 并解剖的信号蛋白和过程中血管壁的阻力动脉.VCCC 有多种应用, 可以适应不同的细胞类型。该模型由两个细胞类型生长在一个过滤器的相反两侧的0.4 µm 孔, 其中体外MEJs 可以形成。在这里, 我们描述如何创建 VCCC 通过电镀细胞和分离的内皮, 梅杰, 和平滑的肌肉分数, 然后可以用于蛋白质分离或活动化验。具有完整单元格层的过滤器可以固定、嵌入和分段进行荧光分析。重要的是, 这个模型的许多发现都被证实使用了完整的阻力动脉, 凸显了它的生理相关性。
Introduction
在小直径阻力动脉, 薄内弹性板 (IEL) 分离内皮 (EC) 和平滑肌细胞 (SMC)。细胞可以通过这个弹性矩阵的孔, 并通过缝隙连接通道的直接细胞质连接1,2。这种独特的结构称为 myoendothelial 结 (梅杰)。梅杰是一个小 (大约0.5 µm x 0.5 µm, 取决于血管床), 细胞投射主要组成的内皮细胞, 但可能起源于平滑肌以及3,4。许多调查人员已经证明了在梅杰上有选择地发生的信号网络的巨大复杂性, 使它成为促进内皮和平滑肌之间双向信号传递的一个特别重要的位置5 ,6,7,8,9,10。
然而, 在梅杰的信号通路的机械解剖是很难在一个完整的动脉。由于梅杰是细胞投射, 目前无法将体内的梅杰从血管壁隔离出来。因此, 开发了 VCCC 模型1 。重要的是, VCCC 复制的生理内皮形态学11和信号的极化之间的顶端和梅杰部分的细胞12。正是这种独特的模型, 促进了发现α血红蛋白是在内皮细胞, 极化到梅杰。这与常规培养的内皮细胞不表达α血红蛋白13形成对比。对于对微血管内皮有兴趣的研究人员来说, 使用 VCCC 中培养的内皮细胞可能更合适, 特别是如果目的是解剖在小直径阻力动脉中发生的信号通路。
使用一个坚固的塑料插入物, 含有小孔直径的过滤器 (直径0.4 µm), 以培养两种不同的细胞类型, 防止细胞在层间迁移。它导致细胞之间的10µm 距离, 这是明显长于在体内, 但仍然复制许多的体内特征的 MEJs, 包括蛋白质本地化和第二信使信令1,14. 此外, VCCC 允许通过在特定的蜂窝室中加入一个激动剂或拮抗器来锁定特定的细胞类型的信号。例如, 加载 EC 与 BAPTA, 以螯合钙, 并刺激 SMC 与肾上腺素14。与其他描述共培养模式的15,16,17,18,19,20,21, 这提供关于分离 mRNA 和蛋白质的不同分数的说明, 包括过滤毛孔内的不同的梅杰分数。这项技术添加到 VCCC 允许具体调查的变化 mRNA 本地化或转录22, 蛋白质磷酸化12,23, 和蛋白质活动12。本文将描述 EC 在过滤器和 SMC 底部的电镀, 虽然可以在不同的构象中培养两个单元类型11,18,24。
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Protocol
1. 用于 VCCC 的电镀单元
- 区域性大 225 cm 2 瓶 EC 和 SMC 在不育条件下在37和 #176; C, 直到70-90% 汇合。确保使用的 EC 比 SMC 多;如果使用初级人类 ec 和 smc, 通常3大烧瓶 ec 到1大烧瓶 smc.
- 使用较低通道的主单元格, 并且不使用过去的段落10。选择基于单元格的区域性媒体共。对于原发性人冠状动脉 ec, 使用 EBM-2 ec 基底介质与 EGM2 MV 生长因子。对于原发性人冠状动脉 smc, 使用 SmBM smc 基底介质与 SmGM-2 生长因子。在使用培养细胞之前, 将生长因子添加到介质中.
- VCCC 1 天的构造: 用消毒剂 (如 、Cavicide) 喷洒大 (150 mm) 培养皿和盖子, 然后用纸巾或无绒抹布擦拭。然后用70% 乙醇 (乙醇) 喷雾培养皿, 将它们放在引擎盖上晾干.
- 在无菌条件下打开过滤器插入板 (参见 材料表 ), 并将插入物的 SMC 侧 (过滤器的底部) 涂上纤维连接蛋白溶液。保持插入在提供的6井板, 吸管纤维连接蛋白解决方案通过侧缝到底部的板, 确保底部一半的过滤器覆盖 (不超过1毫升).
- 经过30分钟的处理, 纤维连接蛋白溶液在室温下在细胞培养罩, 采取插入出的板, 真空任何过剩的解决方案, 并倒置, 放置到底部一半的清洁培育皿。预留。在吸痰过剩溶液时, 一定不要干扰过滤器插入膜;这可以避免通过轻轻地倾斜板, 并清除解决方案边缘的插入.
- 处理 225 cm 2 烧瓶与3毫升的 5ml 2X 胰蛋白酶-EDTA 溶液, 一旦细胞解除了板块, 添加9毫升 smc 介质, 以中和胰蛋白酶 (3:1, 媒体: 胰蛋白酶)。转移到锥形管, 混合好, 和吸管10和 #181; L 到例上以确定单元格号.
- 计算 5 x 5 框中的单元格数 ( 即 , 18), 将其乘以1万以获取 1 mL (18万) 中的单元格数。然后乘以12毫升 (细胞悬浮总体积, 216万 SMC)。确保有足够的 SMC, 以满足所需的油井数量.
注: 例如, 1 井应该有 7.5万 smc, 因此18口井将有135万总 smc。除以每1毫升18万细胞所需的135万细胞, 这导致7.5 毫升的细胞悬浮, 将需要电镀。然后计算所需的最终体积 (18 井 x 750 和 #181; L = 13.5 毫升)。因此, 采取7.5 毫升的细胞悬浮, 使体积高达13.5 毫升与 5ml SMC 介质, 并混合良好.
- 计算 5 x 5 框中的单元格数 ( 即 , 18), 将其乘以1万以获取 1 mL (18万) 中的单元格数。然后乘以12毫升 (细胞悬浮总体积, 216万 SMC)。确保有足够的 SMC, 以满足所需的油井数量.
- 板750和 #181; L 单元悬浮物包含大约 7.5万 SMC 到每个过滤器的底部, 注意不要泄漏任何介质和电池解决方案。将盖子放在顶部, 并在37和 #176 中小心地将培养皿与插入器一起转移到恒温箱中.
注: 其他细胞类型的最佳细胞密度将需要根据经验确定. - 在2天, 用2毫升新鲜的 5ml SMC 介质填充干净的6个菜肴。从孵化器中取出盘子。一次取出一个插入物, 然后通过抽吸将介质取出, 然后放入 SMC 介质中的6井盘中.
- 将1毫升的0.5% 牛凝胶溶液涂在过滤器 (EC 侧) 的另一侧, 在37和 #176 上至少30分钟; C.
- 处理 225 cm 2 烧瓶, 3 毫升的 5ml 2X 胰蛋白酶-EDTA (10x 稀释在无菌 Dulbecco 和 #39; s PBS) 溶液中, 轻轻敲击烧瓶, 以解除板上的细胞.
注: 可能需要将烧瓶放回37和 #176 的恒温箱中; C 为1-3 分钟。- 一旦细胞从板上脱落, 加入9毫升 EC 培养基来中和胰蛋白酶 (3:1)。转移到锥形管, 池一起, 混合好, 和吸管10和 #181; L 到例上以确定单元格数。
- 计算 5 x 5 框中的单元格数 ( 即 , 60), 将其乘以1万以获取 1 mL (60万) 中的单元格数。然后乘以12毫升 (细胞悬浮总体积, 720万 EC)。确保有足够的 EC, 以满足所需的油井数量.
注: 每个井需要大约 36万 EC。例如, 18 口井需要 648万 EC。除以每1毫升 60万 EC 所需的648万细胞, 这结果在10.8 毫升的细胞悬浮, 将需要电镀。然后计算所需的最终体积 (18 口井 x 1 毫升 = 18 毫升)。因此, 采取10.8 毫升的细胞悬浮, 使体积高达18毫升与 5ml EC 介质, 并轻轻重.
- 计算 5 x 5 框中的单元格数 ( 即 , 60), 将其乘以1万以获取 1 mL (60万) 中的单元格数。然后乘以12毫升 (细胞悬浮总体积, 720万 EC)。确保有足够的 EC, 以满足所需的油井数量.
- 一旦细胞从板上脱落, 加入9毫升 EC 培养基来中和胰蛋白酶 (3:1)。转移到锥形管, 池一起, 混合好, 和吸管10和 #181; L 到例上以确定单元格数。
- 板 1 mL 36万 EC 到每个插入过滤器的顶部。让细胞在37和 #176 不受干扰地孵育; C 为 24 h. 4 天更换培养基。5天收获.
2。从 VCCC
- 中获取分数
- 在4和 #176 中执行隔离, 并将所有仪器放在冰上.
- 请记住单独插入的数量, 并将裂解缓冲器添加到标记为梅杰的50毫升管中 (用于隔离过滤器)。然后贴上两个 10 mm 的盘子;一个用于 EC, 一个用于 SMC.
- 根据裂解物的浓度需要调整裂解缓冲液的体积; 对于15插入, 500 和 #181; 梅杰管的裂解缓冲液和250和 #181; 推荐使用每培养皿.
- 一次使用一个 6-好的插入板。吸入细胞培养罩中的培养基, 然后将其输送到冰上的冷室.
注意: 以下说明用于1插入隔离. - 吸管10和 #181; L 1x PBS 到插入的 SMC 一侧.
- 使用细胞提升器将细胞刮到插入物的一端, 并将电池从升降器转移到具有裂解缓冲液的 SMC 培养皿中.
- 当电池升降器触到盘中的裂解缓冲液后, 不要让它接触到插入式滤光片, 直到它被完全擦干并在纸巾上晾干。重复对 smc 过滤器的刮擦至少一到两次, 以完全去除其余的 smc 细胞碎片.
- 将 "插入" 和 "吸管 10" #181; 将 1x PBS 转到插入过滤器的上部/EC 一侧。重复步骤2.6 和2.7 与细胞刮刀和 EC 培养皿.
- 用吸管从过滤器的 ec 一侧收集剩余的电池和 PBS 浆料, 并将其转移到 ec 培养皿中进行裂解缓冲。要非常彻底地刮除过滤器两侧的细胞, 以使梅杰分数最小的 EC/SMC 污染.
- 小心使用手术刀从塑料插入物中切出过滤器。做到这一点, 削减70-80% 它远离塑料和使用镊子拉过滤器完全关闭塑料插入结构。将过滤器放在50毫升锥形管中, 用裂解缓冲液标记梅杰, 确保它位于裂解缓冲液中, 并保持湿润.
- 按6组重复执行隔离步骤, 直到处理完所有插入操作.
- 确保不同的治疗组保持在单独的管和菜中.
- 涡旋50毫升梅杰锥形管在全强度十五年代或直到混合好。将过滤器从梅杰的锥形带钳上取下, 将它们沿管子的侧壁拖动, 以使试管中的蛋白质和液体达到最大值。在此点之后, 丢弃筛选器.
- 一旦所有的过滤器已经从梅杰锥管中删除, 做一个快速旋转 (10-15 s 在最大速度〜 1.6万 x g) 在离心机, 把所有的液体和蛋白质的底部的管。将梅杰管和 EC 和 SMC 培养皿的内容转移到分离的小型离心管中.
- 可选: 几种梅杰/SMC/EC 管的内容在设置4三十年代脉冲在冰或质轻轻地用手.
- 离心机在最大转速 (〜 1.6万 x g) 15 分钟在4和 #176; c. 用二辛可宁测定法吸管出上清液和测定蛋白质含量的裂解物.
3。在 VCCC 孵化的5天, 为 En 免疫荧光
- 收割 VCCC, 从孵化箱中取出插入物。在细胞培养罩中工作, 从插入式过滤器的下井中抽离 SMC 介质, 用 1x PBS 冲洗两次。在 EC 方面重复.
- 保持插入完好, 并在板中, 添加4% 甲醛 (粉煤灰) 10-20 分钟在一个步入式的4和 #176; C 室在一个温和的振动筛。将插入过滤器的两侧用 1x PBS 清洗5分钟, 重复两次.
注意: 粉煤灰是有毒的, 必须小心处理. - 在板中执行阻断、主、二级抗体孵化, 确保过滤器的两侧都保存在抗体 + 阻断液中 (9 毫升 PBS、25和 #181; l X100、50毫克牛血清白蛋白、500和 #181; l 正常血清)
- 要在幻灯片上安装滤镜, 请将过滤器从塑料插入物中取出, 并将手术刀安装在手柄上, 并放置在带有安装介质的显微镜幻灯片上.
4。采集 VCCC 的横向免疫荧光
- 在 VCCC 孵化的5天, 从孵化箱中取出插入物。吸出介质从两边的插入过滤器在细胞培养罩和冲洗每一侧的过滤器两次与 1x PBS.
- 保持插入完好, 并在6井板, 增加4% 粉煤灰和孵化过夜在一个步入式的4和 #176; C 室在一个温和的振动筛.
注意: 粉煤灰是有毒的, 必须小心处理.
5。嵌入 VCCC 为横向免疫荧光
- 在过滤器插入物被固定了大约 24 h 在4% 煤灰之后, 转移到70% 乙醇为至少 24 h, 但至多几星期.
- 在自动组织处理器上长时间 (通宵) 运行过滤器。使用程序如下: 70% 乙醇30分钟, 85% 乙醇30分, 95% 乙醇30分, 100% 乙醇30分, 100% 乙醇45分, 100% 乙醇45分, 二甲苯30分, 二甲苯30分, 二甲苯45分, 60 和 #176; c 石蜡 30 min, 60 和 #176; c 石蜡 30 min, 60, #176; C 石蜡 45 min.
- 经过处理后, 将采集到的过滤器转移到液体石蜡中, 将过滤器保存在卡带中.
- 从卡带上取下过滤器, 小心地用镊子把它放在边缘。用剪刀把过滤器切成两半, 形成半圆状半。放置在埋置站的冷板部分的2一半, 只要足够长的时间, 以填补嵌入模具与液体石蜡.
- 一旦充满液体石蜡, 很简单地将嵌入模具接触到冷板, 然后将每半部分的过滤器嵌入模具 (切边); 这确保在剖切过程中, 一个将从过滤器的中心向边缘切割.
- 在嵌入过程中, 使用镊子将过滤器放置到位, 以防止两个部分相互掉落, 直到石蜡冷却到足以让它们单独站立为止。将嵌入模具移至冷板, 直到完全凝固.
注: 冰盘上的冷却块有助于防止皱纹的部分.
6。VCCC 横向免疫荧光的切片和染色
- 用于石蜡切片和滑动安装: 切割5和 #181; m 节, 将剖面放置到42和 #176 中; C 水浴, 并拿起的部分使用正电荷幻灯片.然后在42和 #176 中一夜之间保持幻灯片; C 烘箱晾干.
- 在开始补液步骤之前, 在60和 #176 烘烤幻灯片; C 将石蜡融化, 并帮助将 VCCC 部分粘附到幻灯片上。冷却简单, 然后水化的幻灯片通过两个变化的二甲苯, 100% 乙醇, 95% 乙醇, 一个变化的70% 乙醇, 和两个变化的蒸馏水.
- 避免抗原检索方法, 涉及微波或加热的部分可能脱落的幻灯片.
- 在室温下执行1小时的标准阻塞, 然后在4和 #176 中使用主抗体进行过夜孵育, 其次是室温下的洗涤步骤和1小时的二次抗体。安装介质和片.
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Representative Results
用于 VCCC 的过滤器插入物有小, 0.4 µm 孔。图 1A, VCCC 滤镜嵌入的en 面视图显示了梅杰可以在体外形成的毛孔。该示意图描绘的是光滑的肌肉细胞镀上的过滤器的下部前一天内皮细胞被镀在对面 (图 1B)。一旦细胞被镀, EC, 梅杰, 和 SMC 分数可以隔离三天后。其中的一个示例显示在图 2A中, 其中纤溶酶原激活剂抑制剂 1 (PAI-1) 在梅杰分数中与 EC 的其余部分高度表达, 这也见于体内MEJs25。这些数据表明 VCCC 在综述完整的动脉血管壁的效用。
其次, VCCC 在免疫荧光和电子显微镜的证明。VCCC 保持完好, 用粉煤灰固定, 用于横向免疫荧光。图 3A显示了平滑肌特异的 alpha-1 肾上腺素受体和内皮特异的缓激肽受体。笔染色的 f-肌动蛋白显示肌动蛋白桥在梅杰 (白色箭头) 之间的两个细胞, 这复制的表达式看到完整的动脉26。在图 3B中, 通过透射电子显微镜观察到的 VCCC 的剖面显示在图 3C中的3D 中呈现。VCCC 的这些观点展示了将蛋白质、受体和超微结构特异地定位到体外MEJs 的能力。
图 1: 血管细胞 Co 培养的电镀 (VCCC).(A) En 面在插入滤镜中的孔隙的显微图像。黑色箭头表示单个孔。(B) 电镀 VCCC 的示意图。1天显示了倒置的过滤器插入和电镀 SMC 在底部。在2天, EC 被镀在过滤器的反面和 VCCC 保持在这个构象在一个6井板直到收获。白色箭头表示过滤器的侧面, 其中的细胞被镀并将增长。缩放条 = 1 mm请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 梅杰中的蛋白质富集.(A) 小鼠动脉的免疫透射电镜图像, 表达α珠在梅杰 (金珠显示为黑点)。(B) 显示纤溶酶原激活剂抑制剂 1 (PAI-1) 表达的西方印迹在梅杰分数与 EC 或 SMC 分数中富集。塑料 ec 表明 ec 生长在一个塑料盘, 不形成梅杰。缩放栏 = 1 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 横向免疫荧光和电子显微镜在横断面的 VCCC.(A) 为平滑肌和内皮特异蛋白染色。F-肌动蛋白染色是在两个细胞类型和体外梅杰 (白色箭头)。一个电子显微镜的例子, 用于研究超微结构的在体外MEJs 都在 2D (B) 和 3D (C).刻度栏 = 10 µm (A);2.5 µm (B);和大约2.5 µm 垂直和0.5 µm 水平 (C)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
VCCC 在综述 MEJs 的体外方面有许多优点, 但是在确定是否可以将 VCCC 用于特定的应用程序时, 还有一些讨论点。例如, 如果要与此模型一起使用不同的单元格类型, 则需要对其进行优化。我们已经使用了主要的人类细胞, 但它可以隔离的细胞从牛脉24, 或野生或淘汰赛小鼠, 并使用它们在 VCCC1,5,14。
如果使用 VCCC 梅杰隔离, 最重要的技术, 掌握是彻底刮的过滤器, 以确保梅杰分数的纯度不改变过多的内皮或平滑肌细胞。我们通过西方印迹显示, α血红蛋白是 "纯" 梅杰隔离13的最佳标记, 因为它应该在梅杰分数与内皮细胞分数之间的强烈表达。另一个是 PAI-1, 它调节梅杰 (图 2)25的形成。我们认为这些可能是一个强大的梅杰隔离的特别好的标志。为获得额外的收获技术的信心, 过滤器可以保留后, 刮收获, 并染色 EC/SMC 标记25。
VCCC 中的成像蛋白表达可以通过两种主要方式执行: en 面(图 1A) 或横向 (图 3)。两种制剂都允许从两种不同的角度对过滤器孔内的蛋白质进行可视化。en 面技术涉及的是纵向切开的动脉, 然后将其固定在平坦的地方, 使 ec 朝上, 以可视化 ec 单层和 IEL 中的孔, 这是梅杰可以形成的唯一位置。IEL 孔内的荧光信号表示梅杰10,27中的蛋白质本地化。同样的原理可以通过从上面的 EC 单层成像来转化为 VCCC, 而不需要将其嵌入石蜡或制作切片。横向方法是更复杂的掌握, 但对于不同的可视化的蛋白质在 EC 与 SMC 单膜 (图 3) 的关键。
缺乏流动或伸展系统是一个潜在的限制, 但它是可能的增加流在内皮平滑肌细胞共培养16,19。似乎静态条件仍然允许生理上准确的蛋白质表达和活化, 因此可能是 heterocellular 接触是最重要的因素解剖的梅杰信号通路。
这项技术有多种应用, 超越阻力动脉信号, 因为 VCCC 并不一定限于特定的细胞类型。其他共培养模型利用了生长中的内皮细胞和成骨的17, 或模拟了血脑屏障与内皮和细胞/星形胶质 co-cultures21。肿瘤细胞通过内皮的转移也可以用这个模型来量化21。也可以在过滤器上生长细胞, 培养 6-井盘底部的另一种细胞类型, 以测试分泌信号, 或在膜上部生长内皮细胞以观察细胞的极化 (我们未发表的观察)。白细胞或其他循环细胞可以添加到 EC 介质中, 并可定量化12。此外, VCCC 可用于调查的病症, 如平滑肌移植24和增殖反应内皮损伤15,18。
最后, 我们提出了一种将梅杰从体外细胞培养系统中分离出来的方法, 它允许对两个耦合细胞类型之间的信号过程进行研究。重要的是, 共培养体系不仅限于对梅杰的研究, 而且对于回答一些问题, 特别是涉及 heterocellular 的交流, 是有价值的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家心脏, 肺和血液研究所的资助 R01088554, T32HL007284 和美国心脏协会 predoctoral 奖学金14PRE20420024。我们特别感谢 St. 裘德细胞成像共享的研究核心, 包括兰德尔和霍纳的电子显微镜图像, 亚当 Straub 为协助与代表性的免疫荧光图像, 和 Pooneh 巴盖尔·阿萨迪为她对原稿协议有价值的反馈。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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