Summary
É descrito um modelo de cultura celular de artérias de resistência, permitindo a dissecção da sinalização de caminhos no endotélio, músculo liso, ou entre o endotélio e músculo liso (a junção de myoendothelial). A aplicação selectiva de agonistas ou isolamento da proteína, microscopia eletrônica ou imunofluorescência pode ser utilizada usando esse modelo de cultura celular.
Abstract
A junção myoendothelial (MEJ), um único microdomain sinalização nas artérias de resistência de pequeno diâmetro, exibe a localização de proteínas específicas e processos de sinalização que podem controlar o tônus vascular e pressão sanguínea. Como é uma projeção de qualquer célula endotelial ou músculo liso e devido ao seu pequeno tamanho (em média, uma área de ~ 1 µm2), o MEJ é difícil estudar isoladamente. No entanto, nós desenvolvemos um modelo de cultura de células chamado de cultura de células vasculares, co (VCCC) que permite em vitro MEJ formação, polarização da célula endotelial e dissecação de processos na parede vascular da resistência e proteínas de sinalização artérias. A VCCC tem uma infinidade de aplicações e pode ser adaptado para se adequar a diferentes tipos de células. O modelo consiste de dois tipos de células cultivados em lados opostos de um filtro com 0,4 µm poros, em que o em vitro Dinho Mello pode formar. Aqui descrevemos como criar o VCCC via chapeamento de células e isolamento de endotelial, MEJ e frações de músculo liso, que podem ser usadas para o isolamento de proteínas ou atividade ensaios. O filtro com camadas de célula intacta pode ser fixo, incorporado e seccionado para análise de imunofluorescência. Importante, muitas das descobertas deste modelo foram confirmadas usando artérias de resistência intacta, ressaltando sua relevância fisiológica.
Introduction
Nas artérias de resistência de pequeno diâmetro, uma fina lâmina elástica interna (IEL) separa endotelial (CE) e células musculares lisas (SMC). As células podem projeto através de furos nesta matriz elástica e fazer conexões citoplasmáticas diretas via lacuna junção canais1,2. Esta estrutura original é denominada junção myoendothelial (MEJ). O MEJ é um pequeno (aproximadamente 0,5 µm x 0,5 µm, dependendo da cama vascular), projeção celular composta predominantemente por células endoteliais, mas pode se originar de músculo liso também3,4. Um número de investigadores demonstraram a imensa complexidade de sinalização de redes que ocorrer seletivamente no MEJ, tornando-o um local especialmente importante para facilitar a sinalização de bi-direcional entre endotélio e músculo liso5 ,6,7,8,9,10.
No entanto, uma dissecação mecanicista das vias de sinalização para o MEJ é difícil em uma artéria intacta. Porque o MEJ é uma projeção de celular, não é atualmente possível isolar um na vivo MEJ da parede vascular. Por este motivo, foi desenvolvido o modelo VCCC1 . Importante, a VCCC Replica fisiológicas morfologia endotelial11 e polarização de sinalização entre o apical e MEJ porções da célula12. Foi este modelo que facilitou a descoberta de que a alfa-hemoglobina na célula endotelial, é polarizada para o MEJ. Isto está em contraste com células endoteliais convencionalmente cultivadas que não expressam alfa hemoglobina13. Para pesquisadores interessados no endotélio microvascular, pode ser mais adequado utilizar células endoteliais, que tenham sido cultivadas na VCCC, particularmente se a intenção é dissecar as vias de sinalização que ocorrem nas artérias de resistência de pequeno diâmetro.
Usando uma inserção plástica resistente, contendo um filtro com poros de pequeno diâmetro (0,4 µm de diâmetro) para tipos de células distintas de co-cultura dois impede que as células migrando entre camadas. Isso resulta em uma distância de 10 µm entre as células, que é significativamente maior do que em vivo, mas ainda Replica muitas das características de Dinho Mello, incluindo a localização da proteína e segundo mensageiro sinalização1 na vivo , 14. Além disso, o VCCC permite a segmentação da célula tipo específico de sinalização através da adição de um agonista ou antagonista ao compartimento celular específico. Por exemplo, carregar o CE com BAPTA-AM de Quelato de cálcio e estimulando o SMC com fenilefrina14. Em contraste com outras descrições de co-cultura modelos15,16,17,18,19,20,21, isto fornece instruções sobre como isolar as distintas frações de mRNA e proteína, incluindo a fração MEJ distinta dentro dos poros do filtro. A adição desta técnica para a VCCC permite investigações específicas de mudanças na localização do mRNA ou transcrição22, fosforilação de proteínas12,23e proteína atividade12. Este artigo irá descrever chapeamento da CE no topo do filtro e SMC na parte inferior, embora seja possível à cultura os tipos de duas células em diferentes conformações11,18,24.
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Protocol
1. chapeamento de células para a VCCC
- cultura grande 225 cm 2 frascos de CE e SMC em condições estéreis a 37 ° C, até 70-90% de Confluencia. Certifique-se de que a CE mais do que o SMC são usados; se usando CE humana primária e SMC, tipicamente 3 frascos grandes da CE para 1 frasco grande de SMC.
- Use as células primárias em passagens inferiores e não use passado passagem 10. Escolha os meios de cultura com base em células a ser co culta. Para artéria coronária primária humana CE, use mídia basal EBM-2 CE com fatores de crescimento EGM2 MV. Para SMC coronária humana primária, use mídia basal SmBM SMC com fatores de crescimento SmGM-2. Antes da sua utilização com células cultivadas, adicionar fatores de crescimento para a mídia.
- Construção do VCCC dia 1: Spray pratos de Petri (150 mm) grande e tampas com desinfetante (por exemplo, Cavicide) e limpe com uma toalha de papel ou toalhetes de fiapos. Em seguida pulverizar os pratos de Petri com 70% de etanol (EtOH) e colocá-los na capa de ar seco.
- Abrir a placa de pastilhas do filtro (consulte a Tabela de materiais) em condições estéreis e revestimento do lado SMC (parte inferior do filtro) da inserção com solução de fibronectina. Manter a inserção na placa 6-bem fornecida, pipetar a solução de fibronectina através do lado corta a parte inferior da placa, certificando-se que o fundo metade do filtro é coberto (não mais de 1 mL).
- Após 30 min de tratamento com solução de fibronectina à temperatura do capuz de cultura celular, leve inserções fora da placa, vácuo qualquer solução em excesso e invertido, colocando no fundo metade do prato de Petri limpa. Posta de lado. Certifique-se para não perturbar o filtro de membrana de inserção quando aspirar a solução em excesso; Isto pode ser evitado pelo delicadamente inclinando a placa e aspirar a solução fora da borda da inserção da.
- Trypsinize um 225 cm 2 frasco de SMC com 3 mL de solução de X do Trypsin-EDTA 2 previamente aquecido, e uma vez que as células têm levantado o prato, adicionar mídia SMC 9 mL para neutralizar a tripsina (3:1, mídia: tripsina). Transfira para um tubo cónico, misture bem e pipetar 10 µ l em um hemocytometer para determinar o número de celular.
- Contagem do número de células em 5 x 5 caixas (ou seja, 18), multiplique isso por 10.000 para obter o número de células em 1 mL (180.000). Então, multiplique por 12 mL (volume total de suspensão de células, SMC 2,16 milhões). Certifique-se de que há suficiente SMC para o número desejado de poços da placa.
Nota: por exemplo, 1 bem deve ter 75.000 SMC e, portanto, 18 poços teria SMC total 1,35 milhões. Dividir células 1,35 milhões necessárias por 180.000 células / mL 1 e isso resulta em 7,5 mL da suspensão de células que serão necessários para o chapeamento. Em seguida, calcular o volume final necessário (18 poços x 750 µ l = 13,5 mL). Assim, tomar 7,5 mL da suspensão de células, trazer o volume com mídia SMC previamente aquecido e misture bem até 13,5 mL.
- Contagem do número de células em 5 x 5 caixas (ou seja, 18), multiplique isso por 10.000 para obter o número de células em 1 mL (180.000). Então, multiplique por 12 mL (volume total de suspensão de células, SMC 2,16 milhões). Certifique-se de que há suficiente SMC para o número desejado de poços da placa.
- Placa 750 µ l de suspensão de células contendo aproximadamente 75.000 SMC na parte inferior de cada filtro, tomando cuidado para não derramar nenhum da solução de mídia e o celular. Coloque a tampa na parte superior e transferir com cuidado a placa de Petri com as inserções para a incubadora a 37 ° C durante a noite.
Nota: A densidade celular ideal para outros tipos de célula terá que ser determinado empiricamente. - No dia 2, encher bem limpo 6 pratos com 2 mL de mídia SMC fresca, previamente aquecida. Retire as placas da incubadora. Leve as inserções para fora um de cada vez e remova a mídia por sucção, em seguida, coloque no prato com mídia SMC 6-poços.
- Casaco do lado oposto do filtro (lado do CE), com 1 mL de uma solução de gelatina bovina de 0,5% pelo menos 30 min a 37 ° C.
- Trypsinize a 225 cm 2 flask(s) da CE com 3 mL de pré-aquecido 2 X Trypsin-EDTA (10 x diluído em Dulbecco estéril ' s PBS) solução, com suave toque do balão a fim de levantar as células no prato.
Nota: Pode ser necessário colocar o balão de volta para a incubadora a 37 ° C por 1-3 min.- Uma vez que as células tem levantado o prato, adicionar mídia de CE 9 mL para neutralizar a tripsina (3:1). Transfira para um tubo cónico, piscina juntos, misture bem e pipetar 10 µ l em um hemocytometer para determinar o número do celular.
- Contagem do número de células em 5 x 5 caixas (ou seja, 60), multiplique isso por 10.000 para obter o número de células em 1 mL (600.000). Então, multiplique por 12 mL (volume total de suspensão de células, CE 7,2 milhões). Certifique-se de que há suficiente CE para o número desejado de poços da placa.
Nota: CE aproximadamente 360.000 são necessários por bem. Por exemplo, 18 poços exigem 6,48 milhões EC. Dividir células 6,48 milhões necessárias pela CE 600.000 por 1 mL e isso resulta em 10,8 mL de suspensão de células que serão necessários para o chapeamento. Em seguida, calcular o volume final necessário (18 poços x 1 mL = 18 mL). Assim, 10,8 ml da suspensão de células, trazer o volume até 18 mL com pré aquecido mídia CE e ressuspender delicadamente.
- Contagem do número de células em 5 x 5 caixas (ou seja, 60), multiplique isso por 10.000 para obter o número de células em 1 mL (600.000). Então, multiplique por 12 mL (volume total de suspensão de células, CE 7,2 milhões). Certifique-se de que há suficiente CE para o número desejado de poços da placa.
- Uma vez que as células tem levantado o prato, adicionar mídia de CE 9 mL para neutralizar a tripsina (3:1). Transfira para um tubo cónico, piscina juntos, misture bem e pipetar 10 µ l em um hemocytometer para determinar o número do celular.
- 1 mL de 360.000 CE no lado superior de cada filtro de inserção da placa. Deixe que as células incubar imperturbável a 37 ° C, por meio de substituir 24 h. no dia 4. Colheita no dia 5.
2. Colheita de frações da VCCC
- executar o isolamento em uma sala de 4 ° C e manter todos os instrumentos na Ice.
- Manter em mente o número de inserções individuais sendo isolado e adicionar Lise para um tubo de 50ml rotulado MEJ (para os filtros isolados). Em seguida, dois pratos de 10mm de rótulo; uma para CE e outra para SMC.
- Ajustar o volume de tampão de Lise dependendo como concentrado precisa ser o lisado; para 15 insere, 500 µ l de tampão de Lise para o tubo do MEJ e 250 µ l por placa de Petri são recomendados.
- Trabalho com um 6-placa de pastilhas de cada vez. Sucção fora o médio no capô de cultura celular e depois transporte para uma sala fria na Ice.
Nota: As instruções a seguir são para 1 Insira isolamento. - Pipeta de 10 µ l de PBS 1x para o lado SMC da inserção da.
- Utilize o elevador de célula para raspe as células para uma extremidade da inserção e transferir as células de suporte de atendimento para o prato de Petri de SMC, que tem o tampão de Lise em la
- , Uma vez que o levantador celular tocou a Lise no prato, não deixe-o tocar o filtro de inserir até foi completamente apagado e secar sobre papel-toalha. Repita a raspagem do filtro SMC pelo menos uma a duas vezes para remover totalmente os detritos de células restantes SMC.
- Transformar a inserção sobre e pipetar 10 µ l de PBS 1x do lado superior/CE do filtro de inserção. Repita as etapas 2.6 e 2.7 com um raspador de célula e o prato de Petri CE.
- Recolher as restantes células e chorume de PBS do lado CE do filtro com uma pipeta e transferência para o prato de Petri CE com Lise. Ser muito minucioso em raspar as células fora ambos os lados do filtro sobre deixar contaminação mínima de CE/SMC na fração MEJ.
- Cuidadosamente use o bisturi para cortar o filtro da inserção plástica. Para fazer isso, corte 70-80% do que longe de plástico e use a pinça para puxar o filtro completamente fora da estrutura de inserção plástica. Coloque o filtro no tubo cónico de 50ml rotulado MEJ com Lise e certifique-se de que participa a Lise e permanece molhada.
- Repita as etapas de isolamento, em grupos de 6, até que todas as inserções foram processadas.
- Garantir que os grupos de tratamento diferentes são mantidos em tubos separados e pratos.
- Vortex o tubo cónico de MEJ 50ml na máxima força para 15 s ou até misturado bem. Retire os filtros do MEJ cónico com fórceps, arrastá-las ao longo das paredes do lado do tubo a deixar a quantidade máxima de proteínas e líquido no tubo. Após este ponto, descartar os filtros.
- , Uma vez que todos os filtros foram removidos do tubo cónico de MEJ, fazer uma volta rápida (10-15 s a velocidade máxima ~ 16.000 x g) em uma centrífuga para puxar todo o líquido e proteínas para o fundo do tubo. Transferir o conteúdo do tubo MEJ e os CE e SMC Petri pratos para tubos de centrífuga separado, menor.
- Opcional: proceda à sonicação o conteúdo dos tubos MEJ/SMC/CE na configuração 4 para pulsos de três 10 s no gelo ou homogeneizar suavemente pela mão.
- Centrifugar a velocidade máxima (~ 16.000 x g) 15 min a 4 ° C. Pipetar o sobrenadante de fora e do ensaio o lisado para conteúdo de proteína usando o método de ensaio de bicinchoninic.
3. Colheita a VCCC por imunofluorescência Rosto En
- de incubação no dia 5 de VCCC, remover as inserções da incubadora. Trabalhando no bairro cultura celular, sucção fora da mídia SMC de cada um dos poços inferiores da inserção de filtro e lave duas vezes com PBS 1x. Repita com o lado de CE.
- Mantendo as inserções intacta e na placa, adicionar 4% paraformaldeído (PFA) por 10-20 min em uma sala de walk-in 4 ° C num agitador suave. Lave os dois lados do filtro inserir com PBS 1x por 5 min e repita duas vezes.
Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado. - Realizar a incubação do anticorpo de bloqueio, primário e secundário na placa, garantindo que ambos os lados do filtro são mantidos no anticorpo + solução de bloqueio (9 mL de PBS, 25 µ l Triton X100, 50 mg albumina de soro bovino, 500 µ l de soro normal)
- Para montar o filtro em um slide, cortar o filtro a inserção plástica com um bisturi, montado sobre um identificador e coloque sobre uma lâmina de microscópio com meio de montagem.
4. Colheita a VCCC por imunofluorescência transversal
- de incubação no dia 5 de VCCC, remover as inserções da incubadora. Os meios de comunicação de ambos os lados do filtro inserção do capuz de cultura celular de sucção e enxaguar cada lado do filtro duas vezes com PBS 1x.
- Mantendo as inserções intacta e na placa de 6, adicionar 4% PFA e incubar durante uma noite em um quarto de walk-in 4 ° C num agitador gentil.
Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
5. Incorporando a VCCC por imunofluorescência transversal
- após o filtro inserções tenham sido fixadas aproximadamente 24 h em 4% PFA, transferência para 70% EtOH pelo menos 24 h, mas até várias semanas.
- Processar os filtros em um longo (overnight), executado em um processador de tecido automatizado. Use o programa da seguinte forma: 70% EtOH para 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xileno 30 min, xileno 30 min, xileno 45 min, 60 ° C de parafina 30 min, 30 min de parafina de 60 ° C , 45 min. de parafina de 60 ° C
- Após o processamento, transferir os filtros colhidos para a estação de encastre em parafina líquida, mantendo o filtro na gaveta.
- Retirar o filtro da gaveta, cuidadosamente, usando fórceps para segurá-la apenas na borda. Com uma tesoura, corte o filtro ao meio, formando dois semi circular em forma de metades. Lino cada uma das 2 metades na porção prato frio da estação de encaixe apenas tempo suficiente para encher a incorporação de um molde com parafina líquida.
- Uma vez cheio de parafina líquida, muito brevemente toca o molde encaixe para a placa fria, em seguida incorporar cada metade do filtro para incorporação de molde (cortado lado para baixo); isso garante que durante o corte, um vai cortar no centro do filtro em direção à borda .
- Durante a incorporação, usar pinça para segurar o filtro no lugar para evitar as metades de cair uns aos outros até que a parafina é legal o suficiente para eles ficar sozinho. Mover o molde de encaixe para um prato frio até completamente solidificado.
Nota: Blocos em forma de gelo de refrigeração ajuda a prevenir seções enrugadas.
6. Seccionamento e manchando a VCCC por imunofluorescência transversal
- para os blocos de parafina de seccionamento e deslize de montagem: 5 µm de seções de corte, coloque as seções em banho maria a 42 ° C e pegar as seções usando positivamente carregado slides. Então mantenha slides durante a noite em um forno de 42 ° C para secar.
- Antes de iniciar as etapas de reidratação, asse os slides a 60 ° C para derreter a parafina e ajudar a aderir as seções VCCC para o slide. Esfriar rapidamente e, em seguida, Re-hidratar os slides por duas mudanças de xileno, 100% EtOH, 95% EtOH, uma mudança de 70% EtOH e duas mudanças de água destilada.
- Evitar métodos de recuperação de antígeno que envolvem microondas ou aquecimento como seções podem cair fora do slide.
- Executar o bloqueio padrão por 1h à temperatura ambiente, então a incubação durante a noite com o anticorpo primário a 4 ° C, seguido de lavagem passos e anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente. Montar com os meios de montagem e lamela.
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Representative Results
As inserções de filtro usadas para a VCCC têm pequenas, 0,4 µm de furos. Figura 1A, uma rosto pt vista a inserção de filtro VCCC, mostra os poros no qual o MEJ pode formar em vitro. O diagrama esquemático retrata as células de músculo liso chapeadas no lado inferior do filtro, um dia antes das células endoteliais são banhadas no lado oposto (figura 1B). Uma vez que as células são banhadas, as frações de CE, MEJ e SMC podem ser isolados três dias mais tarde. Um exemplo disso é mostrado na Figura 2A, onde inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1) é altamente expressa na fração MEJ em relação ao restante da CE, que também é visto na vivo Dinho Mello25. Estes dados demonstram a utilidade da VCCC em recapitulando a parede dos vasos sanguíneos intactos arteriolar.
Em seguida o VCCC em imunofluorescência e microscopia eletrônica é demonstrado. A VCCC é deixado intacto e fixo com PFA para imunofluorescência transversal. A figura 3A mostra o receptor adrenérgico específico de músculo liso alfa-1 e o receptor endotelial bradicinina específico. Faloidina coloração de F-Actina mostra as pontes de actina no MEJ (seta branca) entre as duas células, que Replica a expressão vista em uma artéria intactas26. Na Figura 3B, um corte transversal da VCCC como visto por microscopia eletrônica de transmissão é demonstrado, que é renderizado em 3D na Figura 3. Esses modos de exibição de VCCC a demonstram a capacidade de localizar especificamente ultraestrutura em vitro Dinho Mello, receptores e proteínas.
Figura 1: chapeamento da cultura co célula Vascular (VCCC). (A) cara En luz Micrografia dos poros no filtro de inserção. Setas pretas indicam buracos individuais. (B) diagrama esquemático do chapeamento a VCCC. Dia 1 mostra a inversão de inserir o filtro e chapeamento SMC na parte inferior. No dia 2, o CE são banhados no lado oposto do filtro e a VCCC permanece nesta conformação em uma placa de 6 até a colheita. Setas brancas indicam o lado do filtro onde as células são banhadas e crescerão. Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: enriquecimento de proteína no MEJ. (A) imagem de microscópio eletrônico de imuno-transmissão de artéria de rato com expressão de Globina alfa para o MEJ (grânulos ouro que aparecem como pontos pretos). (B) borrão ocidental mostrando inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1) a expressão é enriquecido na fração MEJ contra as frações CE ou SMC. Plástico CE indica CE cultivada em um prato de plástico, que não formam MEJ. Barra de escala = 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: transversal imunofluorescência e microscopia eletrônica em secções transversais da VCCC. (A) coloração para musculares lisas e endoteliais proteínas específicas. Coloração de F-Actina é ao longo de ambos os tipos de células e o em vitro MEJ (seta branca). Um exemplo de microscopia eletrônica, utilizado para estudar a ultraestrutura do em vitro Dinho Mello ambos em 2D (B) e 3D (C). Barra de escala = 10 µm (A); 2,5 µm (B); e aproximadamente 2,5 µm vertical e horizontal 0,5 µm (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A VCCC tem uma série de vantagens em termos de recapitulando Dinho Mello em vitro, mas existem pontos de discussão ao determinar se o VCCC pode ser utilizado para aplicações específicas. Por exemplo, se diferentes tipos de células a ser usado com este modelo, ele precisará ser otimizado. Nós usamos as células humanas primárias, mas é possível isolar as células da aorta bovina24, ou sua ou mata-mata ratos, e usá-los na VCCC1,5,14.
Se usar o VCCC para isolamento de MEJ, a mais importante técnica de mestre é raspagem completa do filtro para garantir que a pureza da fração MEJ não é alterada por células endoteliais ou músculo liso em excesso. Mostramos através de mancha ocidental que alfa hemoglobina é a melhor colocação de um "puro" MEJ isolamento13, como deve ser fortemente expressa na fração MEJ contra a fração de células endoteliais. Outra é PAI-1, que regula a formação do MEJ (Figura 2)25. Sentimos que estes podem ser especialmente boas marcadores para um isolamento MEJ robusto. Para confiança extra na técnica de colheita, os filtros podem ser mantidos após a raspagem para colheita e manchados por CE/SMC marcadores25.
Expressão da proteína na VCCC de imagem pode ser realizada de duas maneiras principais: rosto pt (figura 1A) ou transversal (Figura 3). Ambas as preparações permitem a visualização de proteínas dentro os orifícios do filtro a partir de duas perspectivas diferentes. A técnica de rosto pt envolve artérias que são cortadas longitudinalmente e então derrotou fora plana, com a CE virada para cima, para visualizar tanto a monocamada de CE e o IEL, o único lugar onde o MEJ pode formar os buracos. Um sinal fluorescente dentro dos orifícios do IEL indica a localização da proteína dentro do MEJ10,27. Este mesmo princípio pode ser traduzido para o VCCC por imagem a monocamada de CE de cima, sem a necessidade de incorporá-lo em parafina ou fazer seções. O método transversal é mais complexo para o mestre, mas é crítico para visualização distinta de proteínas da CE contra as monocamadas SMC (Figura 3).
A falta de fluxo ou estiramento do sistema é uma limitação potencial, mas é possível adicionar o fluxo em um músculo liso-endotelial célula co-cultura16,19. Parece que as condições estáticas permitem ainda para a expressão da proteína fisiologicamente exato e ativação, então pode ser que o contato heterocelulares é o fator mais importante na dissecação do MEJ vias de sinalização.
Existem várias aplicações desta técnica além da resistência artéria sinalização como o VCCC não é necessariamente limitado de tipos de células específicas. Outros modelos de co-cultura têm utilizado células endoteliais consequência e osteoblastos17, ou modelado a barreira hemato-encefálica com endotelial e Pericito/astrocyte co culturas21. Metástase de células tumorais através do endotélio pode também ser quantificada usando este modelo21. Também é possível crescer células no filtro e cultura outra célula digite no fundo do prato 6-poços para testar a sinalização parácrina, ou crescer células endoteliais na parte superior da membrana de olhar para a polarização da célula (nossas observações não publicadas). Leucócitos ou outras células circulantes podem ser adicionadas para a mídia do CE e a adesão de células pode ser quantificada12. Além disso, o VCCC pode ser usado para investigar patologias tais como migração de músculo liso24 e proliferação em resposta a lesão endotelial15,18.
Em conclusão, apresentamos um método para isolar MEJ de um em vitro cultura sistema de células, que permite a investigação de processos entre dois tipos de células acopladas a sinalização. Importante, o sistema de cultura co não está limitado ao estudo do MEJ e pode ser valioso para responder algumas perguntas, especialmente aqueles que envolvem a comunicação heterocelulares.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela nacional do coração, pulmão e sangue Instituto concede R01088554, T32HL007284 e American Heart Association 14PRE20420024 de bolsa de doutoramento. Agradecemos especialmente a St Jude celular Imaging compartilhado pesquisa núcleo, incluindo Randall Wakefield e Linda Horner para as imagens de microscopia eletrônica, Adam Straub para obter assistência com imagens representativas da imunofluorescência e Pooneh Bagher por ela Comentários valiosos sobre o protocolo de manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
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| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
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| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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