Summary
Un modèle de culture cellulaire des artères de résistance est décrite, permettant la dissection de la signalisation des voies dans l’endothélium, muscle lisse, ou entre l’endothélium et de muscle lisse (la jonction de myoendothéliales). L’application sélective des agonistes ou isolement de protéine, la microscopie électronique ou immunofluorescence peut être utilisée à l’aide de ce modèle de culture cellulaire.
Abstract
La jonction myoendothéliales (MEJ), un microdomaine signalisation unique dans les artères de petit diamètre de résistance, montre la localisation des protéines spécifiques et des processus de signalisation qui peuvent contrôler le tonus vasculaire et la pression artérielle. Comme c’est une projection de la part de la cellule endothéliale ou de muscle lisse et en raison de sa petite taille (en moyenne, une superficie d’environ 1 µm2), le MEJ est difficile à étudier dans l’isolement. Cependant, nous avons développé un modèle de culture cellulaire appelé la culture mixte de cellules vasculaires (coup) qui permet in vitro la formation MEJ, polarisation des cellules endothéliales et la dissection de la signalisation des protéines et des processus dans la paroi vasculaire de la résistance artères. Le coup a une multitude d’applications et peut être adaptée aux différents types de cellules. Le modèle se compose de deux types de cellules cultivées sur des côtés opposés d’un filtre avec 0,4 µm pores dans lesquels l' in vitro MEJs peuvent former. Nous décrivons ici comment créer le coup via placage des cellules et l’isolement des endothélial, MEJ et fractions de muscle lisse, qui peuvent alors servir d’isolement de protéine ou de l’activité des essais. Le filtre avec des couches de cellule intacte peut être fixe, embarqué et sectionnés pour l’analyse par immunofluorescence. Ce qui est important, bon nombre des découvertes de ce modèle ont été confirmés à l’aide d’artères de résistance intact, soulignant son intérêt physiologique.
Introduction
Dans les artères de petit diamètre de résistance, une mince lame élastique interne (IEL) sépare endothélial (CE) et des cellules musculaires lisses (SMC). Les cellules peuvent du projet par le biais de trous dans cette matrice élastique et faire des connexions cytoplasmiques directes via gap junction canaux1,2. Cette structure unique est appelée la jonction myoendothéliales (MEJ). Le MEJ est un petit (environ 0,5 µm x 0,5 µm, selon le lit vasculaire), projection cellulaire composée principalement de cellules endothéliales mais peut-être provenir de muscle lisse ainsi3,4. Un certain nombre de chercheurs ont démontré l’immense complexité de la signalisation des réseaux qui se produisent de manière sélective au MEJ, rendant l’endroit particulièrement important pour faciliter bidirectionnel de signalisation entre l’endothélium et muscle lisse5 ,6,7,8,9,10.
Cependant, une dissection mécaniste des voies de signalisation au MEJ est difficile dans une artère intacte. Le MEJ étant une projection cellulaire, il n’est pas actuellement possible d’isoler un en vivo MEJ de la paroi vasculaire. Pour cette raison, le coup modèle1 a été développé. Ce qui est important, le coup réplique physiologiques morphologie endothéliale11 et polarisation de signalisation entre l’apicale et MEJ certaines parties de la cellule12. C’est ce modèle unique qui a facilité la découverte que l’hémoglobine alpha est dans la cellule endothéliale, polarisé pour le MEJ. Cette méthode diffère des cellules endothéliales traditionnellement cultivées qui n’expriment pas d’hémoglobine alpha13. Pour les chercheurs intéressés par l’endothélium microvasculaire, il peut être plus approprié d’utiliser des cellules endothéliales qui ont été cultivées dans le coup, surtout si l’intention est de disséquer les voies de signalisation qui se produisent dans les artères de résistance de petit diamètre.
À l’aide d’un insert en plastique robuste contenant un filtre avec des pores de petit diamètre (0,4 µm de diamètre) de types cellulaires distincts de co-culture deux empêche les cellules de migration entre les couches. Elle se traduit par une distance de 10 µm entre les cellules, qui est beaucoup plus longues que in vivo, mais toujours reproduit beaucoup de caractéristiques en vivo du MEJs, y compris la localisation des protéines et second messager signalisation1 , 14. en outre, le coup permet de cibler des cellules spécifiques au type de signalisation via l’addition d’un agoniste ou antagoniste au compartiment cellulaire spécifique. Par exemple, chargement de la Communauté européenne avec BAPTA-AM pour chélater le calcium et stimulant la SMC avec la phényléphrine,14. Contrairement à d’autres descriptions de co-culture modèles15,16,17,18,19,20,21, cela donne instructions pour isoler les fractions distinctes d’ARNm et de protéines, y compris la fraction MEJ distincte dans les pores du filtre. L’ajout de cette technique pour le coup permet une enquête spécifique des changements dans la localisation de l’ARNm ou transcription22, phosphorylation de protéines12,23et protéine activité12. Cet article va décrire plaquage d’EC sur le dessus du filtre et le SMC sur le fond, bien qu’il soit possible à la culture des deux types de cellules différentes conformations11,18,24.
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Protocol
1. cellules de placage pour le coup
- Culture grand 225 cm 2 fioles jaugées de EC et SMC dans des conditions stériles à 37 ° C, jusqu’au confluent de 70 à 90 %. Veiller à ce que ce plus que SMC sont utilisés ; Si vous utilisez ce humain primaire et la SMC, généralement 3 flacons grands d’EC à 1 grande fiole de SMC.
- Utiliser de cellules primaires à passages inférieurs et ne pas utiliser après passage 10. Choisir les milieux de culture basé sur des cellules d’être conjointement mis en culture. Pour l’artère coronaire humaine primaire ce, utiliser EBM-2 ce média basale avec facteurs de croissance EGM2 MV. Pour primaire humain SMC coronaire, utiliser SmBM SMC média basale avec SmGM-2 facteurs de croissance. Avant son utilisation avec des cellules cultivées, ajouter des facteurs de croissance aux médias.
- Construction du coup jour 1 : pulvérisez Pétri de grande taille (150 mm) et couvercles avec un désinfectant (par exemple, Cavicide) et essuyer avec une serviette en papier ou des chiffons non pelucheux. Puis pulvériser les boîtes de Pétri avec 70 % d’éthanol (EtOH) et placez-les dans la hotte à l’air sec.
- Ouvrir la plaque d’inserts de filtre (voir la Table des matières) dans des conditions stériles et enduisez le SMC (côté bas du filtre) de l’insert avec la solution de la fibronectine. Maintenant l’insert dans la plaque de 6 puits fournie, pipette de la solution de la fibronectine dans le côté fentes vers le bas de la plaque, en vous assurant que le fond la moitié du filtre est couvert (pas plus de 1 mL).
- Après 30 min de traitement avec la fibronectine solution à température ambiante dans la hotte de la culture cellulaire, prendre des insertions hors de la plaque, vide tout excédent de solution et inverti, placer dans le fond la moitié de la propre boîte de Pétri. Mettre de côté. Veillez à ne pas déranger le filtre insert membrane quand aspirer l’excédent de solution ; Cela peut être évité en doucement inclinant la plaque et aspirer la solution au bord de l’insert.
- Trypsinize un 225 cm 2 flacon de SMC avec 3 mL de préchauffé 2 X la trypsine-EDTA solution, et une fois que les cellules ont décollé de la plaque, ajouter 9 mL de milieu de SMC pour neutraliser la trypsine (3:1, multimédia : la trypsine). Transvaser dans un tube à fond conique, bien mélanger et ajouter 10 µL sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.
- Compter le nombre de cellules dans le 5 x 5 cases (c.-à-d., 18), multiplier ce chiffre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules dans 1 mL (180 000). Puis multipliez par 12 mL (volume total de suspension cellulaire, SMC 2,16 millions). Veiller à ce qu’il y a assez SMC pour le nombre désiré de puits de la plaque.
NOTE : par exemple, 1 devrait bien avoir SMC 75 000 et 18 puits auraient donc SMC total 1,35 millions. Diviser des cellules 1,35 millions nécessaires par 180 000 cellules / mL 1 et cela se traduit par 7,5 mL de la suspension cellulaire qu’il faudra pour l’électrodéposition. Calculez le volume final nécessaire (18 puits x 750 µL = 13,5 mL). Ainsi, prendre 7,5 mL de suspension cellulaire, porter le volume à 13,5 mL avec préchauffé SMC media et bien mélanger.
- Compter le nombre de cellules dans le 5 x 5 cases (c.-à-d., 18), multiplier ce chiffre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules dans 1 mL (180 000). Puis multipliez par 12 mL (volume total de suspension cellulaire, SMC 2,16 millions). Veiller à ce qu’il y a assez SMC pour le nombre désiré de puits de la plaque.
- Plaque 750 µL de la suspension cellulaire contenant environ 75 000 SMC sur le côté inférieur de chaque filtre, en veillant à ne pas répandre de la solution de médias et de la cellule. Placez le couvercle sur le dessus et transvaser avec soin la boîte de Pétri avec les inserts dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
Remarque : La densité cellulaire optimal pour les autres types de cellules devra être déterminée empiriquement. - Au jour 2, remplir propre paraboloïdes 6 avec 2 mL de médias SMC fraîches, préchauffés. Enlever les plaques de l’incubateur. Prendre les inserts sur un à la fois retirer la source par aspiration, puis placer dans le plat de 6 puits avec média SMC.
- Manteau du côté opposé du filtre (côté EC) avec 1 mL d’une solution de gélatine bovine de 0,5 % pendant au moins 30 min à 37 ° C.
- Trypsinize la Deutsch 2 de 225 cm de EC avec 3 mL de préchauffé 2 X la trypsine-EDTA (10 x dilué dans Dulbecco stérile ' s PBS) solution, avec taraudage douce du ballon afin de soulever les cellules de la plaque de.
Remarque : Il peut être nécessaire de placer le ballon dans l’incubateur à 37 ° C pendant 1 à 3 min.- Une fois les cellules ont décollé de la plaque, ajouter des éléments multimédias EC 9 mL pour neutraliser la trypsine (3:1). Transférer dans un tube conique, piscine ensemble, bien mélanger et ajouter 10 µL sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.
- Compter le nombre de cellules dans le 5 x 5 cases (c.-à-d., 60), multiplier ce chiffre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules dans 1 mL (600 000). Puis multipliez par 12 mL (volume total de suspension cellulaire, EC 7,2 millions). Veiller à ce qu’il y a assez EC pour le nombre désiré de puits de la plaque.
NOTE : Environ 360 000 ce sont tenus par puits. Par exemple, 18 puits nécessitent 6,48 millions EC. Diviser des cellules 6,48 millions nécessaires par EC 600 000 par 1 mL et cela se traduit par 10,8 mL de la suspension cellulaire qu’il faudra pour l’électrodéposition. Calculez le volume final nécessaire (18 puits x 1 mL = 18 mL). Ainsi, prendre 10,8 mL de suspension cellulaire, porter le volume à 18 mL avec préchauffée médias EC et doucement resuspendre.
- Compter le nombre de cellules dans le 5 x 5 cases (c.-à-d., 60), multiplier ce chiffre par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules dans 1 mL (600 000). Puis multipliez par 12 mL (volume total de suspension cellulaire, EC 7,2 millions). Veiller à ce qu’il y a assez EC pour le nombre désiré de puits de la plaque.
- Une fois les cellules ont décollé de la plaque, ajouter des éléments multimédias EC 9 mL pour neutraliser la trypsine (3:1). Transférer dans un tube conique, piscine ensemble, bien mélanger et ajouter 10 µL sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre de cellules.
- Plaque de 1 mL de 360 000 EC sur le dessus de chaque filtre d’insertion. Laisser les cellules incuber sans agitation à 37 ° C pour les moyennes de remplacer 24 h. sur 4 jours. Récolte le jour 5.
2. Récolte des Fractions de la coup
- effectuer l’isolement dans une pièce de 4 ° C et maintenir tous les instruments sur la glace.
- N’oubliez pas le nombre d’insertions individuels étant isolé et ajouter le tampon de lyse dans un tube de 50 mL étiqueté MEJ (pour les filtres isolés). Puis identifiez les deux boîtes de 10 mm ; un pour ce et un pour SMC.
- Régler le volume de tampon de lyse selon comment concentré le lysat doit être ; 15 s’insère, 500 µL de tampon de lyse pour le tube MEJ et 250 µL par boîte de Pétri sont recommandés.
- Travail avec une plaque 6 puits de plaquettes à la fois. D’aspiration hors du milieu dans le capot de la culture de cellules, puis transport vers une chambre froide sur glace.
Remarque : Les informations suivantes sont destinées 1 Insérez isolement. - Pipette 10 µL de PBS 1 x sur le côté SMC de l’insert.
- Utilisez le panier de la cellule à racler les cellules à une extrémité de l’insert et de transférer les cellules de l’haltérophile à la SMC Pétri qui a tampon de lyse dans it.
- Une fois que le releveur de cellule a touché le tampon de lyse dans le plat, ne lui permettent pas de toucher le filtre insertion jusqu'à ce qu’il a été complètement nettoyé et séché sur du papier absorbant. Répéter le raclage du filtre SMC au moins une à deux fois pour éliminer complètement les débris restants de cellule SMC.
- Tourner l’insert au-dessus et ajouter 10 µL de PBS 1 x dans le côté supérieur/EC du filtre insert. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 avec un grattoir de cellules et la boîte de Pétri ce.
- Recueillir les cellules restantes et le lisier de PBS du côté EC du filtre avec une pipette et transfert à l’EC Pétri avec du tampon de lyse. Être très complet en grattant les cellules sur les deux côtés du filtre à laisser une contamination EC/SMC minimale dans la fraction MEJ.
- Utilisez soigneusement le scalpel pour découper le filtre de l’insert en plastique. Pour ce faire coupe 70-80 % de celui-ci loin de la matière plastique et utiliser des pinces pour tirer le filtre complètement hors de la structure de l’insert en plastique. Mettre le filtre dans le tube à fond conique 50 mL étiqueté MEJ avec tampon de lyse et s’assurer qu’il se trouve dans le tampon de lyse et qu’il reste humide.
- Répéter les étapes de l’isolement, en groupes de 6, jusqu'à ce que toutes les insertions ont été traitées.
- Veiller à ce que différents groupes sont conservés dans des tubes distincts et plats.
- Vortex le tube conique de 50 mL MEJ sur pleine puissance pendant 15 s ou jusqu'à ce que bien mélangés. Retirer les filtres le MEJ conique avec une pince, en les faisant glisser le long des murs latéraux du tube pour laisser le maximum de protéines et de liquide dans le tube. Après ce point, jetez les filtres.
- Après ont enlevé tous les filtres du tube conique à MEJ, faire un essorage rapide (10-15 s à vitesse max ~ 16 000 x g) dans une centrifugeuse pour retirer tous les liquides et les protéines vers le bas du tube. Transvaser le contenu du tube MEJ et les plats de ce et SMC Petri dans des tubes à centrifuger distinct, plus petite.
- En option : laisser agir le contenu des tubes MEJ/SMC/EC en définissant 4 impulsions trois 10 s sur la glace ou homogénéiser doucement à la main.
- Centrifuger à vitesse maximum (~ 16 000 x g) 15 min à 4 ° C. Pipet sortir le surnageant et doser le lysat pour la teneur en protéines à l’aide de la méthode de dosage bicinchoninic.
3. Le coup de la récolte pour l’Immunofluorescence En Face
- incubation sur jour 5 du coup, sortir les insertions de l’incubateur. Travaillant dans la hotte de la culture cellulaire, suceuses hors médias SMC de chaque puits inférieurs du filtre de l’insert et rincer deux fois avec du PBS 1 x. Répéter avec le côté EC.
- Garder les inserts intact et dans l’assiette, ajouter 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pour 10-20 min dans une pièce de walk-in 4 ° C dans un agitateur doux. Lavez les deux côtés du filtre avec du PBS 1 x insert pour 5 min et répétez deux fois.
ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin. - Effectuer les incubations d’anticorps bloquants, primaire et secondaire dans le plat, en veillant à ce que les deux côtés du filtre sont conservés dans l’anticorps + solution de blocage (9 mL de PBS, 25 µL Triton X100, albumine de sérum bovin 50 mg, 500 µL de sérum normal)
- Pour monter le filtre sur une lame, coupée le filtre de l’insert en plastique avec un scalpel, monté sur une poignée et le déposer sur une lame de microscope avec milieu de montage.
4. Le coup de la récolte pour l’Immunofluorescence transversal
- incubation sur jour 5 du coup, sortir les insertions de l’incubateur. Suceuse hors des médias des deux côtés du filtre à insérer dans la hotte de culture cellulaire et rincer chaque côté du filtre deux fois avec du PBS 1 x.
- Garder les inserts intact et dans la plaque 6 puits, ajoutez 4 % PFA et incuber pendant la nuit dans une chambre de walk-in 4 ° C dans un agitateur doux.
ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
5. Incorporation du coup pour l’Immunofluorescence transversal
- après filtre insertions ont été corrigées environ pendant 24 h en 4 % PFA, transfert à 70 % EtOH pendant au moins 24 h, mais jusqu'à plusieurs semaines.
- Traiter les filtres sur un long terme (la nuit) sur un processeur de tissus automatisés. Utiliser le programme comme suit : 70 % 30 min de paraffine EtOH pour 30 min, 85 % EtOH 30 min, 95 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 30 min, 100 % EtOH 45 min, 100 % EtOH 45 min, xylène 30 min, xylène 30 min, xylène 45 min, 60 ° C, 60 ° C 30 min de paraffine , 45 min. de paraffine 60 ° C
- Après le traitement, transférer les filtres récoltés à la station encastrement dans la paraffine liquide, garder le filtre dans la cassette.
- Supprimer le filtre de la cassette, soigneusement à l’aide de pinces pour tenir juste au bord. Avec des ciseaux, coupez le filtre en deux, formant deux demi-cercle en forme de moitiés. Poser chaque des 2 moitiés sur la partie-plaque froide de la station encastrement juste longtemps assez pour remplir le plongement de moule avec de la paraffine liquide.
- Une fois rempli avec de la paraffine liquide, touchez le moule incorporation à la plaque froide très brièvement, puis incorporer chaque moitié du filtre en enrobage moule (côté coupé vers le bas), ce qui assure que pendant la découpe, on va couper depuis le centre du filtre vers le bord .
- Au cours de l’incorporation, utiliser les pinces pour maintenir le filtre en place pour empêcher les moitiés de tomber dans l’autre jusqu'à ce que la paraffine est assez cool pour eux se tenir seul. Passer le moule incorporation à une plaque froide jusqu'à ce que complètement solidifié.
NOTE : Blocs sur des plateaux de glace de refroidissement contribue à prévenir les sections ridées.
6. Coupes et coloration du coup pour l’Immunofluorescence transversal
- pour les blocs de paraffine sectionnement et faites glisser le montage : 5 µm coupes, placer les sections dans un bain d’eau de 42 ° C et ramasser les sections à l’aide de chargés positivement diapositives. Puis garder diapositives durant la nuit dans un four à sécher à 42 ° C.
- Avant de commencer les étapes de la réhydratation, faire cuire les diapositives à 60 ° C pour faire fondre de la paraffine et aider à respecter les sections de coup à la diapositive. Cool brièvement, puis se réhydrater les diapositives grâce à deux changements de xylène, 100 % EtOH, 95 % EtOH, un changement dans les 70 % EtOH et deux changements d’eau distillée.
- Éviter les méthodes de récupération de l’antigène qui impliquent de micro-ondes ou de chauffage que les sections peuvent tomber hors de la diapositive.
- Effectuer le blocage standard pendant 1 h à température ambiante, puis la nuit d’incubation avec l’anticorps primaire à 4 ° C, suivie d’un lavage des étapes et des anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Monter avec les supports de montage et de la lamelle couvre-objet.
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Representative Results
Les inserts de filtre utilisés pour le coup ont petit, 0,4 µm trous. Figure 1 a, une vue de face de fr de l’encart filtre de coup, montre les pores dans lesquels le MEJ peut se former en vitro. Le schéma représente les cellules musculaires lisses plaqués sur le côté inférieur du filtre, un jour avant que les cellules endothéliales sont plaqués sur le côté opposé (Figure 1 b). Une fois que les cellules sont plaqués, les fractions de ce, MEJ et SMC peuvent être isolés trois jours plus tard. Un exemple de ceci est montré dans la Figure 2 a, où 1 (PAI-1), inhibiteur de l’activateur du plasminogène est fortement exprimée dans la fraction MEJ par rapport au reste de la Communauté européenne, qui voit aussi à in vivo MEJs25. Ces données démontrent l’utilité de la coup en récapitulant la paroi vasculaire artériolaire intact.
Ensuite le coup en immunofluorescence et microscopie électronique est démontrée. Le coup est laissé intact et fixe avec PFA pour l’immunofluorescence transversal. Figure 3 a montre le muscle lisse spécifiques alpha-1 adrénergique et le récepteur de la bradykinine spécifiques endothéliale. Phalloïdine coloration d’actine-F montre les ponts d’actine dans le MEJ (flèche blanche) entre les deux cellules, qui reproduit l’expression dans une artère intact26. Dans la Figure 3 b, un échantillon représentatif de la coup telle que vue par microscopie électronique en transmission est démontré, rendu en 3D dans la Figure 3. Ces points de vue de la coup démontrent sa capacité à localiser spécifiquement les protéines, récepteurs et l’ultrastructure de in vitro MEJs.
Figure 1 : placage de la co-culture de cellules vasculaires (coup). (A) En face la lumière Micrographie des pores du filtre d’insertion. Les flèches noires indiquent les trous individuels. (B) Représentation schématique du placage du coup. Jour 1 montre inversion de la cartouche filtrante et placage SMC sur le fond. Le jour 2, la Communauté européenne sont plaqués sur le côté opposé du filtre et du coup reste dans cette conformation dans une plaque 6 puits jusqu'à la récolte. Flèches blanches indiquent le côté du filtre où les cellules sont plaqués et seront développera. Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : enrichissement en protéines dans le MEJ. (A) image de microscopie Immuno-transmission d’artère de souris avec l’expression de la globine alpha à la MEJ (or perles qui apparaissent comme des points noirs). (B) la tache occidentale montrant 1 (PAI-1), inhibiteur de l’activateur du plasminogène expression est enrichie dans la fraction MEJ versus les fractions de ce ou de la SMC. CE plastique indique EC cultivé sur un plat en plastique, qui ne font pas de MEJ. Echelle = 1 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : immunofluorescence transversal et microscopie électronique dans les sections transversales de la coup. Coloration (A) pour le muscle lisse et des protéines spécifiques endothéliales. Actine F souillure est dans l’ensemble les deux types de cellules et le in vitro MEJ (flèche blanche). Un exemple de la microscopie électronique utilisé pour étudier l’ultrastructure du in vitro MEJs à la fois en 2D (B) et 3D (C). Echelle = 10 µm (A) ; 2,5 µm (B) ; et environ 2,5 µm verticale et horizontale de 0,5 µm (C). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le coup a un certain nombre d’avantages en termes de récapitulant MEJs in vitro, mais il existe des points de discussion pour déterminer si le coup peut être utilisé pour des applications spécifiques. Par exemple, si les différents types de cellules doivent être utilisées avec ce modèle, il devra être optimisé. Nous avons utilisé des cellules humaines primaires, mais il est possible d’isoler des cellules d’aortes bovine24ou souris de type sauvage ou coup de grâce et utilisez-les dans le coup1,5,14.
Si vous utilisez le coup pour l’isolement du MEJ, la technique plus importante à maîtriser est approfondie de raclage du filtre pour s’assurer que la pureté de la fraction MEJ n’est pas altérée par les cellules endothéliales ou muscle lisse excédentaires. Nous avons montré par Éponger occidental que l’hémoglobine alpha est le meilleur marqueur d’un « pur » MEJ isolement13, tel qu’il devrait être fortement exprimé dans la fraction MEJ par rapport à la fraction de cellules endothéliales. Un autre est PAI-1, qui régit la formation de MEJ (Figure 2)25. Nous estimons que ceux-ci peuvent être particulièrement bons marqueurs pour un isolement de MEJ robuste. Pour confiance supplémentaire dans la technique de récolte, les filtres peuvent être conservés après grattage pour la récolte et colorées pour EC/SMC marqueurs25.
Expression de la protéine dans le coup d’imagerie peut être effectuée de deux façons : visage fr (Figure 1 a) ou transversal (Figure 3). Les deux préparations permettent la visualisation de protéines dans les trous du filtre sous deux angles différents. La technique de visage fr implique les artères qui fend longitudinalement et puis épinglées à plat, avec la Communauté européenne vers le haut, de visualiser la monocouche EC tant les trous de la Lei, le seul endroit où MEJ peut se former. Un signal fluorescent dans les trous de la Lei indique la localisation de la protéine dans le MEJ10,27. Ce même principe peut se traduire pour le coup par imagerie de la monocouche EC d’en haut, sans avoir besoin de les incorporer dans la paraffine ou de faire des sections. La méthode transversale est plus complexe à maîtriser mais il est essentiel pour la visualisation distincte des protéines dans la Communauté contre les monocouches SMC (Figure 3).
L’absence de flux ou d’étirement du système est une limitation potentielle, mais il est possible d’ajouter le flux dans un muscle lisse-endothelial cell co-culture16,19. Il semble que les conditions statiques permettent encore expression protéique physiologiquement précis et l’activation, donc il est possible que le contact hétérocellulaires soit le facteur le plus important dans la dissection du MEJ, voies de signalisation.
Il existe plusieurs applications de cette technique au-delà de résistance artère signalisation que le coup n’est pas nécessairement limitée aux types spécifiques de cellules. Autres modèles de co-culture ont utilisé l’excroissance des cellules endothéliales et les ostéoblastes17, ou modélisé la barrière hémato-encéphalique avec endothéliale et pericyte/astrocyte cultures co21. Métastase des cellules tumorales par l’endothélium peut également être quantifiée à l’aide de ce modèle21. Il est également possible de cultiver des cellules sur le filtre et de la culture une autre cellule, tapez dans le fond du plat 6 puits afin de tester la signalisation paracrine, ou la croissance des cellules endothéliales sur la partie supérieure de la membrane se pencher sur la polarisation de la cellule (nos observations non publiées). Leucocytes ou autres cellules circulantes peuvent être ajoutés aux médias EC et l’adhérence des cellules peut être quantifiée12. En outre, le coup peut être utilisé pour enquêter sur des pathologies telles que le muscle lisse migration24 et prolifération en réponse à des lésions endothéliales15,18.
En conclusion, nous avons présenté une méthode pour isoler le MEJ d’un in vitro système de culture cellulaire, qui permet l’étude des processus entre les deux types de cellules couplées de signalisation. Ce qui est important, le système de co-culture n’est pas limité à l’étude de la MEJ et peut être utile pour répondre à un certain nombre de questions, en particulier celles impliquant la communication hétérocellulaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Heart, Lung and Blood Institute accorde 14PRE20420024 bourse prédoctorale R01088554, T32HL007284 et American Heart Association. Nous remercions particulièrement le St. Jude Cellular Imaging partagé recherche Core, y compris Randall Wakefield et Linda Horner pour les images de microscopie électronique, Adam Straub d’assistance avec des images représentatives par immunofluorescence et Pooneh Bagher pour elle précieux commentaires sur le protocole de manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
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