Summary
We tonen een methode aan om meerdere molecuelen te identificeren binnen heterogene nano-structuren bij nauwkeurige molecuul nauwkeurigheid, met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescent gelabelde antilichamen.
Abstract
Imaging heterogene cellulaire structuren met behulp van single molecule lokalisatie microscopie is gehinderd door onvoldoende lokalisatie precisie en multiplexing vermogen. Met behulp van fluorescerende nano-diamant fiduciale markers beschrijven we de drijfcorrectie- en uitlijningsprocedures die nodig zijn om hoge precisie te verkrijgen in single-molecule lokalisatiemicroscopie. Daarnaast wordt een nieuwe multiplexingstrategie, madSTORM, beschreven waarin meerdere molecules in dezelfde cel worden geteeld met behulp van sequentiële binding en elutie van fluorescerende antilichamen. MadSTORM wordt aangetoond op een geactiveerde T-cel om de locaties van verschillende componenten te visualiseren in een membraan gebonden, multi-eiwitstructuur genaamd de T-celreceptor microcluster. Daarnaast wordt de toepassing van madSTORM als een algemeen hulpmiddel voor het visualiseren van multi-eiwitstructuren besproken.
Introduction
Een verscheidenheid aan superresolutie microscopie technieken zijn ontwikkeld om de diffractie grens van lichtmicroscopie (~ 200 nm) te overwinnen. Onder deze is een categorie technieken genaamd single molecule localization microscopy (SMLM), waaronder foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) en stochastische optische reconstructie microscopie (STORM). SMLM technieken delen in het gebruik van fluorophoren die kunnen worden omgeschakeld tussen aan (fluorescerende) en off (donker / foto-geschakeld) staten, waardoor sequentiële lokalisatie van fluorescentie uit enkele moleculen 1 , 2 , 3 .
Door zijn compatibiliteit met commercieel verkrijgbare kleurstoffen en microscopen is direct STORM (dSTORM) uitgegroeid tot een algemeen aanvaarde SMLM techniek 4 . DSTORM kan routinematig ~ 10 nm lokalisatie precisie bereiken, gedefinieerd als de onzekerheid bij het berekenen van het middelpunt van een diffractieIon-beperkte puntverdeling functie (PSF). Ondanks de hoge nauwkeurigheid die is geschat met behulp van lokalisatiealgoritmen 5 , 6 , 7 , is de nauwkeurige bepaling van de werkelijke locatie van enkele moleculen gehinderd door een aantal problemen. Ten eerste, mechanische beweging van de microscoopfase tijdens beeldverwerving voegt aanzienlijke onzekerheid toe aan de nauwkeurigheid van lokalisatie. Aangezien SMLM beelden worden verkregen over duizenden time-lapse frames, kunnen nano-schaalbewegingen van de microscoopfase de precisie van de uiteindelijke superresolutiebeeld 8 aanzienlijk in gevaar brengen. Voor het compenseren van de stadiumbeweging tijdens de beeldverzameling wordt de stadiumdrift algemeen geraamd uit regressiegebaseerde montage van binnenste lokalisaties van de afbeelding zelf (kruiscorrelatie) of sequentiële lokalisaties van fiduciale markeringen (fiduciale correctie) 1 , 9 . HowevEr zijn deze methoden nodig voor het optimaliseren van meerdere parameters voor elke beeldstapel en kunnen niet rekening houden met stadiumbewegingen op korte tijdschalen zoals mechanische trillingen. Gouden nanodeeltjes en multicolor fluorescerende kralen zijn gebruikt als fiduciale markers in SMLM, maar ze zijn niet fotostabiel en resulteren in een aanzienlijk lagere precisie na drijfcorrectie dan de stikstofcentrale fluorescerende nano-diamanten (FND's) gebruikt In madSTORM 10 .
Naast de diffractiegrens wordt de lichtmicroscopie verder beperkt door spectrale grenzen. Gelijktijdige visualisatie van meerdere doelen vereist fluorescerende probes met niet-overlappende spectrale profielen, waarbij de fluorescentie gebaseerde lichtmicroscopie in het algemeen beperkt wordt tot 6 kleuren en SMLM tot 2-3 kleuren 4 , 11 , 12 . Bovendien veroorzaakt niet-lineaire chromatische aberratie verkeerde aanpassing van veelkleurige beelden, wHiervoor zijn uitgebreide uitlijningsprocedures nodig met behulp van multi-colored fiducial markers 8 , 13 . Om deze grenzen te overwinnen hebben eerdere studies meerdere doelen getoond door gebruik te maken van herhalende photobleaching of chemische quenching van achtereenvolgens gebonden fluorophoren 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Hoewel deze methoden de spectrale grenzen van microscopie kunnen overwinnen, is fluorescentiebleken bekend dat het een toxisch proces 20 is , en langdurig bleken of blussen kunnen ongewenste neveneffecten veroorzaken, zoals verlies van verknoping. Bovendien kan de accumulatie van fluorescerende probes leiden tot sterische blokkering van bindingsplaatsen in het monster, het voorkomen van grootschalige multiplexing en robuuste targeting van epitopen. Om dergelijke sterische interferentie te vermijden, is een recente sTudy bereikt multiplexing met behulp van stochastische uitwisseling van vrij diffuus eiwitfragmenten 21 . Terwijl deze methode een dichte etikettering van cellulaire structuren mogelijk maakt, vereist het uitgebreide biochemische bereiding om peptidefragmenten te isoleren, geen enkele molecuulposities kan isoleren en niet gemakkelijk grootschalige multiplexing vergemakkelijken met gebruik van commercieel verkrijgbare probes. We presenteren een gedetailleerd videoprotocol dat de sequentiële binding en elutie van fluorescente antilichamen voor multiplexed, antilichaamgrootte beperkte dSTORM (madSTORM) imaging, en het gebruik van fluorescerende nano-diamanten om nauwkeurige drijfcorrectie en uitlijning te bereiken, beschrijft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voorzichtigheid: Raadpleeg al de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Verscheidene van de in dit protocol gebruikte chemicaliën zijn giftig en kankerverwekkend. Gebruik alstublieft alle passende veiligheidspraktijken bij het uitvoeren van het protocol, inclusief het gebruik van technische controles (dampkoker, handschoenkoffer) en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten schoenen).
1. Multiplexed Imaging of Activated T Cells
- Direct geconjugeerde antilichamen met Alexa-647 (A647) kleurstof met behulp van de Alexa 647 antilichamen etikettering kit. Volg het etiketteringsprotocol van de fabrikant.
OPMERKING: Dialyse van antilichaamoplossing in 1x PBS wordt aanbevolen voor deze stap om de efficiëntie van antilichamen te vergroten. - Spin gelabelde antilichamen gedurende 5 minuten bij 20.800 rcf en verzamelen supernatant om geaggregeerde antilichamen te verwijderen.
- Voorbereiding van fluorescerende nano-diamant bedekte deklagen
- Bereid een verdunning van 100 nm FNDs in 1x PBS. Test diverse verdunningen om te verzekeren dat er genoeg FND's zijn, elk zichtveld in stap 1.2.7 (we gebruiken een 1: 200 verdunning van FND's die door de fabrikant zijn verstrekt).
- Vortex de verdunde FND's gedurende 1 minuut.
- Soniceer de FND supernatant gedurende 30 s bij een krachtige instelling.
- Incubeer het sonicated FND supernatant in een PLL-gecoate 8-putjes deklaagkamer gedurende 30 minuten bij kamertemp.
- Was 5x met 1x PBS en visualiseer de FND-gecoate kamer met behulp van 647 nm laser excitatie op de TIRF microscoop. Ideaal gezien zouden 4-10 individuele FND's zichtbaar moeten zijn in een gezichtsveld gezien de juiste verdunning van FND's in stap 1.2.2 (we gebruiken een 100X objectief met 256 x 256 camera pixel instelling om 61 x 61 μm zichtveld op te leveren) Met atMinstens één FND aanwezig in elk kwadrant van het beeldgebied. Als de FND's clusters lijken te zijn ( dwz FND's met een significant hoger signaal dan omgevende FND's en een puntverspreidingsfunctie groter dan 200 nm), centrifugeren FND's bij 6,800 rcf gedurende 1 min en herhaal de bekledingsprocedure met behulp van de FND supernatant.
- Voeg 250 μl anti-CD3-antilichaam (10 μg / ml) in elke put toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C of overnacht bij 4 ° C.
- Verwijder de oplossing en voeg 1x PBS gedurende 30 seconden toe. Herhaal deze wasstap 5 keer (was 5x).
- Spin 1 ml Jurkat T-cellen bij 800 rcf gedurende 6 min en resuspendeer in 300 μl 1x HBS-oplossing. Jurkat T-cellen dienen ideaal te zijn bij een concentratie van 0,5-1,0 x 10 6 cellen / ml alvorens te spinnen. 1x HBS-oplossing bestaat uit HEPES-bufferzout met 1% boviene serumalbumine zoals eerder beschreven 22 .
- Voeg 150 μL toeVan 1x HBS oplossing in elke put en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg 50 μL geresuspendeerde Jurkat T-cellen aan elke put en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 300 μl 4% paraformaldehyde toe aan elke put en incubeer gedurende 30 min bij 37 ° C.
- Was 3x met 1x PBS.
- Permeabiliseer cellen door 250 μl 0,1% Triton-X oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen.
- Was 3x met 1x PBS.
- Voeg 250 μL 1% visgelatineoplossing in 1x PBS toe aan elke putje gedurende 30 minuten bij kamertemp.
- Was 3x met 1x PBS.
- Voeg 200 μl gemerkt antilichaam bij 0,1-0,5 μg / ml aan vaste cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was 5x met 1x PBS.
- Voeg 1 ml STORM buffer toe en bedek de kamer met een glazen deklaag om de blootstelling aan de lucht te beperken. De STORM buffer is eerder beschreven 10 . Wij raden ma aanKoning nieuwe STORM buffer voor elke ronde beeldvorming en draai de STORM buffer bij 20.800 rcf gedurende 2 minuten om precipitaten te verwijderen.
- Gebruik een laag 647 nm laservermogen in de TIRF-modus, zoek een gekleurde cel met ten minste 3 FND's in het zichtveld. Om te helpen bij het lokaliseren van FND's kan gelijktijdige excitatie met 568 nm laser gebruikt worden om de helderheid van het FND-signaal te verhogen.
OPMERKING: De prestatie van de gemiddelde fiduciale correctie beschreven in paragraaf 2.1 verbetert met het opnemen van meer FND's. - Verhoog 647 nm laservermogen en bekom beelden. We verwerven typisch 10.000 beelden bij 200 ms belichting, 125 mW 647 nm laser, 100X TIRF objectieflens (1,49 NA), 100X EM gain (5 MHz bij 16 bit, conversiewinst 1). Details van onze imaging setup zijn eerder beschreven 10 .
- Was 5x met 1x TBS.
- Voeg 1 ml o toeF-elueringsbuffer (3,5 M MgCl2, 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut.
- Herhaal elutie 3 keer. (Exacte elutieomstandigheden en het aantal elutiespoelingen die nodig zijn om het signaal te verwijderen moeten worden gecontroleerd op elk gebruikte antilichaam).
- Was 3x met 1x TBS en voeg 1 ml 1x PBS toe.
- Photobleach met 647 nm laser bij hoge vermogen (125 mW) met 405 nm laser bij 2-5 mW om foto's te activeren A647 kleurstoffen in donkere toestand. Wacht tot alle resterende signalen van niet-geëlueerde antilichamen gefotografeerd zijn. Dit duurt meestal 2-5 s van laserblootstelling. Het verkrijgen van voorbeeldbeelden (~ 100 frames) met behulp van de STORM instellingen in 1.3.5 na het elueren en fotolakken wordt aanbevolen om het verwijderen van het signaal te bevestigen.
We gebruiken typisch 99,8% signaal door deze methode te gebruiken. We raden aan om de elutie-efficiëntie van elk antilichaam te testen voor gebruik in madSTORM zoals eerder getoond 10 . - Voeg 250 μl 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten toe. Dit prGebeurtenissen omgekeerde verknoping van vaste moleculen in de cel.
- Was 3x met 1x PBS.
- Herhaal stappen 1.3.1-1.3.12 voor opeenvolgende etikettering van meerdere doelen. Figuur 1 toont een samengesteld beeld van meerdere moleculen in een geactiveerde Jurkat T-cel die is verkregen met behulp van madSTORM.
2. Drift Correctie en Uitlijning van Multiplexed Image Stacks
- Driftcorrectie van madSTORM beeldstapels
- Open afbeeldingen met behulp van ImageJ. We raden aan om de afbeeldingsbestanden om te zetten in een TIFF-formaat voordat u ImageJ opent. Gebruik rechthoek ROI om een enkele FND te selecteren. Speel de tijdsverloop om ervoor te zorgen dat de FND zichtbaar is in elk frame van de beeldstapel. Gebruik Run Analyse in de ThunderSTORM plugin om de FND te lokaliseren. Voor de gemiddelde correctiefactor methode beschreven in 2.1.5 is het belangrijk dat een enkele FND gelokaliseerd is in elk beeldframe (dat wil zeggen dat het aantal geïdentificeerde pieken e moet zijnKwalificeren naar het aantal frames).
- Als de FND niet in elk frame is geïdentificeerd, selecteer een andere FND. Als meerdere pieken zich in een enkel frame bevinden, verwijder dan de piek die het meest afwijkt van de vorige pieken.
- Herhaal 2.1.2 voor elke FND in de beeldstapel. Houd er rekening mee dat sommige FND's niet in het drijfcorrectieproces moeten worden opgenomen, zodat ze kunnen dienen als een onafhankelijke meter voor drijfcorrectie precisie zoals beschreven in stap 2.1.7.
- Voor snellere, minder nauwkeurige driftcorrectie, gebruik dan de kruiscorrelatie- of fiduciale correctiealgoritmen die in ThunderSTORM zijn opgenomen om de FND-beelden te corrigeren. Gewoonlijk gebruiken we 100 bakken, 5 vergrotingen en 0,1 trajectvergrotingsfactor voor cross correlatie en 10 maximale afstand, 0,1 min markering zichtbaarheid ratio en 0,01 traject-gladingsfactor voor fiduciale correctie. Kruiskorrelatie en fiduciale correctie geven een correctiebestand op dat kan worden toegepast op andere FND's om de drijfcorrectie precisie te testen.
- Voor strengere nauwkeuriger drijfcorrectie gebruik dan het gemiddelde fiduciale correctie (AFC) algoritme zoals eerder beschreven 10 . Dit proces vereist geen optimalisatie van parameters en levert hogere lokalisatie precisie dan voorspeld door SMLM lokalisatie algoritmen. Een gemiddelde drijfcorrectie vereist echter minstens 4 FND's en dat de FND's in elk frame van de beeldstapel gelokaliseerd moeten worden. AFC-driftcorrectie presteert beter met het opnemen van meer FND's, omdat een groot aantal gelokaliseerde FND's het vervormende effect van een uitloperpiek in een bepaald kader zal verminderen.
- Plaats alle puntverdelingsfuncties in de beeldstapel met behulp van ThunderSTORM zoals eerder beschreven 10 . We gebruiken gewoonlijk pixelformaat van 100 nm, foto-elektronen per A / D-telling van 4,28, basisniveau A / D-telling van 100, EM-winst van 100, PSF: Geïntegreerde Gaussische lokalisatie, 5 pixel montageradius, maximale waarschijnlijkheidsmetode en 1,3 Pixel initiële sigma.
- Breng de drijfcorrectiefactor die van FND's is aangeleverd, aan op lokalisaties van de gehele beeldstapel. Controleer het uiteindelijke beeld visueel om de juiste drijfcorrectie te verzekeren ( Figuur 2 ). De resulterende drijfcorrectiefactor moet onafhankelijk worden getest op FND's die niet in de AFC-procedure zijn opgenomen om het niveau van drijfcorrectie precisie te meten. De precisie van drijfgerichte onafhankelijke FND's zou dicht bij de gemiddelde precisie / onzekerheidswaarde moeten zijn, berekend uit het lokalisatiealgoritme dat in stap 2.1.6 werd gebruikt.
- Herhaal stappen 2.1.1-2.1.7 voor de madSTORM-beeldstapels van achtereenvolgens gemerkte antilichamen. Houd er rekening mee dat het identificeren van dezelfde set FND's in elke madSTORM-beeldstap kritiek is voor de volgende uitlijningsprocedure.
- Uitlijning van madSTORM afbeeldingen
- Bereken de centroid positie van de Drift Corrected FNDs in elk MadSTORM beeld. Om dit te doen, vind de gemiddelde x en y-as poSitions voor elke gelokaliseerde FND, en gemiddelde de gemiddelde x en y posities van alle FND's in elke madSTORM afbeelding. Het gedetailleerde algoritme voor deze stap is eerder beschreven 10 . Richt sequentiële madSTORM afbeeldingen uit met behulp van de centroidposities van FND fiducial markers. Om de uitlijning uit te voeren, bereken de compensatie tussen twee gelokaliseerde madSTORM-beelden door de centroidpositie van FND's in het tweede madSTORM-beeld van de eerste af te trekken. Vervolgens de verrekeningsbedrag van alle locaties in de tweede madSTORM-afbeelding aftrekken.
- We raden aan om het eerste madSTORM-beeld te gebruiken als referentiebeeld en om deze uitlijningstap te herhalen tussen de eerste en de derde, de eerste en de vierde . Test de nauwkeurigheid van de uitlijning door de afweging tussen FND's die niet in het uitlijningsproces zijn opgenomen, te meten. Grote offsets kunnen aanwijzen dat verschillende sets FND's werden gebruikt bij het berekenen van de centroidposities van sequentiële madSTORM beelden.
- Zo ja, stappen 2.2.1-2.2.2 shouLd worden herhaald met dezelfde set FND's om uitlijning uit te voeren.
OPMERKING: Aangepaste codes voor zowel de AFC-drijfcorrectie als de uitlijningsprocedures worden verstrekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De sequentiële elutie- en kleurmethode werd gebruikt voor het produceren van het multiplexed madSTORM beeld van microclusters en andere structuren in een geactiveerde Jurkat T-cel ( Figuur 1 , controle-uitlijnen). Elk pseudo-gekleurd beeld vertegenwoordigt één ronde van madSTORM-beeldvorming, verkregen in stappen 1.1.1 tot 1.3.13. Zoals eerder beschreven 10 , moet het zichtveld worden gecontroleerd voor residueel signaal van eerdere, niet-geëlueerde antilichamen om kruisvorming tussen multiplexed targets te vermijden. Aangezien de elutie-efficiëntie kan variëren tussen antilichamen, moet de volgorde van sequentiële multiplexing worden geregeld van het beste naar het ergste eluerende antilichaam om sterische blokkering van epitopen te minimaliseren. De laatste madSTORM afbeelding in Figuur 1 is gecorrigeerd voor drift en uitlijning met behulp van AFC en FND fiducial markers zoals beschreven in sectie 2.
Figuur 2A , 2B ) en een geactiveerde Jurkat T-cel ( Figuur 2C , 2D ). De AFC-driftcorrectie werd uitgevoerd zoals beschreven in stappen 2.1.1-2.1.8 onder gebruikmaking van de algoritmen die zijn verstrekt. Eerst wordt de visuele inspectie van het beeld na drijfcorrectie aanbevolen ( fig. 2C ) om de correcte toepassing van het drijfkorrigeringsalgoritme te waarborgen. Ten tweede, het meten van de standaardafwijking van lokalisaties in zowel de X- als Y-as wordt aanbevolen om de nauwkeurigheid van AFC te bevestigen. Zoals eerder vermeld 10 , levert AFC doorgaans betere precisie dan verwacht door verschillende lokalisatiealgoritmen.
Figuur 1: ( A B ) Uitgebreide afbeelding van de boxed gebied in A. Schaalbalk = 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: SMLM beeld van een enkele FND gelokaliseerd in 30.000 beeldkaders ( A ) voor en ( B ) na drijfcorrectie met gemiddelde corrigerende corrigeren. Schaalstaven = 20 nm (A en B). SMLM beeld van een geactiveerde Jurkat T-cel bevlekt wiAnti-gefosforyleerde SLP76 (Y128) antilichaam en FND fiduciale markers ( C ) voor en ( D ) na driftcorrectie met gemiddelde fiduciale correctie. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sequentiële multiplexing, driftcorrectie, en uitlijningsprocedures in madSTORM maken het mogelijk om nauwkeurige, hoogmultiplexeerde visualisatie van heterogene structuren in cellen toe te staan. 10 Bovendien vermijdt madSTORM de beperkingen van multi-color STORM, zoals chromatische aberratie en suboptimale fotowisseling / emissie eigenschappen van niet-ver rode kleurstoffen 9 , 12 . Aangezien de elutiestap sterische interferentie significant vermindert uit sequentiële gebonden antilichamen, kan madSTORM worden gebruikt om herhaalde beeldvorming van celmonsters te verrichten buiten de 6-10 rondes multiplexbeeldvorming verkregen door eerdere technieken 9 , 15 , 21 . Bovendien zijn de sequentiële elutie- en kleuringstappen niet beperkt tot SMLM en kunnen ze worden gebruikt voor andere beeldvormende technieken, zoals confocale microscopie, SIM en twee-foton microscopie. Echter, gezien dat gekkeTORM is een opeenvolgende immunostaining techniek, deze techniek is beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen voor elk doelgericht molecuul. Elk antilichaam moet zorgvuldig getest worden om de specificiteit, de etiketteringsefficiëntie en het elutievermogen te waarborgen.
De acquisitie-instellingen voor madSTORM werden gekozen om de detectie van individuele foto-switching-events te maximaliseren, waardoor we 2,5 nm gemiddelde lokalisatie precisie kunnen bereiken. De hoge precisie komt echter ten koste van de tijd, waardoor er ongeveer 3 uur nodig is voor elke ronde madSTORM-beeldvorming zoals eerder besproken. Voor een snellere beeldverwerving bij een lagere lokalisatie precisie (5-10 nm) wordt een kortere belichtingstijd en een hogere EM-aanwinst aanbevolen ( bijv. 20 ms belichting, 300X EM gain, 17 MHz bij 16 bit, conversie versterking 3). Bovendien kan multi-color imaging ( bijv. Atto-488, Alexa-568, en Alexa-647 nm) worden uitgevoerd voor elke ronde van madSTORM imaging om de schaal van multiplexing te vergroten, zij het wiEen afname in de precisie van de uitlijning door chromatische aberratie.
We hebben met succes succesvol 25 ronden van madSTORM imaging uitgevoerd met dit protocol. Aangezien de gehele procedure wordt uitgevoerd met de deklaagkamer op de microscoopfase, is het belangrijk om de dekselkamer in dezelfde positie te bevestigen. Om dit te doen, gebruik de autofocus modus en monteer de kamer op de microscoopstadium met behulp van metalen klemmen. Als er sprake is van significante stadiumdrift, gebruik dan bekende posities van FND fiduciale markers om het celmonster opnieuw te centreren.
Gelijktijdige visualisatie van uitgelijste madSTORM beelden kan uitdagend zijn. Om tegelijkertijd 7 of minder madSTORM afbeeldingen te bekijken, gebruik Color / Merge kanalen in ImageJ om een pseudo-gekleurd composietbeeld te maken. Voor 8 of meer afbeeldingen is het raadzaam om de madSTORM-beelden in verschillende groepen te kategoriseren, voeg elke groep in een samengesteld beeld en voeg een enkele LUT-kleur toe op elk samengesteld beeld.
- vacature FND's worden verminderd met maximaal ~ 50% in situ door toepassing van een statisch magnetisch veld 23 . De afname in intensiteit is ongeveer lineair tot ~ 500 Gauss, waardoor de effecT verzadigd In de praktijk kan de intensiteit van diamanten in het gezichtsveld tot in de gewenste mate worden verlaagd door een permanente magneet dichter bij de microscoopschuif vanaf de bovenkant te brengen.
Tenslotte hebben we de elutiebuffer geoptimaliseerd voor het verwijderen van antilichamen die de moleculaire componenten van de T-cel microcluster richten. MadSTORM is niet beperkt tot TCR microclusters, aangezien microtubules, mitochondria, F-actine, Vimentin en andere moleculaire structuren zijn afgebeeld met behulp van deze techniek 10 . Voor antilichamen die andere cellulaire compartimenten richten, kunnen extra stappen nodig zijn om epitoopbinding te verstoren, zoals hogere temperatuur, lagere pH en langere incubatie van elueringsbuffer. Omgekeerd kan de elueringsbuffer zonder Tween-20 worden gebruikt om gevoelige membraanstructuren te targeten, waardoor verstoringen van niet-ionische interacties voorkomen worden. We voorzien in toekomstige experimenten dat de elutiebuffersamenstelling voor individuele antilichamen zal worden aangepast tO Optimaliseer elutie-efficiëntie en monsterbehoud. Bovendien kan, naast de toepassing in geactiveerde T-cellen, madSTORM haalbaar zijn met andere systemen, waaronder in vitro moleculaire complexen, verschillende celsoorten en weefselsecties. Verschillende parameters van het madSTORM protocol, zoals fixatie, permeabilisatie, antilichamen kleuring en elutie buffer samenstelling moeten worden aangepast voor elk doelgericht systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets om te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Xufeng Wu voor toegang tot de STORM-microscoop. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van het NCI-Centrum voor Kankeronderzoek en het National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
